组蛋白H2A。Z和DNA甲基化是相互拮抗的染色质标记

调查H2A。Z沉积在植物染色质中，我们生成了H2A的高分辨率全基因组图。Z在拟南芥中的应用体内我们用于亲和纯化果蝇染色质的生物素化系统²¹.我们标记了拟南芥H2A。Z具有一种被特异性识别的肽大肠杆菌生物素连接酶BirA（生物素连合酶识别肽，BLRP），并创建共表达BLRP-H2A的转基因植物。Z和BirA。细胞定位显示BLRP-H2A。Z具有弥散的核分布，但被排除在异色色心之外(补充图1)与内源性H2A的模式相同。Z轴¹⁷.用微球菌核酸酶消化后，大部分为单核小体(补充图1)，我们从根组织中纯化生物素化染色质，并将相关DNA与对照DNA在代表整个拟南芥基因组的贴片微阵列上进行联合杂交²²为了确保我们的结果不受潜在标记伪影的影响，我们用内源性H2A抗体重复了实验。Z轴¹⁷我们还绘制了根中的DNA甲基化图（我们之前已经发布了来自气生组织的数据集²²).

链霉亲和素下拉和免疫沉淀生成的图谱几乎相同(图1和补充图2).最显著的特征是与DNA甲基化强烈的定量反相关（Pearson’s第页= −0.81;补充表1-2).H2A的明显峰。基因5′端附近的Z也很明显(图1b).为了更好地可视化H2A。Z分布，我们将包括基因、假基因和转座元件在内的所有拟南芥注释序列在其5′端对齐，并将其从第1染色体顶部堆叠到第5染色体底部(图2a和补充图2).该路线的一个明显特征是高H2A的垂直条带。大致对应于转录开始后第一个核小体的Z。这种H2A模式。Z沉积与酵母和人类中的沉积一致^10–15表明这是真核基因的一个普遍特征。还有五条明显的低H2A水平条纹。Z公司。这些对应于五个拟南芥着丝粒周围富含转座子、高度甲基化的异染色质。这种结合模式正好与DNA甲基化模式相反(图2b和补充图2).

甲基化在基因组中分布不均匀。转座子甲基化程度高且均匀，而一些基因甲基化时间短，而大多数基因是非甲基化的^22–26这三组序列显示了H2A的相应三相分布。Z信号：低H2A。Z水平存在于转座子、甲基化基因的中间水平和非甲基化基因中(补充图3).一种可能性是H2A含量低。转座子中的Z是由内在序列偏好引起的，而不是DNA甲基化。为了测试这一点，我们检测了少量（49）未甲基化的拟南芥转座子(补充表3).很明显，所有这些转座子都具有高H2A。Z水平，表明H2A较低。Z合并本身不是转座子的特征(图1c和2c–d个).非甲基化转座子也缺乏任何可识别的H2A。Z峰值，表明这些是内源性基因的独特特征。无监督k个-表示基于H2A的拟南芥注释序列聚类。Z模式产生了三组与非甲基化基因、身体甲基化基因和转座子紧密对应的基因(图2e,补充图4和补充表4).同样是H2A。Z和DNA甲基化水平显示出显著的反相关(图2f).DNA甲基化和H2A。因此Z是相互排斥的染色质特征，我们的分析表明这种关系独立于序列上下文、转录或转录潜能(补充数据和补充图5-11).

到目前为止，我们的结果表明甲基化和H2A之间存在强烈的反相关。Z沉积，但我们无法区分哪个是因果关系。为了解决这个问题，我们利用了一个DNA甲基转移酶突变为零的株系MET1，金属1-6^4,27.中的突变MET1型导致整体DNA甲基化显著降低，但也会由其他甲基转移酶介导显著的超甲基化²⁶我们推断，如果DNA甲基化影响H2A。Z沉积，DNA甲基化的变化应通过H2A的变化反映出来。Z分布。值得注意的是，因为满足1导致DNA甲基化的损失和获得，我们应该看到H2A的获得和损失。为了验证我们的假设，我们绘制了H2A图。Z、 以及DNA甲基化和转录金属1-6植物。

DNA甲基化的变化确实引起了H2A的变化。Z分布(图3和补充图12-13).为了可视化这些变化，我们减去了野生型（WT）H2A。来自的Z数据集满足1H2A。Z数据集，因此高值表示H2A增加。Z公司成立于满足1(补充图12).信息位点示例如所示图3a-c. The鱼类和野生动物管理局该基因通常具有5′甲基化并且缺少H2A。Z峰，失去启动子甲基化，获得5′H2A。Z英寸满足1(图3a).反转录转座子在5g13205在WT中严重甲基化，但失去甲基化并获得H2A。Z英寸满足1(图3b).基因在1g22000编码F-box蛋白，在满足1导致其5′H2A损失。Z峰值(图3c).

全面了解H2A。Z动态输入金属1-6，我们对齐并排列了所有带注释的拟南芥序列，如图2a。在这个剖面上，同样明显的中心周围条纹也很明显(图3d和补充图13)–H2A。转座元件中的Z水平升高，它们失去了大部分甲基化，并在满足1^22,23数据的无偏分类产生了三个簇，分别大致包含非甲基化基因、甲基化基因和转座子(图3e,补充图13和补充表4，序列分类如下²²).H2A的变化。Z与获得H2A的DNA甲基化序列密切相关。Z英寸满足1在WT中甲基化(图3f和补充图13).相反，H2A降低的位点。Z掺入在WT中未甲基化，但在金属1-6(图3g).总的来说，DNA甲基化的变化反映在H2A的变化上。Z的方式强烈证明甲基化抑制H2A。Z公司。

因为一些转座子和基因在满足1植物²²，我们有机会测试H2A。Z掺入受甲基化负向影响或受转录正向影响。在基因内，WT和H2A中的DNA甲基化之间存在着强大的相关性。Z变化在金属1-6（平均皮尔逊第页= 0.51,补充表2)，但转录与H2A之间没有相关性。Z变化（皮尔逊平均值第页= 0.05).鱼类和野生动物管理局，在满足1，降低了H2A水平。Z在基因体中，在WT中没有甲基化(图3a).类似地，在少数野生型中没有甲基化的转座子中，有两个(见4g10690和在5g35205)然而，在满足1(补充图14).两者的H2A也较少。Z英寸满足1而在野生型中，与其他转座子相反。

因为只有大约一半的转座元件在满足1，我们可以问这些元素是否优先获得H2A。Z、 如H2A所预期。Z掺入与转录活性相关。为了确保数据集的大小和甲基化不是问题，我们比较了代表活化转座子的12500个探针和代表沉默转座子并具有相同甲基化谱的12500种探针。我们发现这两个转座子类在H2A中的富集程度相同。Z轴(图3h和补充图15).因此，DNA甲基化的改变，而不是转录，导致H2A的重新分布。我们观察到的Z满足1.

我们的结果表明，DNA甲基化排除了H2A。一个有趣的问题是H2A是否存在。Z也可以排除甲基化。我们的一些数据表明，情况确实如此。H2A最显著的特点。Z掺入，即5′基因峰，与DNA甲基化无关(图2e–f和补充图4、6)然而甲基化被强烈排除在这个区域之外^22,23同样，H2A越高。低转录基因体内的Z水平(补充数据和补充图6-7)这可能解释了令人费解的观察结果，即基因甲基化的几率随着转录的增加而增加（高达约70^第个百分位数）^22,23.

为了解决这个问题，我们绘制了植物中DNA甲基化的图谱项目1（Swr1的保守催化成分）破坏H2A的正常沉积。Z轴¹⁷。甲基化的总体模式图1-5植物仍与WT相似(补充表5)，但DNA甲基化有适度但持续的增加(补充图16).可视化甲基化变化第1张我们从中减去匹配WT对照（F2同胞）的甲基化模式pie1并将结果数据显示为热图(图4a和补充图16).该分析揭示了基因体的全基因组超甲基化。使用ChIPOTle算法²⁸，我们确定了1201个高甲基化区域（对应1172个基因）用于进一步分析（阈值p<10⁻⁷,补充表6).

在植物中，任何胞嘧啶都可能发生DNA甲基化⁵大多数甲基化是在对称的CG位点中发现的，就像在动物中一样，是由MET1介导的，但在其他序列环境中也有大量的甲基化被其他甲基转移酶催化（因此在满足1)^25,26。为了确定第1张突变在不同情况下影响DNA甲基化，我们使用亚硫酸氢盐测序分析了ChIPOTle评分为高甲基化的五个位点中单个胞嘧啶的甲基化：地址：1g69850（硝酸盐转运蛋白），地址：3G22340（类COPIA反转录转座子），收件人4g03480（含蛋白质的锚蛋白重复序列），收件人4g38190（纤维素合成酶）和地址：5g37450（一种蛋白激酶）。所有五个样本都显示CG甲基化适度但持续增加(图4b–c)，确认微阵列分析。WT或WT中的任何一个位点几乎没有非CG甲基化第1张（未显示数据）。有趣的是，所有基因座在WT中都有一些甲基化，所以我们在第1张可能主要是由于正常轻度甲基化位点的甲基化增加，而不是从头开始先前未甲基化位点的甲基化。

鉴于第1张突变时，我们问过甲基化位点是否代表整个基因组。正如所料，第1张高甲基化基因含有高水平的H2A。WT中的Z（即通常在非甲基化基因中发现的Z；图4d).它们通常也富含低转录基因，在30岁左右含量最高^第个转录百分位数(图4e).这种模式与正常的甲基化基因非常不同，甲基化基因在70岁左右最为普遍^第个百分位数(图4e)，也不同于非甲基化基因，后者富含低表达和高表达基因²².第1张然而，高甲基化基因确实与H2A的总体分布密切相关。Z轴(图4e).这些位点还包括49个富含H2A的转座子中的17个。Z和未甲基化的WT(补充表3、6)，10倍的过度代表（p=10⁻⁴，费希尔精确测试）。因此，DNA甲基化的首选靶序列（基因体和转座子）在第1张与WT中这些序列中存在的低水平DNA甲基化一致(图4b–c).高水平的H2A。在这些位点上发现的Z明显保护了它们不发生完全的DNA甲基化，这可能解释了所观察到的基因转录和DNA甲基化之间的关系²².

几十年来，甲基化如何沉默基因一直是一个棘手的问题。一个流行的模型是，与甲基化DNA结合的蛋白质通过招募组蛋白去乙酰化酶而产生沉默⁶然而，对小鼠进行的仔细的基因破坏研究表明，这些蛋白质不太可能完全解释甲基化诱导的抑制^29,30先前的研究已为H2A提供了强有力的证据。Z有助于提升推广人员的能力^16–19因此，排除H2A。Z代表了DNA甲基化导致基因沉默的一种新机制。H2A。反过来，Z掺入可能保护基因启动子免受DNA甲基化的影响，从而促进基因活性并防止沉默。假设DNA甲基化和H2A。Z都是古老的染色质成分，它们的相互作用可能在调节真核基因表达中起着重要的普遍作用。