分子细胞生物学。2010年6月；30(12): 3059–3070.
KLüppel-Like因子KLF10是昼夜节律钟和肝脏代谢之间的联系▿
,1 ,1 ,2 ,1 ,1 ,三 ,三 ,2 ,1和1中，*
法比安·吉劳蒙德
法国尼斯大学发育生物学与癌症研究所，法国尼斯F-06108，1明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所医学院生物化学和分子生物学系，邮编：55905，2法国里尔北部里尔大学，Inserm U1011，UDSL，法国里尔巴斯德学院，F-59019三
阿琳·格里切斯·卡西奥
法国尼斯大学发育生物学与癌症研究所，法国尼斯F-06108，1明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所医学院生物化学和分子生物学系，邮编：55905，2法国北部里尔大学，欧洲工商管理学院U1011，UDSL，里尔巴斯德研究所，F-59019，法国里尔三
马来亚南语Subramaniam
法国尼斯大学发育生物学与癌症研究所，法国尼斯F-06108，1明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所医学院生物化学和分子生物学系55905，2法国里尔北部里尔大学，Inserm U1011，UDSL，法国里尔巴斯德学院，F-59019三
索菲·布兰戈洛
法国尼斯大学发育生物学与癌症研究所，法国尼斯F-06108，1明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所医学院生物化学和分子生物学系，邮编：55905，2法国里尔北部里尔大学，Inserm U1011，UDSL，法国里尔巴斯德学院，F-59019三
布里吉塔·佩特里-Brünback
法国尼斯大学发育生物学与癌症研究所，法国尼斯F-06108，1明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所医学院生物化学和分子生物学系，邮编：55905，2法国北部里尔大学，欧洲工商管理学院U1011，UDSL，里尔巴斯德研究所，F-59019，法国里尔三
巴特·斯塔尔斯
法国尼斯大学发育生物学与癌症研究所，法国尼斯F-06108，1明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所医学院生物化学和分子生物学系，邮编：55905，2法国里尔北部里尔大学，Inserm U1011，UDSL，法国里尔巴斯德学院，F-59019三
凯瑟琳·菲维
法国尼斯大学发育生物学与癌症研究所，法国尼斯F-06108，1明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所医学院生物化学和分子生物学系，邮编：55905，2法国里尔北部里尔大学，Inserm U1011，UDSL，法国里尔巴斯德学院，F-59019三
托马斯·斯佩斯伯格
法国尼斯大学发育生物学与癌症研究所，法国尼斯F-06108，1明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所医学院生物化学和分子生物学系，邮编：55905，2法国里尔北部里尔大学，Inserm U1011，UDSL，法国里尔巴斯德学院，F-59019三
弗兰克·德劳奈
法国尼斯大学发育生物学与癌症研究所，法国尼斯F-06108，1明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所医学院生物化学和分子生物学系，邮编：55905，2法国里尔北部里尔大学，Inserm U1011，UDSL，法国里尔巴斯德学院，F-59019三
米歇尔·特布尔
法国尼斯大学发育生物学与癌症研究所，法国尼斯F-06108，1明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所医学院生物化学和分子生物学系，邮编：55905，2法国北部里尔大学，欧洲工商管理学院U1011，UDSL，里尔巴斯德研究所，F-59019，法国里尔三
法国尼斯大学发育生物学与癌症研究所，法国尼斯F-06108，1明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所医学院生物化学和分子生物学系，邮编：55905，2法国北部里尔大学，欧洲工商管理学院U1011，UDSL，里尔巴斯德研究所，F-59019，法国里尔三
*通讯作者。通讯地址：法国尼斯塞德克斯2号，瓦尔罗斯大道28号，CNRS UMR 6543，尼斯索菲亚·安蒂波利斯大学发育生物学与癌症研究所，邮编：06108。电话：33（0）4 9207 6838。传真：33 4 9207 6834。电子邮件：rf.ecinu@mluobet 2009年8月21日收到；2009年10月7日修订；2010年4月1日验收。
摘要
昼夜节律计时系统与外部光/暗周期同步协调哺乳动物生理和行为的许多方面。这些节律是由大多数体细胞中存在的内源性分子钟驱动的。许多时钟输出是转录调节器，表明时钟基因主要通过间接途径控制生理。在这里，我们发现Krüppel样因子10（KLF10）在野生型小鼠肝脏中表现出强大的昼夜节律表达模式，但在时钟缺陷中没有表现出Bmal1型击倒老鼠。一直以来Klf10公司启动子招募BMAL1核心时钟蛋白，并通过保守的E-box反应元件被clock-BMAL1异二聚体反式激活。分析肝脏转录组Klf10公司−/−小鼠鉴定出158个调节基因，这些基因显著富集了参与脂质和碳水化合物代谢的转录物。重要的是，大约56%的代谢基因是由时钟控制的。男性Klf10公司−/−小鼠出现餐后和空腹高血糖，这是一种伴有糖异生基因显著上调的表型佩普克增加肝脏葡萄糖生成。一直以来，功能数据显示佩普克启动子被KLF10直接抑制。Klf10公司−/−女性血糖正常，但血浆甘油三酯水平较高。相应地，脂肪生成途径成分的节律性基因表达，包括Srebp1c公司,Fas公司、和埃洛夫l6，在女性中发生改变。总之，这些数据确定KLF10是一种必需的昼夜节律转录调节因子，它将分子时钟与肝脏中的能量代谢联系起来。
在哺乳动物（包括人类）中，行为和生理学的许多方面都表现出每日振荡。睡眠、进食行为、核心体温、激素分泌、脂类和碳水化合物代谢以及血压的24小时节律是有充分证据证明的例子。这些节律是由位于身体几乎所有细胞中的自我维持的内源性时钟驱动的，并形成一个完整的系统(44,48). 昼夜节律（～24小时）系统是分层组织的，在顶部，主时钟位于下丘脑视交叉上核（SCN），在没有外部时间线索的情况下以大约24小时的周期振荡。每天，这个中央时钟通过视网膜下丘脑束被光重置，以保持生理与外部光/暗（LD）循环同步。存在于外围的昼夜节律时钟通过尚未确定的内部同步器被SCN吸引，尽管它们在单细胞水平上显示出自持振荡，但在器官和系统水平上需要一个完整的SCN时钟保持同步(63). 正向遗传学和生物化学方法已经确定了一组核心时钟基因，这些基因通过复杂的正反馈和负反馈回路相互作用，形成一个产生～24小时振荡的分子时钟(29). 在这一机制中，两种bHLH-PAS转录激活物CLOCK（或某些外周组织和外周组织中的NPAS2）和BMAL1异源二聚体化并反式激活每1个,每2个,哭泣1、和哭泣2基因通过与位于其启动子中的E-box DNA响应元件结合。然后PER和CRY蛋白通过抑制CLOCK-BMAL1依赖的转录活性，结合并转移到细胞核以抑制自身基因(50). 该核心反馈回路是广泛且日益复杂的翻译后控制的主题，通过该控制，振荡被严格维持并调节至～24小时的周期长度(12). 值得注意的是，PER1和PER2被酪蛋白激酶亚型CKIɛ和CKIδ磷酸化，导致泛素连接酶适配器F-box蛋白bTrCP的随后补充，随后蛋白酶体降解。其他CKI底物包括CRY和BMAL1蛋白，而CRY1和CRY2的降解似乎通过F-box蛋白FBXL3进行调节，BMAL1的降解依赖于SUMO化(9,13). 此外，BMAL1的昼夜节律功能需要其异二聚体伴侣CLOCK的乙酰化，这种反应被NAD的作用逆转+-依赖性脱乙酰酶SIRT1(1,22). 最近还发现了基于Rev-erb、ROR、PPAR和Dec家族转录因子的其他稳定环(29,56). 这种分子时钟机制最终以高度组织特异性的方式在多个时钟控制基因（CCG）的基因转录中产生振荡，从而为调节特定的生理输出提供时间信息。
新出现的证据表明，昼夜节律时钟系统与代谢稳态之间存在密切联系。流行病学研究表明，倒班工人比白班工人更容易出现甘油三酯和高密度脂蛋白胆固醇水平升高和肥胖(27). 重要的是，心血管疾病的发病率在一天中的特定时间似乎更高(4,18)。时钟突变小鼠表现出脂肪细胞肥大、血脂异常和肝脏脂肪变性，这是代谢综合征的特征(57). 同样，携带无突变基因的小鼠Bmal1型另一个关键时钟基因显示葡萄糖耐量降低和脂肪量增加(32,49). 相反，喂食高脂肪食物的动物下丘脑和外周的时钟和时钟控制的基因表达模式发生改变，运动活动和光反应的节律受到干扰(30,38)。
分析肝脏中昼夜节律基因和蛋白质表达的全基因组方法表明，多达15%至20%的转录组和蛋白质组处于昼夜节制之下(39,43,47,59). 值得注意的是，许多转录调节器是由时钟控制的，这表明昼夜遗传网络的很大一部分间接或不完全受核心时钟机制的调节。三种PARbZIP转录因子DBP、HLF和TEF调节肝脏中外源性代谢酶的昼夜表达(11). 几种肝脏特异性mRNA的昼夜节律振荡也由DEC1控制(16). 许多核受体也被认为是生物钟和生理输出之间分子联系的候选者(62). 同样，PGC-1是调节能量代谢的关键核受体辅活化因子，最近被证明是控制体温、代谢率和能量代谢相关基因表达节奏的时钟靶点(35). KLüppel-like转录因子（KLFs）是另一类调节因子家族，与关键的生物过程有关，包括细胞分化和增殖、凋亡和葡萄糖代谢，但不参与昼夜生理学(45). 这里，我们展示了一个成员，KLF10(10)（也称为Tieg1），以前被证明是骨骼生理学的调节器(46,53)是一种昼夜节律控制的转录因子，调节肝脏中的糖脂代谢基因。
材料和方法
动物。
时钟不足Bmal1型−/−C57BL/6J背景的小鼠（由威斯康星州麦迪逊市威斯康星大学C.A.Bradfield善意提供）在8至12周龄时，在它们发生关节病之前使用(5,6)。Klf10公司−/−将小鼠回交10代至C57BL/6j背景。将杂合动物进行杂交，产生敲除和野生型同窝交配。我们注意到，在广泛回交到C57BL/6j背景后，雌性和雄性Klf10公司−/−与野生型同窝动物相比，所有年龄段的动物都减轻了体重(http://www.unice.fr/ibdc/pub/Guillaumond.MCB2010.supp/index.htm)（方差分析[ANOVA]，P（P）< 0.001). 这些动物被安置在温度和湿度可控的环境中，处于12小时光照/12小时黑暗周期（光照/暗照，12:12）中，并喂食随意Zeitgeber time zero（ZT0）表示灯亮。在恒暗实验中，在昼夜节律时间零点（CT0）关闭灯24小时。在禁食/再喂食实验中，6个月大的小鼠被随机分为三组，分别在禁食后喂食、禁食或再喂食。研究开始前，受试组禁食28小时，然后在24小时内吃含72.2%碳水化合物热量的高碳水化合物/低脂饮食（安全）。实验开始时间错开，以便在ZT4处死所有小鼠。所有实验均按照CNRS动物伦理准则进行。
质粒构建和共转染分析。
为了构建KLF10表达载体，用引物5′-GGATCCCCAACTTCGGCTTTC-3′（正向）和5′-ATTCTGCGTCCCCATCTCTCTG-3′（反向）逆转录小鼠肝脏总RNA并进行PCR扩增，将所得片段克隆到pcDNA 3.0表达载体（Invitrogen）中。pcDNA3-CLOCK、pcDNA3-BMAL1和pcDNA-CRY1表达载体已在前面描述(16). 包含近端小鼠−558至+46（相对于转录起始位点）区域的基因组片段Klf10公司用引物5′-GGTTCCATCCCCTTGCTTC-3′（正向）和5′-GCACTGAGACACTAGACGTCGG-3′（反向）扩增启动子，并克隆到pGL3-Basic载体（Promega）中，以创建Klf10prom公司：：Luc报告器构造。删除的3′-Klf10公司启动子结构Klf10公司Δ233/521：：Luc是通过PCR扩增从−558延伸到−332的启动子序列获得的Klf10prom公司：：带有上述正向引物和反向引物5′-CAAGCTCTCGCCGC-3′的Luc载体。然后将PCR产物插入近端−42至+46区域的上游Klf10公司发起人。这个Klf10（E）3x型：：Luc和Klf10（埃穆特）3x：：Luc reporter构造包含野生型或变异型的三个副本Klf10公司分别插入含有pGL2报告质粒的TATA盒上游的E-box元件。这两个报告结构是通过对以下磷酸化寡核苷酸进行退火而得到的：野生型的5′-GATCTCCACCCCCCCCCACGACGGGCGCGCTCCG-3′（正向）和5′-GACCGGAGCCCCCCCCACGTGGGGGGTGGA-3′（反向），以及5′-GTACTCCCCCCGCCCGTATTGGCTCCG3′（向前）和5用于变异的E盒。跨越小鼠−622至+7区域的合成DNA片段（Epoch Biolabs）佩普克牌手表将启动子插入pGL3basic的KpnI-XhoI位点以生成佩普克：：Luc报告向量。5′和内部启动子缺失结构佩普克Δ253：：Luc，佩普克Δ42/325：：Luc，佩普克Δ514：勒克，以及佩普克Δ282/514：：Luc是通过消化佩普克：：带有KpnI和NdeI、PstI、KpnI、StuI或StuI的Luc矢量，然后在必要时使用Klenow填充并重新定位。所有结构均通过测序进行验证。使用脂质内酰胺2000（Invitrogen）将NIH 3T3和HepG2细胞与报告载体（20 ng）和表达载体（1至100 ng）共转染6 h。将细胞在新鲜培养基中培养48小时，并使用Bright-glo荧光素酶分析试剂（Promega）和Centro LB960光度计（Berthold）测定荧光素酶活性。荧光素酶活性归一化为总蛋白浓度。所有转染实验均一式三份，并至少重复三次。
染色质免疫沉淀（ChIP）分析。
肝脏样品在ZT12处采集，与1%甲醛交联10分钟，在SDS裂解缓冲液中裂解，并通过超声破碎。然后用抗BMAL1（ab3350；Abcam）-或抗KLF10沉淀染色质(53)-特异性抗体。使用以下引物通过PCR扩增免疫沉淀染色质样品：Klf10公司，5′-AGTGTTCATCCATCCCTTG-3′（正向）和5′-CGACTAGGCTTTGCGGA-3′（反向）；佩普克，5′-CAACAGGCAGGGTCAAGTT-3′（正向）和5′-GCACGGTGTGAACTGACTGCT-3′（反向）。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上分离，并用溴化乙锭染色。
肝细胞核分离和Western blot分析。
根据Gorski等人描述的程序，从3或4只小鼠肝脏（4-6 g）中纯化肝细胞核(14)除了脱脂牛奶（20%）和蛋白酶抑制剂混合物（Sigma）包含在均化缓冲液中之外。蛋白质浓度用Bradford法测定。使用标准免疫印迹程序和稀释度为1:333的兔抗KLF10多克隆抗体（Eurogentec）在80μg肝细胞核提取物中检测到KLF10。通过用针对大鼠层粘连蛋白a/C（sc-7293；Santa Cruz Biotechnology Inc.）的单克隆抗体探测细胞膜来控制等负荷，层粘连是一种核包膜蛋白，其表达不受生物钟调节。
微阵列分析。
10周龄野生型和Klf10公司−/−在ZT15取下雄性小鼠，使用每个基因型三个肝脏组成的三个池，用核糖体RNA L试剂盒（Macherey-Nagel）分离总RNA。根据制造商的建议，在生物治疗研究所（法国蒙彼利埃）的基因组核心设施进行cDNA合成、cRNA生物素标记和基因芯片小鼠基因组430A 2.0阵列（Affymetrix）杂交。使用ChipInspert软件（Genomatix）进行数据分析，该软件使用单探针而不是传统的探针集方法。使用1%的错误发现率、3的探针覆盖率和1.5倍的最小变化来鉴定差异表达的转录物。使用Bibliosphere软件（Genomatix）使用基因本体（GO）术语进行功能分类。
细胞培养。
NIH 3T3和HepG2细胞来自ATCC，并在标准条件下生长。原代肝细胞由就地使用纯化Liberase的灌注程序（Roche Diagnostics）。细胞在2.5×10的条件下进行培养4细胞/厘米2在37°C、5%CO、添加10%（vol/vol）胎牛血清、100 IU青霉素、100 mg/ml链霉素和20 nM牛胰岛素的William’s E培养基中的胶原涂层35-mm培养皿中2细胞附着后，在不含胎牛血清的情况下更新培养基，并补充10 nM地塞米松和20 nM胰岛素。为了测试葡萄糖的影响，将细胞在低（5.5 mM）或高（25 mM）葡萄糖Dulbecco改良Eagle’s培养基（DMEM）中培养24 h。在添加16 mM乳酸和4 mM丙酮酸的无葡萄糖DMEM中培养肝细胞2和24 h后，测量葡萄糖生成。通过GOD-POD比色法（Sclavo Diagnostics International）测定培养基中的葡萄糖释放，并将其归一化为蛋白质浓度。
代谢参数。
在ZT0取下食物，在ZT4采集血样，以获得餐后值。从逆行静脉丛采集血样，以3000 rpm离心20 min分离血清或血浆。使用Accu-Check血糖仪测定血糖（法国罗氏诊断公司）。血浆d日-使用商用试剂盒（R-Biopharm）测定3-羟基丁酸浓度。总胆固醇、甘油三酯和游离脂肪酸的浓度是使用商用试剂通过酶分析测定的。通过淀粉糖苷酶法（GAHK-20；Sigma）测定肝糖原，以测量葡萄糖释放。使用Linco Research的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒测定血清胰岛素浓度。
统计分析。
使用Sigma Plot软件通过Cosinor方法评估昼夜节律。野生型和野生型体重曲线的差异Klf10公司−/−采用双向方差分析（ANOVA）对小鼠进行测试。学生的t吨该测试用于评估实验组之间的差异，并对野生型和Klf10公司−/−各实验组小鼠。A类P（P）<0.05的值被认为是显著的。所有数据均以平均值加上平均值的标准误差（SEM）的形式报告。
结果
Klf10公司是一个时钟控制的基因。
对外周组织中昼夜节律基因表达的全基因组分析已将多个转录调节器确定为时钟目标，表明将时钟基因与节律生理输出联系起来的间接机制可能是调节组织特异性节律转录网络的一种常见策略。类Krüppel转录因子家族的几个成员，包括九氟化钾,Klf10公司、和Klf13型在肝脏中进行的基因表达谱分析实验中，被确定为推测的时钟调节基因(15,43,58). 我们在这里独立报道Klf10公司（也称为第1级)在小鼠肝脏中显示出稳健的节律基因表达模式，分别在ZT12和ZT20处出现峰值和谷值（图。A）(http://www.unice.fr/ibdc/pub/Guillaumond.MCB2010.supp/index.htm). 在长骨、肾脏和骨骼肌中也观察到类似的轮廓，但振幅较低，但在附睾脂肪组织和心脏中没有观察到（图。). 的阶段Klf10公司与肝脏相比，骨骼、肾脏和骨骼肌明显提前(http://www.unice.fr/ibdc/pub/Guillaumond.MCB2010.supp/index.htm). 使用高纯度的肝细胞核，我们观察到ZT16的KLF10蛋白表达显著高于ZT4，这与mRNA的振荡一致（图。). 为了确定这种振荡是否由内生时钟控制，我们首先分析了Klf10公司在持续黑暗条件下，小鼠肝脏中的mRNA表达。的高振幅振荡Klf10公司在这些条件下观察到mRNA，如在LD循环中（图。)(http://www.unice.fr/ibdc/pub/Guillaumond.MCB2010.supp/index.htm). 接下来，我们分析了肝脏中Klf10公司和时钟基因Bmal1型和哭泣1，分别编码分子钟正负极的核心成分。结果表明：Bmal1型最大表达水平出现在Klf10型mRNA，而哭泣1当Klf10 mRNA下降时，表达增加，与模型一致Klf10公司转录将由核心时钟蛋白直接调节（图。)(http://www.unice.fr/ibdc/pub/Guillaumond.MCB2010.supp/index.htm). 为了进一步测试基因是否Klf10公司受分子钟控制，我们分析了其在肝脏中的表达Bmal1型敲除小鼠，一种表现出昼夜节律系统深刻改变的时钟缺陷模型(6). 的表达式Klf10公司男性和女性的心律失常都显著减少Bmal1型将基因敲除小鼠与其野生型同窝小鼠进行比较，表明BMAL1是Klf10公司表达式（图。)(http://www.unice.fr/ibdc/pub/Guillaumond.MCB2010.supp/index.htm). 有趣的是，Klf11公司（也称为第2级)，aKlf10公司paralog也被发现受肾脏和附睾脂肪组织中的昼夜节律时钟调节（图。)(http://www.unice.fr/ibdc/pub/Guillaumond.MCB2010.supp/index.htm). 根据这些基因表达数据，我们在小鼠体内鉴定了一个保守的E-box反应元件Klf10公司启动程序（图。)。体内ChIP实验表明，BMAL1与Klf10公司含有该位点的启动子（图。). 在共转染实验中，CLOCK-BMAL1异二聚体显著刺激了由含有该元件的604-bp启动子片段驱动的荧光素酶报告子构建（图。). 正如预期的那样Klf10公司启动子可被CRY1完全拮抗，CRY1是昼夜节律机制中核心环路的强阻遏物。值得注意的是，KLF10本身能够抑制其自身启动子的CLOCK-BMAL1依赖性激活，但不能抑制基础活性。然而，这种效应并不是通过Klf10公司E-box元件，作为288-bp 3′缺失，保持元件完整，仍对CLOCK-BMAL1作出响应，但对KLF10没有响应（图。). 这与删除区域内富含GC元素的存在一致，因为这种类型的序列先前已被证明可被KLF10识别(25). 这个Klf10公司在荧光素酶报告子前克隆的E-box元件由最小启动子驱动，足以对CLOCK-BMAL1异二聚体产生反应，即使存在KLF10，正如缺失实验所预期的那样（图。). 相反，相同元素的突变版本没有发现转录激活（图。)。
Klf10公司是一个时钟控制的基因。（A）Klf10公司野生型雄性小鼠肝脏、长骨、肾脏、骨骼肌、心脏和附睾白色脂肪组织（WAT）中的mRNA表达被带入LD 12:12周期。（B） KLF10蛋白在ZT4和ZT16处的表达。拉明A/C被用作等负荷控制。（C）Klf10公司野生型雄性动物肝脏中的mRNA表达一直处于黑暗中。（D） 的表达式Bmal1型（左）和哭泣1（右）野生型雄性小鼠的肝脏。（E） 的表达式Klf10公司来自野生型和Bmal1型−/−雄性（左）和雌性（右）小鼠。（F）Klf11公司野生型和非野生型肾脏中mRNA的表达Bmal1型−/−小鼠和野生型小鼠附睾WAT。在面板A、D、E和F中，白色和黑色条分别表示亮相和暗相，而在面板C中，灰色和黑色条则分别表示主观的白天和夜晚。表达数据被归一化为组成表达36个B4mRNA。所有数据均以平均值加上每个时间点3至6只动物的扫描电镜显示。（G） 的示意图Klf10公司启动子显示保守E-box序列和GC盒的位置。（H） ChIP分析显示BMAL1被招募到Klf10公司包含保守E盒的启动子区域。显示了在ZT12分析的三只不同雄性小鼠。（I） 用荧光素酶报告基因构建体共转染NIH 3T3细胞，该构建体由来自Klf10公司启动子或内部删除的启动子(Klf10公司Δ233/521)保存E盒，缺少近端GC盒（−187）和CLOCK、BMAL1、CRY1和KLF10表达载体。这个每1（E）3X：：Luc报告结构被用作CLOCK-BMAL1反应的阳性对照。（J） 野生型或突变型荧光素酶报告子构建物与NIH 3T3细胞共转染Klf10公司E-box序列和CLOCK、BMAL1和KLF10表达载体。*，与具有空向量的情况显著不同（学生的t吨测试或方差分析，然后进行事后测试；P（P）< 0.05). 所有数据均以平均值加SEM的形式显示，用于3到9个独立实验，一式三份。
综上所述，这些基因表达和生物化学数据表明，转录调控因子KLF10是一个直接的昼夜节律靶点，并提示了KLF10负调控自身转录的机制。
的代谢概况Klf10公司−/−老鼠。
为了扩展我们对KLF10缺陷小鼠模型的分析，我们比较了6个月龄野生型和敲除型动物的餐后血液代谢参数值。结果表明：Klf10公司−/−雄性小鼠的血糖水平比野生型动物高约20%（表)。Klf10公司−/−雌性小鼠血糖正常，但与同窝的野生型小鼠相比，血浆甘油三酯增加了20%（表). 突变动物的胰岛素、游离脂肪酸和总胆固醇没有显著变化。这些数据表明，KLF10的缺失导致了离散的和性别特异的代谢异常，表明KLF10在代谢稳态中具有调节作用。
表1。
野生型和非野生型的血液代谢参数Klf10公司−/−老鼠
| 参数 | 价值一
|
|---|
男性
| 雌性
|
|---|
| 野生型 | Klf10公司−/− | 野生型 | Klf10公司−/− |
|---|
| 葡萄糖（毫摩尔/升） | 6.82 ± 0.43 (n个= 6) | 8.09 ± 0.39* (n个= 8) | 7.07 ± 0.24 (n个= 8) | 7.54 ± 0.61 (n个= 7) |
| 胰岛素（ng/ml） | 0.99 ± 0.11 (n个= 8) | 1.09 ± 0.21 (n个= 5) | 0.80 ± 0.08 (n个= 4) | 0.82±0.11(n个= 5) |
| 总胆固醇（mmol/l） | 1.98 ± 0.11 (n个= 6) | 1.90±0.23(n个= 6) | 2.01 ± 0.07 (n个= 6) | 2.03 ± 0.13 (n个= 6) |
| 甘油三酯（mmol/l） | 1.24 ± 0.07 (n个= 6) | 1.17 ± 0.09 (n个= 6) | 0.95 ± 0.04 (n个= 6) | 1.15 ± 0.07* (n个= 6) |
| 游离脂肪酸（mmol/l） | 1.49 ± 0.07 (n个= 6) | 1.50 ± 0.19 (n个= 6) | 1.28±0.06(n个= 6) | 1.29 ± 0.22 (n个= 6) |
肝葡萄糖生成和佩普克KLF10抑制雄性小鼠的基因启动子活性。
餐后血糖升高Klf10公司−/−雄性小鼠促使我们检查这些动物的禁食反应。禁食28小时后，无论基因型如何，男性和女性的血糖都显著下降（图。A） ●●●●。然而，禁食组的血糖水平仍显著升高Klf10公司−/−雄性动物比野生型动物多，而雌性动物的基因型之间没有差异。β-羟基丁酸的测定表明，禁食的生酮反应在Klf10公司−/−雄性（图。)和雌性（未显示）。同样，佩普克在禁食后同样诱发Klf10公司−/−和野生型雄性（图。)和雌性（未显示）。佩普克在野生型雄性小鼠中，mRNA表达表现出强烈的振荡，在ZT12处达到峰值（图。，右侧）(http://www.unice.fr/ibdc/pub/Guillaumond.MCB2010.supp/index.htm). 与图中所示的结果一致。，我们观察到在喂食组的ZT8至ZT16表达较高，而在ZT0表达较低Klf10公司−/−雄性小鼠，导致突变动物的振荡幅度增加2.1倍（3.08±0.39对1.46±0.28）（图。，右侧）(http://www.unice.fr/ibdc/pub/Guillaumond.MCB2010.supp/index.htm)。Bmal1型−/−雄性小鼠出现心律失常，表明BMAL1调节佩普克直接或通过KLF10以外的其他因素。与雄性相比，野生型雌性的佩普克振荡。然而，与男性一样，我们观察到一种依赖于时间的上调佩普克导致振荡幅度增加。未发现明显的昼夜节律Bmal1型−/−雌性（图。)(http://www.unice.fr/ibdc/pub/Guillaumond.MCB2010.supp/index.htm). 这些观察强烈表明佩普克该基因可能是KLF10的直接靶点。为了测试这种可能性，近端622-bp小鼠的反应佩普克在HepG2细胞的共转染实验中分析了KLF10的启动子片段及其缺失的衍生物。结果表明，KLF10对野生型启动子进行了抑制，删除了最多5′325 bp的启动子后，该抑制活性得以保留(佩普克Δ253：：Luc和佩普克Δ42/325：：Luc构造）（图。). 然而，当5′缺失延伸至514 bp时(佩普克牌手表Δ514：：Luc construct）或删除232-bp内部片段时(佩普克Δ282/514：：Luc构建体），没有观察到抑制，表明含有核苷酸−297至−108的区域介导KLF10依赖性抑制佩普克基因。在对佩普克启动子，我们鉴定了两个潜在的KLF10结合位点，它们包含类似Sp1结合序列的GC-rich序列。类似的GC-rich序列以前被确定为KLF10的潜在结合位点(25)。体内ChIP分析证实了这些转染数据，表明KLF10在肝脏中被佩普克包含这些位点的启动子区域（图。)。
直接监管佩普克启动子和增加葡萄糖产量Klf10公司−/−雄性小鼠。（A） 野生型（WT）禁食28小时前后的血糖（雄性和雌性）和β-羟丁酸（雄性）水平Klf10公司−/−老鼠(n个=每组5至14只动物）。（B）佩普克喂食和禁食体重的表达Klf10公司−/−雄性小鼠(n个=每组5或6只小鼠）。（A和B）*，与喂食组显著不同(P（P）< 0.05; 学生的t吨测试）；§，与WT组显著不同(P（P）< 0.05; 学生的t吨测试）。（C） 的表达式配置文件佩普克在雄性和雌性WT的肝脏中，Klf10公司−/−、和Bmal1型−/−老鼠(n个=每个时间点3至8只小鼠）。白色和黑色条分别表示亮相和暗相。在面板B和C中，表达数据被标准化为组成型表达36个B4mRNA。（D） 通过622-bp小鼠驱动荧光素酶报告子构建物共转染HepG2细胞佩普克启动子片段或缺失的启动子片段和KLF10表达载体。*，与空向量（学生的t吨测试；P（P）< 0.05). 所有数据均以平均值加上重复进行的4个独立实验的SEM表示。（E） KLF10与鼠标GC盒的绑定佩普克发起人。ChIP分析显示KLF10招募至佩普克含有假定KLF10结合位点的启动子区；显示了三只不同雄性小鼠的数据。（F） WT和Klf10公司−/−雄性和雌性动物的原代肝细胞(n个=每组2或3只动物）。*，与2-h值显著不同(P（P）< 0.05; 学生的t吨测试）；§，与WT值显著不同(P（P）< 0.05; 学生的t吨测试）。（G）Klf10公司在低（5.5 mM）或高（25 mM）葡萄糖培养基中孵育24小时的雄性和雌性原代肝细胞中的mRNA水平(n个=每组2或3只动物）。*，与低葡萄糖处理的细胞显著不同（Student’st吨测试；P（P）< 0.05). 在面板G中，Klf10公司表达被标准化为组成性表达36个B4mRNA。所有数据均显示为平均值加SEM。
为了进一步确定男性特异性高血糖是肝源性还是肝外性，我们比较了野生型和非野生型原代肝细胞的葡萄糖生成水平Klf10公司−/−鼠标在在体外化验。结果表明，在丙酮酸存在下培养24小时后，Klf10公司−/−雄性小鼠的肝细胞产生的葡萄糖明显高于野生型对照组，而两种基因型的雌性小鼠之间没有观察到差异（图。). 这些结果共同表明，KLF10的缺失与佩普克和男性葡萄糖输出增加。尽管雌性在分子水平上表现出类似的表型，但在缺乏KLF10的情况下，它们很可能通过一种代偿机制（如增加脂肪生成）维持葡萄糖稳态。由于反馈调节是代谢稳态的一个重要机制，我们还研究了葡萄糖是否能够调节Klf10公司肝脏中的表达。Klf10公司在低血糖或高糖环境下生长的原代肝细胞中，随着时间的推移，监测mRNA的表达。结果表明：Klf10公司在暴露于高（25 mM）葡萄糖的细胞中瞬时诱导高达4-5倍，2小时后达到最大值，然后在24小时后恢复到基础水平，而不考虑供体动物的性别。与之前在成纤维细胞中的观察相比，低（5.5 mM）葡萄糖没有影响(23)（图。). 这些数据表明Klf10公司是肝脏中的一个葡萄糖应答基因，与肝脏的负性自身调节一致Klf10公司启动子分析结果提示的基因（图。). 这些数据共同表明，KLF10整合了昼夜节律和代谢线索，并通过直接调节佩普克。
Klf10公司再喂养对表达有负调节作用。
微阵列数据表明，肝脏脂肪生成是一种在缺乏KLF10的情况下发生改变的代谢途径。此外Klf10公司−/−雌性小鼠的甘油三酯水平升高。因此，我们调查了Klf10公司−/−和野生型雌性小鼠使用低脂/高碳水化合物饮食，因为这种营养挑战已知会诱导脂肪生成。结果表明，控制脂肪生成和糖酵解的关键基因包括Acly公司,Fas公司,埃洛夫l6,Scd1号机组,Gpam公司,甲1、和L-Pk公司，均正常诱导于Klf10公司−/−动物（图。A） ●●●●。因此佩普克基因在Klf10公司−/−和野生动物。根据这些表达数据，在重新喂养时，两种基因型之间的肝糖原和血浆胰岛素水平没有显著差异（图。). 这些数据表明，正常的禁食/再喂养反应不需要KLF10。重要的是，分析Klf10公司禁食和重新喂食野生型动物的mRNA表达在重新喂食后下降了50%（图。). 这种效应表明Klf10公司是再喂食反应的一部分，与中的正常反应一致Klf10公司−/−动物。
中的快速再进给响应Klf10公司−/−雌性小鼠。（A） 禁食和参考WT中参与脂肪生成和糖代谢的KLF10-调节基因的肝脏mRNA表达Klf10公司−/−动物。（B） 肝糖原和血清胰岛素水平。（C）Klf10公司野生型小鼠的mRNA表达。在面板A、B和C中，野生型和Klf10公司−/−小鼠在禁食后28小时或高碳水化合物/低脂肪饮食再喂养24小时。数据显示为平均值加SEM(n个=每组5至9只小鼠）。*，值与禁食组值（学生的t吨测试；P（P）< 0.05). 在面板A和C中，表达数据被归一化为成分表达36个B4mRNA。（ATP柠檬酸裂解酶，Acly公司; 脂肪酸合成酶，Fas公司; 超长链脂肪酸的延伸，如6，埃洛夫l6; 硬脂酰辅酶A去饱和酶1，Scd公司; 甘油-3磷酸乙酰转移酶，Gpam公司; 苹果酸酶1，甲1; 丙酮酸激酶，L-Pk公司)。
讨论
类Krüppel因子形成一个高度相关的转录因子家族，参与关键的细胞过程，包括细胞增殖、凋亡和分化(26). 在本报告中，我们确定该家族的一个成员KLF10是哺乳动物肝脏中的昼夜节律时钟转录产物。KLF10最初被鉴定为人类成骨细胞中一种主要转化生长因子β（TGF-β）诱导的早期基因(54). 其功能被进一步描述为TGF-β在外分泌胰腺中的抗增殖作用的介质和骨细胞中的雌激素靶点(20,55). 我们也在这里报告Klf10公司肝脏中的基因表达受到葡萄糖的剧烈调节。这表明KLF10通过整合抗增殖、内分泌、代谢和昼夜节律信号，在细胞和生物体生物学中发挥着多效性作用。
直接监管Klf10型由昼夜节律时钟支持的是几个独立的证据，包括（i）在没有外部时间线索的情况下KLF10表达的24小时周期振荡，（ii）与核心时钟反馈成分的相位关系，这与直接调控机制一致，（iii）在缺乏必需的时钟转录因子BMAL1的情况下，节律性表达丧失，以及（iv）功能数据表明BMAL1蛋白和clock-BMAL1激活异二聚体的招募Klf10公司近端启动子。虽然分子钟在几乎所有类型的细胞中都起作用，但全基因组分析实验已经确定，哺乳动物昼夜节律基因表达的一个标志是组织特异性(43,52). 可以想象，这种控制可以通过特定组织的调节器实现，至少部分可以实现，例如Klf10公司，其昼夜节律表达仅限于外周器官/组织的子集，肝脏表现出最强烈的振荡。另一个例子是核受体PPARα，它是一种时钟控制的代谢传感器，主要表达在肝脏中，在肝脏中调节脂肪酸氧化(7,10). 有趣的是，KLF10和PPARα影响常见CCG的表达，这表明生理输出的时钟调节可能涉及几个组织特异性昼夜节律调节器的协同作用(28). 组织特异性阶段Klf10公司振荡是其外围昼夜节律调节的另一方面。虽然核心时钟网络驱动Klf10型在这些器官中的表达在性质上是相同的或非常相似的，例如，我们观察到的骨和肝之间的相位差异可能是由于时钟的组织特异性定量特性造成的。事实上，纵向分析器官昼夜节律钟功能的实验表明，这可能包括，例如，对内部同步器的反应性差异和/或组织特异性转录或转录后调节器的参与(63)。
我们进一步表明，KLF10控制肝脏中的特定代谢基因网络。值得注意的是，KLF10的缺失改变了参与脂肪生成、糖异生和糖酵解的基因的表达。这是首次证明Krüppel-like家族的一个成员在核心时钟基因和代谢产物之间起到分子联系的作用。初步数据表明，KLF11是一个密切相关的KLF10副序列，在胰岛素分泌和糖尿病中起重要作用，也可能在肾脏和附睾白色脂肪组织中起类似作用(40). 其他转录因子，包括核受体、基本螺旋-环-螺旋和bZIP/PAR蛋白，此前已被证明将核心时钟基因与特定的昼夜节律输出联系起来(11,16,17,60). 在各种分析实验中，还发现了时钟控制基因转录的许多其他假定昼夜节律调节器(2,39,42,43,52,58). 这些观察结果共同强化了这样一个概念，即哺乳动物时钟输出的转录调控中，即使不是大多数，也有很大一部分是间接的，正如果蝇属(37). 因此，我们的发现将昼夜节律转录因子的范围扩展到了KLF家族，并预测所有转录因子基因家族可能有一个或多个成员在特定器官中充当一级昼夜调节器。在我们的微阵列实验中，包括已知CCG在内的大多数KLF10调节基因被抑制，然而KLF10主要被称为转录阻遏物，因此可能间接调节这些基因。这种间接阳性调节不太可能涉及由KLF10控制的转录阻遏物，因为在数据集中没有发现这种因素。然而，最近的证据表明，KLF10也可以反式一些启动子，例如TGF-β1基因的启动子(8). 或者，KLF10可能作为转录调控复合体中的翻译后调节成分，导致靶基因的抑制或激活，正如最近在骨骼肌脂质代谢的背景下对KLF5所证明的那样(41). 最后，包括CCG在内的许多基因的表达也可能发生变化，作为对几个直接KLF10关键靶点上调的稳态反应。后一种可能性得到以下事实的支持：一小部分CCG，例如，包括，佩普克在野生型动物KLF10峰值对应的时间，突变体动物中上调。
KLF家族的其他几个成员也参与了代谢过程。然而，KLF10似乎在调节脂肪生成中起着重要作用，因为此途径中的许多基因的表达受到Klf10公司突变与女性Klf10型−/−小鼠的甘油三酯水平高于野生型小鼠。脂肪酸合成显示出强劲的日变化，在活性阶段达到峰值(21,33). 最近的工作使用时钟缺陷小鼠和时间限制喂养范式研究了喂食和昼夜节律时钟对肝脏节律基因表达的各自贡献，结果表明，食物诱导的转录物振荡，包括脂肪生成途径的转录物，由时钟调制和合并(59). 反过来，时钟及其直接下游目标的稳健性通过时间限制馈电而提高。KLF10本身并不是由喂食直接驱动的，但它是一个调节食物驱动的代谢基因表达的时钟目标，例如Srebp1c公司,Fas公司、和埃洛夫l6因此，我们建议，根据Vollmers等人的观察结果，KLF10的主要功能可能是暂时调节特定代谢途径成分（如脂肪生成）的每日食源性振荡(59). 相移效应Klf10公司棕榈酸长链酶编码基因表达模式的突变埃洛夫l6及其上游调节器Srebp1c公司在女性中支持这一假设。最近的观察表明埃洛夫l6小鼠体内的分裂导致肥胖和肝脂肪变性，这与我们的假设一致，即其节律表达失调Klf10公司−/−雌性小鼠可能会损害甘油三酯的体内平衡(36). 有趣的是，我们的数据表明，KLF10在代谢基因表达中的作用受到性别特异性效应的调节，这可能解释为什么只有女性表现出较高的甘油三酯水平。事实上，很明显，突变的效果是相反的(埃洛夫l6)或者更为有限(Srebp1c公司)在男性中，没有表现出这种表型。这种性别差异的影响已经在Klf10公司−/−该模型显示女性骨质减少，男性心脏肥大(三,19,46,53). The similarity of theKlf10公司男性和女性肝脏中的基因表达谱反对性类固醇对Klf10公司该器官的昼夜节律调节，更确切地说，性别特异的细胞环境调节KLF10活性。此外，Klf10公司被证明是骨中雌激素受体β的特异性靶点，而肝脏主要表达雌激素受体α亚型(20)。
我们的数据表明，KLF10和KLF15一样，是肝脏碳水化合物代谢的调节剂。KLF15缺陷小鼠在空腹时表现出严重的低血糖，这是因为肝糖异生所必需的氨基酸衍生底物的可用性降低(15). 相反，我们在这里显示Klf10公司−/−男性患有高血糖症。这种表型与糖异生酶编码基因的依赖于时间的上调有关佩普克在里面Klf10公司−/−喂食的动物随意，不分性别。从机制上讲，这种效应可以用近端的直接抑制来解释佩普克KLF10基因启动子，如本报告所示。这个佩普克上调与仅见于男性的肝葡萄糖生成增加相关，表明女性的血糖正常是通过一种可能与脂肪生成增加有关的代偿机制维持的。KLF10在肝脏中的一个作用可能是减弱佩普克喂食动物光照末期的基因随意为了预防慢性高血糖。沿着同样的路线Klf10公司这个表达还表明，它还参与了负反馈回路的调节佩普克表达式。这些观察结果共同表明，KLF10结合了昼夜节律和代谢线索来调节肝糖异生的关键基因，并且KLF10和KLF15在这一途径中发挥着不同的可能互补的作用。
值得注意的是，KLF10对于正常的禁食或再喂养反应是不必要的，甚至在高碳水化合物依赖性诱导肝脏脂肪生成时被抑制。我们认为，KLF10的一个作用是通过促进脂肪生成激活与喂食阶段的充分同步，以及调节休息阶段结束时的葡萄糖生成，来暂时协调肝脏代谢。因此，可以想象，当机体需要独立于一天的时间急性激活脂肪生成（禁食后再喂养）或糖异生（延长禁食）时，存在葡萄糖诱导的自身抑制等机制来抑制或克服KLF10介导的代谢昼夜节律门控。
越来越多的流行病学和实验证据表明，昼夜节律时钟系统的破坏有害于代谢内稳态，但其确切的潜在机制仍不清楚(27,30,51,57). 在这种情况下，脂肪生成和葡萄糖代谢关键基因的调控不当，如Klf10公司−/−小鼠可能是导致长期接触昼夜节律紊乱条件的个体代谢失衡的一个因素，例如轮班工人和乘务员。总之，我们已经确定了一种新的昼夜节律调节器，该调节器将时钟基因与肝脏代谢生理学联系起来。
致谢
这项工作得到了Nice-Sophia-Antipolis大学、国家科学研究中心、国家科学部、ARC拨款3729和1032，以及欧洲委员会拨款FP6 CRESCENDO LSHM-CT-2005-018652和TEMPO LSHG-CT-2006-037543和NIH拨款DE14036（T.C.S.和M.S.）的支持。F.G.是癌症康复协会的奖学金获得者。
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