Control of RSV-induced Lung Injury by Alternatively Activated Macrophages Is IL-4Rα-, TLR4-, and IFN-β-dependent

Kari Ann Shirey; Lioubov M. Pletneva; Adam C. Puche; Achsah D. Keegan; Gregory A. Prince; Jorge C.G. Blanco; Stefanie N. Vogel

doi:10.1038/mi.2010.6

粘膜免疫学。作者手稿；PMC 2010年11月1日提供。

以最终编辑形式发布为：

粘膜免疫学。2010年5月；3(3): 291–300.

2010年3月10日在线发布。数字对象标识：10.1038/mi.2010.6

预防性维修识别码：项目经理2875872

NIHMSID公司：美国国家卫生研究院184326

PMID：20404812

交替激活巨噬细胞对RSV诱导的肺损伤的控制依赖于IL-4Rα、TLR4-和IFN-β

Kari Ann Shirey,¹ Lioubov M.Pletneva先生,² 亚当·普切,^三阿克萨·D·基根,¹ 格雷戈里·普林斯,² 豪尔赫·C·G·布兰科,²和斯蒂芬妮·沃格尔¹

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关联数据

补充资料: 1
NIHMS184326-补充-01.pdf（240万）
GUID:C95292A0-FA7A-406B-8269-9C2A5B0B36B7

摘要

严重RSV诱导的细支气管炎与混合的“Th1”和“Th2”细胞因子风暴有关。我们假设，“交替激活”巨噬细胞（AA-M）的分化将介导RSV诱导的肺损伤的解决。RSV通过小鼠肺和腹腔巨噬细胞诱导IL-4和IL-13，IL-4Rα/STAT6依赖的AA-M分化，并显著增强IL-4R^−/−老鼠。野生型（WT）巨噬细胞向IL-4Rα的过继转移^−/−小鼠恢复了RSV诱导的AA-M表型并减轻了肺部病理学。RSV感染的TLR4^−/−和干扰素-β^−/−巨噬细胞和小鼠也未能表达AA-M标记物，但表现出持续的促炎细胞因子生成(例如，IL-12）在体外和体内和上皮损伤体内TLR4信号是PPARγ表达所必需的，PPARγ是一种DNA结合蛋白，可诱导AA-M基因，而IFN-β调节IL-4、IL-13、IL-4Rα和IL-10的表达，以应对RSV。感染RSV的大鼠经COX-2抑制剂治疗后，肺AA-Mб的表达增加。这些数据表明RSV的新治疗策略可以促进AA-M分化。

简介

呼吸道合胞病毒（RSV）是全球婴幼儿严重下呼吸道感染的最重要原因¹已被确定为导致老年人和免疫缺陷患者发病率和死亡率增加的原因。根据20世纪60年代中期失败的临床试验，长期以来人们一直怀疑一种病理性免疫机制，在这些试验中，接种福尔马林灭活（FI）呼吸道合胞病毒的婴儿在随后感染呼吸道合胞病毒时病情加重或死亡。²诱导“细胞因子风暴”是与严重RSV相关的炎症病理学的基础。^三

RSV首先感染气道上皮细胞，诱导由IFN-β和IFN-β诱导基因介导的抗病毒环境。⁴RSV刺激TLR4、TLR2和细胞内传感器、维甲酸诱导基因I（RIG-I）和TLR3，导致许多NF-κB依赖性促炎基因的诱导。^三^,⁵^–⁸呼吸道合胞病毒诱导的细胞因子和趋化因子募集并激活中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞和T细胞⁹除固定的肺巨噬细胞外，还产生促炎介质，如TNF-α和COX-2，这些介质有助于肺损伤和病理。¹⁰肺巨噬细胞耗竭体内显著抑制RSV的早期细胞因子反应。⁸^,¹¹

“经典激活”巨噬细胞（CA-Mí）对炎症刺激（如IFN-γ）和微生物刺激（如脂多糖（LPS）引起的TLR激活进行分化。CA-M杀死细胞内病原体并分泌炎症细胞因子，从而增强Th1免疫反应。CA-Mí也与许多炎症疾病中的病理学相关，并产生iNOS，这种酶可以产生一氧化氮（NO），从而损伤细胞。“交替激活”巨噬细胞（AA-M⁄）对Th2细胞因子、IL-4和IL-13产生分化反应，在功能和生化上与CA-Mб不同。AA-Mí产生精氨酸酶-1，与iNOS竞争精氨酸以产生L-鸟氨酸和尿素，而不是NO。¹²小鼠AA-M表达CA-Mб未表达的“标记物”，包括“发现于炎症区1”（FIZZ1）、Ym1、甘露糖受体（MR）等。¹³^,¹⁴巨噬细胞具有非凡的“可塑性”，可以根据变化的环境信号改变其分化状态。

虽然关于RSV应答的许多工作都集中在“Th1”或“Th2”适应性免疫应答是否介导疾病上，但令人惊讶的是，基本上没有关注RSV诱导的CA-M的分化与.AA-M，因为其细胞因子谱分别反映了Th1和Th2细胞的细胞因子谱。我们的数据支持这样的结论，即呼吸道合胞病毒诱导肺泡巨噬细胞产生IL-4和IL-13，通过IL-4Rα/STAT6-、TLR4-和IFN-β依赖性信号通路促进AA-M的分化和疾病解决在体外和体内因此，在RSV感染早期，在适应性免疫反应形成之前，形成的巨噬细胞介导的先天性“Th2样”反应可能代表宿主减轻肺损伤的初步尝试。此外，引发这种早期反应的能力可能决定RSV介导疾病的严重程度。

结果

RSV感染诱导AA-M

AA-M的分化需要IL-4和/或IL-13，即与强烈Th2反应相关的细胞因子。然而，土拉弗朗西斯菌在小鼠初级腹腔巨噬细胞和RAW 264.7巨噬细胞细胞系中诱导IL-4和IL-13，并发展为AA-M。¹⁵WT纯化小鼠支气管肺泡灌洗液（BAL）巨噬细胞的RSV感染(图1A)、初级腹腔巨噬细胞和RAW 264.7巨噬细胞(图S1A)还诱导IL-4和IL-13在体外RSV感染后4天（d）均质肺组织中IL-4和IL-13水平也显著升高(图S1B). 感染后第4天（p.i.），从模拟或RSV感染小鼠获得的BAL细胞富集巨噬细胞（见补充方法），并染色DAPI（核标记物）、F4/80（巨噬细胞标记物）和细胞内IL-4。在大多数单核F4/80中检测到细胞内IL-4⁺RSV感染小鼠的细胞(图S1C，e–h)而在模拟感染小鼠（a–d）的巨噬细胞中没有。

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图1

RSV感染诱导AA-M分化

（A）仅用培养基处理高纯度WT BALB/c BAL巨噬细胞培养物或感染RSV。在指定的时间点收集上清液，并通过ELISA分析IL-4和IL-13。（B）用单独培养基、rIL-4或RSV处理WT BALB/c BAL巨噬细胞。实时PCR分析基因表达。数据为单个代表性实验的平均值±SEM（N=4）。（C） WT C57BL/6小鼠被模拟或RSV感染，肺收获4 d p.i。冷冻肺切片染色，检测细胞核（DAPI；蓝色）、F4/80（绿色）和精氨酸酶-1（红色），然后通过共焦显微镜观察。箭头在治疗中的每个面板上的位置相同，以提供参考点。面板f–j中的箭头显示了一个罕见的F4/80阳性细胞，但精氨酸酶-1不阳性。

为了确定RSV感染是否也导致AA-Mí分化，纯化BAL巨噬细胞(图1B)或腹腔渗出巨噬细胞(图S2A)受到刺激在体外培养基、rIL-4或RSV感染。与rIL-4一样，RSV诱导AA-M标记的基因表达，例如、精氨酸酶-1、FIZZ1、MR(图1B)和Ym1（数据未显示）具有相似的动力学，而RSV诱导的促炎基因表达减弱。RSV感染小鼠的FACS分析(图S2B)还是棉鼠(图S2C)腹腔巨噬细胞显示精氨酸酶-1、FIZZ1和MR蛋白增加，与rIL-4诱导的结果相当。紫外线激活的RSV在两个物种中都未能诱导AA-MmRNA或蛋白。图S2E说明RSV诱导的精氨酸酶-1 mRNA水平与rIL-4诱导的水平相当，而UV-RSV诱导水平与培养基处理的小鼠巨噬细胞相似。图S2F通过FACS测量的精氨酸酶-1和FIZZ1蛋白表达证实了这一点。

体内，WT小鼠被模拟或RSV感染（10⁶PFU/小鼠鼻内注射（i.n.）并处死4d p.i。图1C（a–e）显示了包含模拟感染小鼠肺泡的典型肺切片。无单核（蓝色），F4/80⁺单元格(即，巨噬细胞；绿色）表达的精氨酸酶-1（红色）(图1C，a–e). 相反，RSV在大多数F4/80中诱导精氨酸酶-1的表达⁺巨噬细胞(图1C，f–j). 这一点在RSV感染的棉鼠BAL细胞中得到了证实，其中FIZZ1和精氨酸酶-1 mRNA均在4天内达到峰值(图S2D). 总之，这些数据表明间质和肺泡巨噬细胞在RSV感染期间都能够产生AA-M标记物。在WT和Rag2的肺中，精氨酸酶-1 mRNA的诱导作用相当^−/−小鼠4天p.i(图S3). 因此，RSV感染诱导T和B细胞依赖性分化AA-M在体外和体内此外，发现只有单核F4/80⁺细胞产生IL-4和精氨酸酶-1体内在感染小鼠的肺切片和BAL细胞中，强烈表明巨噬细胞而非其他潜在的IL-4来源(例如多形核嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞）是RSV早期反应中IL-4的主要来源。

呼吸道合胞病毒诱导AA-M的失败延长了促炎反应

IL-4和IL-13都利用IL-4Rα链¹⁶激活编码AA-M标记的基因的STAT6介导转录。¹⁷^–¹⁹WT BALB/c或IL-4Rα的巨噬细胞^−/−仅用培养基、rIL-4或RSV感染刺激小鼠，然后分析AA-M和CA-M的基因表达和蛋白质。精氨酸酶-1和FIZZ1 mRNA(图2A)和精氨酸酶-1蛋白(图S4在rIL-4或RSV感染的WT中，IL-4Rα的表达量相对增加^−/−巨噬细胞，尽管后者产生低水平的IL-4和IL-13（数据未显示）。相反，RSV感染IL-4Rα^−/−巨噬细胞（而非WT巨噬细胞）持续稳定表达IL-12 p40 mRNA(图2A和iNOS蛋白(图S4A)均与CA-M相关。RSV感染的IL-4Rα中COX-2和iNOS mRNA持续升高^−/−，但不是WT巨噬细胞(图S4B). IL-4Rα在肺中未检测到精氨酸酶-1mRNA，但IL-12 p40mRNA升高^−/−老鼠(图2B). STAT6获得了相同的结果^−/−巨噬细胞（数据未显示）。RSV感染的Rag2^−/−x IL-4Rα^−/−小鼠也不能产生精氨酸酶-1(图S3).

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图2

未能诱导AA-M延长CA-Mб表型

（A） WT BALB/c和IL-4Rα^−/−腹腔巨噬细胞被当作图1测定mRNA表达。数据来自单个代表性实验（N=3）。（B） WT和IL-4Rα^−/−小鼠被模拟或RSV感染。第4天处死小鼠，实时PCR检测肺中精氨酸酶-1和IL-12 p40 mRNA。（C） WT和IL-4Rα^−/−按照（B）中的方法处理小鼠。按照方法中的描述对肺部病理进行评分。结果由3个独立实验汇编而成。（D） WT和IL-4Rα^−/−小鼠被模拟或RSV感染。每天采集肺4天。对肺病理学进行评分（N=4；4只小鼠/治疗）。显示的图像为100倍。

小鼠RSV感染的其他研究使用的病毒比我们使用的多体内分析免疫缺陷小鼠菌株，以引出frank病理学；然而，我们只用了10个⁶PFU/小鼠，使我们能够确定缺乏已知的调节先天免疫反应的特定基因是否有助于RSV诱导病理的调节。在这些条件下，WT小鼠在RSV感染后表现出相对较低的炎症水平。RSV感染IL-4Rα的肺切片分析^−/−小鼠的病理学评分显著增加(图2C)每个组织学参数与RSV感染的WT小鼠进行比较，如相应的显微照片所示(图2D). 因此，IL-4Rα-STAT6信号轴是RSV诱导的AA-Mí分化所必需的，而AA-M⁄分化可以减轻病理。这不太可能是病毒清除差异的结果，因为在WT和本研究中使用的所有具有靶向突变的小鼠中，病毒NS1蛋白水平在一天p.i.达到峰值，随后迅速下降，但在8天内仍能检测到（数据未显示）。

为了支持AA-M在预防或解决RSV诱导的疾病中的作用，纯化WT或IL-4Rα^−/−巨噬细胞过继性转移至IL-4Rα^−/−小鼠和RSV感染5天后。接受WT巨噬细胞（WT→IL-4Rα）的嵌合体小鼠的肺部^−/−)表达IL-4RαmRNA 4 d p.i(图S5). 这表明野生型巨噬细胞归巢于肺部。这些样品的精氨酸酶-1 mRNA增加了9.5倍(图3A). 相反，IL-4Rα^−/−给予IL-4Rα的小鼠^−/−巨噬细胞（IL-4Rα^−/−→ 白细胞介素-4受体α^−/−)，RSV感染未能诱导精氨酸酶-1 mRNA，但诱导了与IL-4Rα相似的IL-12 p40水平升高^−/−对照小鼠。FIZZ1在接受WT巨噬细胞的小鼠中也增加，而iNOS和COX-2在IL-4Rα中均升高^−/−对照组小鼠或接受IL-4Rα的小鼠^−/−巨噬细胞（数据未显示）。组织学分析显示WT→IL-4Rα的肺病理学降低^−/−与WT对照小鼠相似的小鼠(图3B). RSV感染的IL-4Rα^−/−对照小鼠和IL-4Rα^−/−→ 白细胞介素-4受体α^−/−小鼠表现出相对增加的组织病理学(图3B). 这些数据进一步支持AA-M⁄在RSV诱导的病理学中的保护或修复作用。

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图3

WT巨噬细胞的过继转移在IL-4Rα中重建AA-M表型^−/−老鼠

（A） WT BALB/c和IL-4Rα^−/−小鼠，以及IL-4Rα^−/−接受1.5×10剂量的小鼠⁷WT（WT→IL-4Rα^−/−)或IL-4Rα^−/−（IL-4Rα）^−/−→白细胞介素-4受体α^−/−)腹腔巨噬细胞在转移后5天被模拟或RSV感染。每次采集肺4d，通过实时PCR分析基因表达。（B）对（A）组小鼠的肺切片进行H&E染色，并对肺病理进行评分。数据代表两个具有类似结果的单独实验之一（10只小鼠/治疗）。

RSV诱导的AA-M分化依赖TLR4-和IFN-β

RSV激活多种模式识别受体，包括TLR4。⁵^,⁸^,²⁰RSV未能在TLR4中诱导精氨酸酶-1、FIZZ1或MR mRNA^−/−尽管rIL-4在WT和TLR4中诱导了这些标记物^−/−巨噬细胞（表明IL-4Rα在TLR4中完全起作用^−/−巨噬细胞）(图4A). 相反，RSV感染的TLR4诱导IFN-β、COX-2和iNOS mRNA表达^−/−巨噬细胞未受影响(图S6A)支持之前的一份报告，即RSV主要通过RIG-I诱导IFN-β。⁷TLR4的RSV感染^−/−小鼠也未能在肺部诱导精氨酸酶-1 mRNA，但与WT小鼠相比，IL-12 p40 mRNA的表达增加(图S6B). PPARγ，一种调节AA-Mí分化和渗透的核激素受体²¹^–²³，在基础和RSV感染的TLR4中下调^−/−巨噬细胞(图4B)以及RSV感染TLR4的肺部^−/−小鼠（数据未显示）。RSV感染的TLR4^−/−与受感染的WT肺相比，小鼠表现出支气管上皮增生和一些化生，支气管周围和血管周围炎症中度增加(图4C).

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图4

RSV对AA-M的区分依赖于TLR4

（A）重量C57BL/6和TLR4^−/−腹腔巨噬细胞按照图1实时PCR分析mRNA基因表达（N=3）。（B） WT和TLR4^−/−巨噬细胞按（A）处理，并通过实时PCR分析PPARγmRNA基因表达。（C） WT和TLR4^−/−小鼠被模拟或RSV感染。每天采集肺4天。对肺病理学进行评分（N=4；4只小鼠/治疗）。显示的图像为200倍。

干扰素-β是一种与RSV感染恢复相关的有效抗病毒细胞因子。如TLR4所观察到的^−/−巨噬细胞(图4A)，RSV未能诱导IFN-β中AA-M基因的表达^−/−巨噬细胞(图5A)或体内(图5B). IFN-β中抗炎细胞因子IL-10的表达显著降低^−/−肺mRNA样本，而COX-2 mRNA先前与RSV诱导的病理学相关¹⁰，显著增加(图5C). 这些发现在RSV感染的WT和IFN-β中得到证实^−/−巨噬细胞（数据未显示）。RSV感染的干扰素-β^−/−小鼠也表现出增强的肺部病理学，特征是增生和上皮过度脱落，以及轻微的毛细支气管炎和血管炎(图5D).

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图5

RSV诱导的AA-M和IL-10的产生依赖于IFN-β

（A） WT和IFN-β^−/−腹腔巨噬细胞按指示处理，并通过实时PCR分析mRNA（N=2）。（B） WT或IFN-β^−/−小鼠被模拟或RSV感染。在第4天，处死小鼠，并分析肺中精氨酸酶-1、FIZZ1和MR mRNA。（C）在RSV感染的小鼠的肺中测量IL-10和COX-2 mRNA（见图例至（B））。（C）小鼠感染如（B）所示，肺部固定并用H&E染色4 d p.i.（N=4；4只小鼠/治疗组）。显示的图像为400倍。

TLR4级^−/−巨噬细胞对RSV的反应是48小时内IL-4和IL-13 mRNA的WT水平，72小时后IL-4 mRNA急剧丢失(图S6C)，但对IL-4RαmRNA水平无影响(图S6D). 值得注意的是，RSV感染IFN-β^−/−在所有时间点，巨噬细胞产生的IL-4和IL-13均显著低于WT巨噬细胞(图S7A，顶图），一项发现得到证实体内(图S7A，底部图表）。干扰素-β^−/−与未被RSV感染改变的WT小鼠相比，小鼠的肺IL-4RαmRNA表达也显著降低(图S7B). WT巨噬细胞感染rIFN-β或RSV后24小时IL-4RαmRNA表达增加，随后下降(图S7C). 因此，TLR4和IFN-β共同调节PPARγ、IL-4、IL-13和IL-4Rα链的水平，这是AA-M分化和改善肺上皮损伤所必需的。

再次感染和对COX-2抑制剂的反应中的AA-M

在人类中，RSV再次感染很常见。为了检测再次感染对AA-M⏴分化的影响，棉花大鼠被呼吸道合胞病毒感染一到两次（60天后）。棉花大鼠是呼吸道合胞病毒感染的首选模型，因为与小鼠相比，其病理学更类似于人类。²⁴^,²⁵在原发感染期间，肺部检测到IL-4和IL-13 mRNA，但这些基因以及精氨酸酶-1 mRNA在再次感染后被更强烈地激活(图6A). 这些数据与棉花大鼠继发感染中炎症的快速消退相一致。²⁶

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图6

棉花大鼠在再次感染期间和对COX-2抑制的反应中AA-M的快速激活

（A）给棉花大鼠（4/组）注射生理盐水或感染RSV。动物在首次治疗后60天感染RSV。采集肺组织，分离总RNA，通过RT-PCR和Southern印迹分析IL-4、IL-13和精氨酸酶-1 mRNA。（B）棉鼠被模拟或RSV感染。感染的大鼠在p.i.第3天用溶媒（生理盐水）或paracoxib（100 mg/kg）i.p.处理。所有动物在p.i.4天处死，并评估肺样本中指示基因的mRNA表达。每个通道代表一只棉鼠的RNA，结果代表3个单独的实验。

Parecoxib是一种非甾体抗炎药，专门抑制COX-2介导而非COX-1介导的前列腺素（PGs）的生成。²⁷为了验证COX-2生成和AA-Mí分化呈负调控的假设，用RSV感染大鼠，然后用生理盐水或帕雷昔布治疗。经生理盐水处理的RSV感染棉花大鼠精氨酸酶-1和MR mRNA在4 d p.i.时增加。；然而，用parecoxib治疗的RSV感染棉鼠表现出更强的AA-M标记诱导作用(图6B). 这表明COX-2的产生抑制AA-M分化，从而降低AA-M⁄影响肺组织修复的能力。

讨论

RSV诱导快速产生促炎细胞因子和趋化因子IFN-β^三^,⁸^,⁹以及COX-2，之前与RSV诱导的肺部病理学有关。¹⁰然而，例如、IL-4、IL-13和IL-10也在RSV感染期间产生。我们的数据强烈支持IL-4/13诱导的AA-M在缓解RSV诱导的肺病理中的中心作用。AA-Mб产生的精氨酸酶-1、MR、FIZZ1和Ym1长期以来与感染后的肺修复和重塑有关¹⁸^,²⁸^,²⁹与我们观察到的IL-4Rα^−/−小鼠，RSV诱导的炎症明显加重。结合WT巨噬细胞被动转移逆转IL-4Ra表型的观察^−/−就细胞因子产生、AA-M分化和病理学而言，我们的数据表明AA-Mб是RSV诱导的肺损伤调节的中心效应器。NS-1 mRNA是第一个转录的RSV基因，在p.i.第1天达到峰值，然后减弱（数据未显示），在所有研究的小鼠菌株中观察到类似的动力学。因此，虽然病毒复制受早期免疫反应控制，但肺病理的控制取决于AA-Mö的后期发展。

而RSV诱导的IL-4和IL-13主要归因于Th2细胞⁹都是由包括巨噬细胞在内的其他细胞类型产生的¹⁵^,³⁰和嗜碱性粒细胞。³¹在RSV感染的肺、腹膜或细胞系衍生的巨噬细胞中诱导IL-4和IL-13在体外BAL和间质肺巨噬细胞体内，即使在Rag2^−/−小鼠，表明这些细胞因子在产生适应性Th2免疫应答之前存在，并以自分泌/旁分泌方式诱导或维持AA-M表型。尽管先前的研究表明嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞是IL-4的来源⁹，我们的免疫细胞化学结果表明，IL-4和精氨酸酶-1产生细胞明显是单核细胞和F4/80⁺表明这些是间质或浸润性巨噬细胞。Moore等人表明，RSV感染小鼠中嗜碱性粒细胞的减少降低了肺IL-4的表达³¹，在第7天进行分析，而不是在第4天，此时我们发现巨噬细胞是IL-4的主要来源。通过IL-4Rα的信号传导是呼吸道合胞病毒诱导的AA-M⏴分化和限制病理所必需的，我们的数据表明，促炎细胞因子和抗炎细胞因子的平衡决定了疾病的严重程度。高纯度WT巨噬细胞过继性转移至IL-4Rα的发现^−/−小鼠逆转IL-4Rα^−/−在AA-M标记表达、细胞因子产生和病理学水平上，表型强化了AA-Mб而非嗜碱性粒细胞限制RSV诱导的肺损伤的概念。这种巨噬细胞依赖性、IL-4Rα和STAT6依赖性对呼吸道合胞病毒的反应与描述为结核分枝杆菌.³²

TLR4和IFN-β都有助于RSV诱导的AA-M在体外和体内，因为AA-M未能在TLR4中发展^−/−或干扰素-β^−/−与WT小鼠相比，巨噬细胞伴有RSV诱导的上皮损伤增加(图4和图5). RSV诱导的IFN-β不需要TLR4信号(图S6A). 目前，在RSV感染中诱导AA-M⁄分化的TLR4配体尚不清楚。Kurt-Jones等人。⁵据报道，RSV融合蛋白是TLR4激动剂，Imai等人证明，在应对流感感染时，会生成宿主衍生磷脂，并充当TLR4拮抗剂。³³Haeberle等人。⁸显示肺泡巨噬细胞耗竭或缺乏TLR4的小鼠在感染早期未能激活NF-κB。最近，Odegaard等人。²¹据报道，PPARγ/维甲酸X受体异二聚体是精氨酸酶-1表达的主要反式激活因子。此外，Coste等人。²²表明PPARγ通过IL-13诱导PPARγ配体15d–PGJ2促进巨噬细胞MR表达。PPARγ缺陷的巨噬细胞对IL-4的反应显示出精氨酸酶-1的表达和活性降低，并且对IL-4没有反应以抵消LPS诱导的促炎细胞因子的分泌。据报道，TLR4介导的PPARγ在结肠上皮细胞中表达。³⁴未经治疗或RSV感染的TLR4^−/−巨噬细胞表达减少的PPARγmRNA(图4B)表明了一种分子机制，通过该机制，TLR4的RSV感染无法诱导AA-M^−/−小鼠和巨噬细胞，即使在WT水平产生IL-4和IL-13。最近，Malur等人发现肺泡巨噬细胞中PPARγ的缺失会导致Th1肺部炎症反应的倾向。³⁵RSV感染的TLR4在72 h p.i.时产生的IL-4急剧下降^−/−巨噬细胞也可能导致AA-M的生成失败。

20世纪60年代中期失败的临床试验表明，接受FI-RSV免疫的儿童比未接受免疫的儿童表现出更严重的疾病。我们实验室以前的研究首先指出TLR4信号在缓解RSV诱导的增强性肺损伤中的重要作用。^三用FI-RSV疫苗免疫的棉鼠在RSV感染后会经历由“细胞因子风暴”介导的“增强型疾病”，其中会产生“Th1”和“Th2”型细胞因子。然而，FI-RSV与无毒TLR4激动剂单磷酸脂A联合用药，抵消了RSV在FI-RSV-疫苗接种动物中诱导的病理增强和过度血氧基因表达谱。

我们在此提供的数据还表明，IFN-β通过调节IL-4、IL-13和IL-4Rα，有助于AA-M的诱导(图S5B、C). RSV感染的IFN-β中COX-2升高^−/−老鼠(图5)通过抑制COX-2和COX-2来缓解RSV诱导的肺病理学^−/−小鼠对流感的反应较少。¹⁰^,³⁶塞来昔布对COX-2的抑制增加了精氨酸酶-1mRNA体内(图6)暗示了一种以前未被认可的负面反馈机制。

针对RSV的AA-M分化可能导致细胞因子环境，该环境决定了后续感染的适应性Th1/Th2反应的过程。Didierlaurent等人表明，流感或RSV小鼠的初次感染导致肺泡巨噬细胞，即使在感染数月后，也无法对TLR激动剂产生反应。³⁷因此，由呼吸道合胞病毒驱动的AA-M⏴诱导的抗炎状态可能会持续很长一段时间，这表明这种巨噬细胞介导了一种延长的抗炎状态，从而限制了随后呼吸道合胞病毒感染诱导的炎症。⁴^,²⁶^,³⁸幼儿RSV感染可导致哮喘等慢性呼吸道疾病。³⁹Kim等人最近表明，为了对仙台病毒（一种与RSV相关的病毒）作出反应，小鼠的气道高反应性增加，在感染后49天达到最大值。⁴⁰AA-M产品的长期生产，如精氨酸酶-1、FIZZ1和Ym1，也可能通过肺重塑导致哮喘等慢性气道疾病。⁴¹

在这项研究中，我们证实了一份报告，该报告显示RSV感染期间IL-10的诱导作用。^三基于其特征鲜明的抗炎作用，IL-10有望抵消促炎细胞因子的产生，从而促进疾病的解决。RSV感染的IFN-β对IL-10的诱导作用较差^−/−老鼠(图5C)巨噬细胞（数据未显示）支持先前的报告，即诱导IL-10需要IFN-β⁴²并提示干扰素-β在AA-M分化中的新作用。因此，“Th1”和“Th2”型细胞因子的平衡对于维持RSV等病毒诱导的损伤与对随后过敏触发物的敏感性之间的平衡至关重要。

图7提出了一个由我们的发现支持的模型。虽然呼吸道上皮细胞是呼吸道合胞病毒感染的最初目标，但呼吸道合胞菌也感染肺部巨噬细胞，导致早期释放强大的细胞因子和趋化因子，这些细胞因子和化学因子招募炎症细胞类型（包括单核细胞），并增加炎症细胞因子和介导病理的COX-2水平。¹⁰^,⁴³在感染后期，AA-Mö分化是一个IL-4Rα-、TLR4-和IFN-β依赖性，部分通过（i）IL-10对细胞因子产生的抗炎作用，（ii）TLR4诱导的PPARγ，（iii）IFN-β诱导的IL-4、IL-13和IL-4Rα，以及（iv）通过诱导FIZZ1、Ym1和精氨酸酶-1等酶修复组织损伤来抵消早期炎症反应。然而，如果AA-M表型持续存在，则可能会导致“Th2”偏斜的适应性免疫反应，导致对过敏触发物的超敏反应，正如在早期患有RSV感染的儿童中观察到的那样。

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图7

RSV感染过程中AA-M作用的假设模型

方法

试剂

购买了同种对照抗体和荧光标记的二级抗体：小鼠IgG2a和IgG1、大鼠IgG2b、山羊IgG和兔IgG（西格玛，密苏里州圣路易斯）；Cy2-结合驴抗兔IgG、Cy2-连接驴抗鼠IgG，驴抗鼠生物素、Cy2--结合链霉亲和素、Cy3-连接驴抗小鼠IgG和Cy3--连接驴抗山羊IgG（杰克逊免疫研究实验室）。

RSV长株（A组）是从美国型培养物收集中心（弗吉尼亚州马纳萨斯）获得的，并按所述进行繁殖。⁴Parecoxib来自印度孟买进出口医药国际。

小鼠和巨噬细胞培养

购买6至8周龄的WT C57BL/6J和BALB/cByJ小鼠（马萨诸塞州巴尔港杰克逊实验室）。TLR4级^−/−小白鼠（由日本大阪静田昭夫提供）和干扰素-β^−/−小鼠（由加拿大多伦多Eleanor Fish提供），均为C57BL/6背景和IL-4Rα^−/−小鼠（BALB/c背景；由Nancy Noben-Trauth（医学博士Rockville）和William Paul（医学硕士Bethesda）提供）在UMB认可的设施中繁殖。抹布2^−/−小鼠（BALB/c背景）购自Taconic（马里兰州Rockville）。近交棉鼠(Sigmodon hispidus公司)由Virion Systems，Inc.（马里兰州Rockville）培育。所有动物实验均经机构批准进行。

如补充方法所述，高度纯化（>97%）的小鼠或大鼠硫代乙醇酸合法腹腔巨噬细胞和小鼠BAL（>98%）巨噬细胞得到富集。巨噬细胞在6孔（4×10⁶细胞/孔），12孔（2×10⁶细胞/孔（用于腹腔或RAW 264.7巨噬细胞）和24孔（2.5×10⁵细胞/BAL巨噬细胞孔）组织培养板。由于BAL巨噬细胞的产量较低，大多数实验都是用腹膜巨噬细胞进行的。单用培养基或鼠或棉鼠rIL-4（40 ng/ml；R&D Systems，Inc.）刺激巨噬细胞，或感染RSV（感染多重性=2），并在37°C下孵育指定时间。

细胞因子测量

细胞因子水平通过ELISA（细胞因子核心实验室，UMB）测定。

实时PCR

如前所述，进行总RNA分离和实时PCR。⁸^,⁴⁴^,⁴⁵特定基因的mRNA水平报告为相对基因表达标准化到中等处理样品。

采用RT-PCR和Southern分析法对棉花大鼠肺部的基因表达进行分析。⁴^,⁴⁶棉鼠引物列在补充方法中。

病毒感染和组织加工

检测精氨酸酶-1就地，肺膨胀并灌注0.9%生理盐水，然后灌注4%PFA，固定后4 h，在0.1 M磷酸盐缓冲液（PB）中洗涤15 min，并在4°C下放置在0.1 M PB中30%蔗糖中48 h。肺被嵌入组织Tek最佳切割化合物（OTC；Sakurak Finetek，Torrance，CA）中，冷冻在干冰异戊烷上，并在−70°C下储存，直至剖切。

细胞内染色和共焦显微镜

肺切片与PBST（PB，1%BSA，1%正常驴血清，0.3%Triton X-100）在室温下孵育30分钟。使用大鼠MAb对抗小鼠F4/80的C末端，然后使用Cy2缀合的驴抗大鼠IgG，通过免疫荧光观察F4/80。使用针对小鼠精氨酸酶-1的单克隆抗体IgG2b（BD Bioscience，San Jose，CA）检测精氨酸蛋白酶-1，然后使用Cy3-共轭驴抗鼠IgG检测精氨酶-1。用DAPI染色观察细胞核。使用防褪色荧光安装介质将盖玻片安装在载玻片上，并使用配备标准激发和发射过滤器的Olympus FluoView 500共焦显微镜（60x，NA 1.4物镜）进行观察，以显示UV、Cy2和Cy3。

巨噬细胞转移实验

WT和IL-4Rα^−/−腹腔渗出巨噬细胞（>98%F4/80⁺)按照补充方法中的说明进行浓缩和培养。将平板放在冰浴上15分钟，用橡皮警察分离细胞，离心，然后在盐水中重新悬浮。白细胞介素-4受体α^−/−小鼠腹腔注射1.5×10⁷WT或IL-4Rα^−/−如前所述的巨噬细胞。⁴⁷五天后，对照组（未经治疗的WT或IL-4Rα^−/−)或嵌合小鼠感染RSV（10⁶pfu/动物识别号）。4天后采集肺部进行RNA和组织病理学检查。

组织病理学

用苏木精和伊红（H&E）对石蜡包埋肺的固定切片（10µm）进行染色。对每个节段的四个炎症参数进行独立评分，从0到4²⁶：细支气管炎（炎症细胞，主要是淋巴细胞，围绕在细支气管周围）、血管炎（炎细胞，主要为淋巴细胞，围绕血管）、肺泡炎（肺泡腔内的炎细胞）和间质性肺炎（与炎性细胞相关的肺泡壁厚度增加）。幻灯片是随机的，盲目阅读，并为每个幻灯片打分。还评估了上皮损伤。

统计

两组之间的统计学差异是使用未配对的双尾Student’s来确定的t吨显著性检验设为p<0.05。对于三个或更多组之间的比较，采用单因素方差分析进行分析，然后进行Tukey多重比较检验，显著性确定为p<0.05。

补充材料

01

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致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院AI-057575（JB）、AI-18797（SNV）、AI-38985和AI59775（ADK）的资助。

普林斯博士是VSI的总裁兼首席执行官。Blanco博士和Pletneva女士是VSI的全职员工。VSI为阿斯利康执行合同研究，并从Synagis®的销售中获得特许权使用费收入。布兰科博士和普列特涅娃女士都没有从阿斯利康获得经济利益。没有其他潜在利益冲突的报告。

脚注

补充数据

补充数据包括7个图和扩展的实验程序。

工具书类

1威利弗钢筋混凝土。严重呼吸道合胞病毒（RSV）感染的流行病学和临床危险因素综述。《儿科杂志》。2003;143：S112–S117。[公共医学][谷歌学者]

2Blanco JCG、Boukhvalova M、Pletneva L、Prince GA、Vogel SN。重新思考呼吸道合胞病毒疫苗。近期研究进展。实验医学。2004;1:75–94.附录1。[谷歌学者]

三。Boukhvalova MS、Prince GA、Soroush L、Harrigan DC、Vogel SN、Blanco JC。TLR4激动剂，单磷酸脂A，减弱与呼吸道合胞病毒疫苗增强疾病相关的细胞因子风暴。疫苗。2006;24:5027–5035.[公共医学][谷歌学者]

4Pletneva LM、Haller O、Porter DD、Prince GA、Blanco JC。棉花大鼠中干扰素诱导的Mx基因表达：克隆、表征和流感病毒感染期间的表达。《干扰素细胞因子研究杂志》。2006;26:914–921.[公共医学][谷歌学者]

5Kurt-Jones EA等。模式识别受体TLR4和CD14介导对呼吸道合胞病毒的反应。自然免疫学。2000;1:398–401.[公共医学][谷歌学者]

6Murawski MR等。呼吸道合胞病毒通过Toll样受体2激活先天免疫。J.维罗尔。2009;83:1492–1500. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

7Liu P、Jamaluddin M、Li K、Garofalo RP、Casola A、Brasier AR。维甲酸诱导基因I介导呼吸道合胞病毒感染的呼吸道上皮细胞的早期抗病毒反应和Toll样受体3表达。J.维罗尔。2007;81:1401–1411. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

8Haeberle HA等。呼吸道合胞病毒诱导的肺部核因子-κB活化涉及肺泡巨噬细胞和toll样受体4依赖性途径。J.感染。数字化信息系统。2002;186:1199–1206.[公共医学][谷歌学者]

9Bueno SM等。RSV发病过程中的宿主免疫。国际免疫药理学。2008;8:1320–1329.[公共医学][谷歌学者]

10Richardson JY等。呼吸道合胞病毒（RSV）感染诱导环氧合酶2：RSV治疗的潜在靶点。免疫学杂志。2005;174:4356–4364.[公共医学][谷歌学者]

11Pribul PK等。肺泡巨噬细胞是病毒性肺部感染早期反应的主要决定因素，但不影响随后的疾病发展。J.维罗尔。2008;82:4441–4448. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

12Munder M、Eichmann K、Morán JM、Centeno F、Soler G、Modelell M.Th1/Th2调节小鼠巨噬细胞和树突状细胞中精氨酸酶亚型的表达。免疫学杂志。1999;163:3771–3777.[公共医学][谷歌学者]

13Gordon S.巨噬细胞的替代激活。《自然免疫学评论》。2003;三:23–35.[公共医学][谷歌学者]

14Raes G、Noöl W、Beschin A、Brys l、DeBaetselier P、Gholamreza Hassandsadeh G.FIZZ1和Ym作为区分差异活化巨噬细胞的工具。发展。免疫学。2002;9:151–159. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

15Shirey K、Cole LE、Keegan AD、Vogel SN。土拉弗朗西斯菌活疫苗株诱导巨噬细胞选择性激活作为一种生存机制。免疫学杂志。2008;181:4159–4167. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

16Kelly-Welch AE、Hanson EM、Boothby MR、Keegan AD。白细胞介素-4和白细胞介素-13信号连接图。科学。2003;300:1527–1528.[公共医学][谷歌学者]

17Stein M、Keshav S、Harris N、Gordon S.IL-4能有效增强小鼠巨噬细胞甘露糖受体活性；替代免疫巨噬细胞激活的标记物。实验医学学报1992;176:287–292. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

18Welch JS、Escoubet-lozach L、Sykes DB、Liddiard K、Greaves DR、Glass CK。TH2细胞因子和过敏激发通过STAT6依赖机制诱导巨噬细胞中Ym1的表达。生物学杂志。化学。2002;277:42821–42829.[公共医学][谷歌学者]

19Liu T，等。博莱霉素诱导的肺纤维化中炎症区1表达的调节：IL-4/IL-13的作用和通过STAT-6的介导。免疫学杂志。2004;1733425–3421. [公共医学][谷歌学者]

20Haynes LM、Moore DD、Kurt-Jones EA、Finberg RW、Anderson LJ、Tripp RA。toll样受体4参与呼吸道合胞病毒的先天免疫。J.维罗尔。2001;75:10730–10737. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

21Odegaard JI等。巨噬细胞特异性PPARγ控制选择性激活并改善胰岛素抵抗。自然。2007;447:1116–1120. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

22Coste A等。PPARγ促进小鼠巨噬细胞中甘露糖受体基因的表达，并有助于IL-13诱导该受体。免疫。2003;19:329–339.[公共医学][谷歌学者]

23Stienstra R、Duval C、Keshtkar S、van der Laak J、Kersten S、Müller M.过氧化物酶体增殖物激活受体γ激活促进交替激活的巨噬细胞浸润脂肪组织。生物化学杂志。2008;283:22620–22627.[公共医学][谷歌学者]

24Prince GA、Jenson AB、Horswood RL、Camargo E、Chanock RM。棉鼠呼吸道合胞病毒感染的发病机制。美国病理学杂志。1978;93:771–791. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

25Prince GA，Curtis SJ，Yim KC，Porter DD。用Lot 100或新制备的参考疫苗免疫后，疫苗增强了棉花大鼠的呼吸道合胞病毒疾病。维罗尔将军。2001;82:2881–2888.[公共医学][谷歌学者]

26Prince GA、Prieels JP、Slaoui M、Porter DD。棉鼠（Sigmodon hispidus）原发性呼吸道合胞病毒感染、再感染和疫苗增强性疾病的肺部病变实验室投资。1999;79:1385–1392.[公共医学][谷歌学者]

27麦克默里RW，哈迪KJ。Cox-2抑制剂：今天和明天。美国医学科学杂志。2002;323:181–189.[公共医学][谷歌学者]

28Albina JE，Mills CD，Henry WL，Jr，Caldwell MD我-愈合伤口中的精氨酸代谢。免疫学杂志。1990;144:3877–3880.[公共医学][谷歌学者]

29Kodelja V、Muller C、Tenorio S、Schebesch C、Orfanos CE、Goerdt S。经典活化巨噬细胞与交替活化巨噬细胞血管生成潜能的差异。免疫生物学。1997;197:478–493.[公共医学][谷歌学者]

30Varin A，Gordon S.巨噬细胞的替代激活：免疫功能和细胞生物学。免疫生物学。2009;214630–241. [公共医学][谷歌学者]

31Moore ML等。STAT1负调节呼吸道合胞病毒感染诱导的肺嗜碱性粒细胞IL-4表达。免疫学杂志。2009;183:2016–2026. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

32El Kasmi KC等。巨噬细胞中Toll样受体诱导的精氨酸酶1阻碍对细胞内病原体的有效免疫。自然免疫学。2008;9:1399–1406. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

33Imai Y等。氧化应激和Toll样受体4信号传导作为急性肺损伤关键途径的鉴定。单元格。2008;133:235–249. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

34Dubuquoy L等。溃疡性结肠炎中过氧化物酶体增殖物激活受体γ的表达受损。胃。2003;124:1265–1276.[公共医学][谷歌学者]

35Malur A等。肺泡巨噬细胞中PPARγ的缺失与Th-1肺部炎症反应相关。免疫学杂志。2009;182:5816–5822.[公共医学][谷歌学者]

36Carey MA、Bradbury JA、Seubert JM、Langenbach R、Zeldin DC、Germolec DR。环氧合酶-1（COX-1）和COX-2缺乏对宿主对甲型流感病毒感染反应的对比影响。免疫学杂志。2005;175:6878–6884.[公共医学][谷歌学者]

37Didierlaurent A等。呼吸道流感感染缓解后对细菌Toll样受体配体的持续脱敏。实验医学学报2008;205:323–329. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

38Boukhvalova MS，普林斯GA，布兰科JC。呼吸道合胞病毒感染肺部，并在肺部进行流产复制，尽管已有免疫力。J.维罗尔。2007;81:944–950. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

39Sigurs N、Bjarnason R、Sigurbergsson F、Kjellman B、Bjorksten B。呼吸道合胞病毒毛细支气管炎后的哮喘和免疫球蛋白E抗体：一项具有匹配对照的前瞻性队列研究。儿科。1995;95:500–505.[公共医学][谷歌学者]

40.Kim EY等。先天免疫反应的持续激活将呼吸道病毒感染转化为慢性肺部疾病。自然医学。2008;14:633–640. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

41Anthony RM、Rutizky LI、Urban JF，Jr、Stadecker MJ、Gause WC。蠕虫感染的保护性免疫机制。《自然免疫学评论》。2007;7:975–987. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]

42Chang EY，Guo B，Doyle SE，Cheng G.前沿：I型干扰素生成和信号通路在脂多糖诱导的IL-10生成中的参与。免疫学杂志。2007;178:6707–6709.[公共医学][谷歌学者]

43Prince GA、Mathews A、Curtis SJ、Porter DD。用全身注射的单克隆抗体（Palivizumab）和糖皮质激素治疗棉鼠模型中的呼吸道合胞病毒毛细支气管炎和肺炎。J.感染。数字化信息系统。2000;182:1326–1330. [谷歌学者]

44Cuesta N，Salkowski CA，Thomas KE，Vogel SN.干扰素调节因子-2对脂多糖敏感性的调节。免疫学杂志。2003;170:5739–5747.[公共医学][谷歌学者]

45Cole LE等人土拉弗朗西斯菌活疫苗株感染：先天免疫反应在感染和免疫中的作用。免疫学杂志。2006;176:6888–6899.[公共医学][谷歌学者]

46Blanco JC、Pletneva L、Boukhvalova M、Richardson JY、Harris KA、Prince GA。棉花大鼠：一种未充分利用的人类传染病动物模型，现在可以使用细胞因子、趋化因子和干扰素的特定试剂进行开发。《干扰素细胞因子研究杂志》。2004;24:21–28.[公共医学][谷歌学者]

47Ford AQ，Smith E，Noben-Trauth N，Keegan AD。在过敏性肺部炎症小鼠模型中，选择性活化巨噬细胞参与嗜酸性粒细胞向肺部的募集。补充免疫学杂志。2009年4月；18279.2.[谷歌学者]