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摩尔内分泌。2010年6月；24(6): 1151–1164.
2010年4月6日在线发布。 数字对象标识：2009-0482年10月21日
预防性维修识别码：项目经理2875805
PMID：20371703

人肝细胞中一种新的胆汁酸激活的维生素D受体信号

韩树新,李天刚,埃瓦·埃利斯,斯蒂芬·斯特罗姆、和约翰·Y·L·蒋
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摘要

维生素D受体（VDR）被天然配体1α，25-二羟基维生素D激活三[1α，25（OH）2-D类三]和石胆酸（LCA）。我们之前的研究表明，VDR在人类肝细胞中表达，VDR配体抑制胆汁酸合成和编码胆固醇7α-羟化酶（CYP7A1）基因的转录。用原代人肝细胞研究LCA和1α，25（OH）2-D类三激活VDR信号。共聚焦免疫荧光显微镜成像和免疫印迹分析显示LCA和1α，25（OH）2-D类三诱导VDR从胞浆向细胞核和质膜的细胞内移位，VDR与小窝蛋白-1共定位。VDR配体诱导c-Src和VDR的酪氨酸磷酸化及其相互作用。抑制c-Src可消除VDR配体依赖性抑制CYP7A1 mRNA表达。激酶分析显示，VDR配体特异性激活c-Raf/MEK1/2/细胞外信号调节激酶（ERK）1/2通路，该通路刺激VDR和肝细胞核因子-4α的丝氨酸磷酸化及其相互作用。哺乳动物双杂交试验显示，核受体辅升压因子-1和视黄醇和甲状腺沉默介质与VDR/视黄醇X受体-α（RXRα）之间存在VDR配体依赖性相互作用。染色质免疫沉淀分析显示，ERK1/2抑制剂逆转了VDR配体诱导的VDR、RXRα和辅抑制剂向人类的募集CYP7A1公司发起人。综上所述，VDR配体激活膜VDR信号传导，激活MEK1/2/ERK1/2通路，从而刺激核VDR/RXRα募集共升压因子以抑制CYP7A1公司人类肝细胞中的基因转录。这种膜VDR信号通路可能被胆汁酸激活，以抑制胆汁酸合成，作为保护肝细胞免受胆汁淤积性肝损伤的快速反应。

在人类肝细胞中，石胆酸通过MEK1/2/ERK1/2 MAPK途径激活膜VDR信号，抑制CYP7A1基因转录。

胆汁酸是消化系统中脂肪和营养物质的消化和吸收以及药物和代谢物的处置所必需的生理介质。胆汁酸也是多功能的信号分子，可激活核受体和细胞信号通路，并在脂质、葡萄糖、药物和能量代谢中发挥关键作用(1,2,三,4). 胆汁酸合成受到胆汁酸返回肝脏的负反馈调节，以抑制编码胆固醇7α-羟化酶（CYP7A1）的基因，该基因是经典胆汁酸生物合成途径中合成两种主要胆汁酸胆酸（CA）和鹅去氧胆酸（CDCA）的起始酶和速率限制酶在人类肝脏中(1). 众所周知，胆汁酸可激活一种核受体，即法尼类X受体（FXR，NR1H4），该受体在胆汁酸合成和转运以及葡萄糖和脂蛋白代谢的调节中起着关键作用(三). 在肝脏中，FXR诱导一个负核受体，即小异二聚体伴侣（NR0B2）抑制CYP7A1公司基因转录。在肠道中，FXR诱导成纤维细胞生长因子15（FGF15或人类FGF19），其激活肝脏FGF受体4信号通路，抑制CYP7A1和胆汁酸合成(5,6). 石胆酸（Lithocholic acid，LCA）是一种通过肠道细菌作用从CDCA中提取的高疏水性和毒性胆汁酸，是维生素D受体（VDR，NR1I1）的有效内源性配体(7)和孕烷X受体（NR1I2）(8). 这两种外源性传感器诱导药物代谢细胞色素P450 3A4（CYP3A4）和硫转移酶2A1，并可能在肝脏和肠道中药物和胆汁酸的解毒中发挥作用(9,10).

VDR在大多数组织和细胞中广泛表达(11). 然而，有报道称VDR在小鼠肝脏中不表达(12). 在大鼠肝脏中，VDR主要表达于非实质和胆道上皮细胞(13). 最近，我们报道了VDR蛋白和mRNA在HepG2和人原代肝细胞中表达(14). LCA和1α，25-二羟维生素D三[1α，25（OH）2-D类三]增加肝细胞核中VDR蛋白的表达，并强烈抑制人原代肝细胞中CYP7A1 mRNA的表达和胆汁酸的合成。此外，VDR mRNA的小干扰RNA敲除阻断了VDR配体对人肝细胞中CYP7A1 mRNA表达的抑制作用。VDR和维甲酸X受体α（RXRα）异二聚体与胆汁酸反应元件（BARE）结合，阻断肝细胞核因子4α（HNF4αCYP7A1公司基因转录(14).

活性激素1α，25（OH）2-D类三调节多种生理功能，包括钙和磷酸盐稳态、细胞生长和分化以及许多组织中的基因转录(11). 通过1α，25（OH）结合和活化2-D类三，VDR/RXRα异二聚体与VDR阳性或阴性反应元件结合以调节靶基因转录。VDR信号转导对VDR靶基因的正向调控已被广泛研究。然而，VDR对基因转录负作用的机制尚不清楚。此外，最近的研究揭示了1α，25（OH）的潜在非基因组作用2-D类三在表达VDR的组织和细胞中(15). 1α，25（OH）的快速反应作用2-D类三通过膜结合的VDR介导，VDR存在于富含小泡的质膜中(16). 据报道，1α，25（OH）2-D类三刺激肌肉细胞中VDR和胞浆酪氨酸激酶c-Src的酪氨酸磷酸化(17,18). 这种VDR依赖性信号激活肌肉、角质形成细胞、成骨细胞和肾脏中的多种激酶，包括cAMP依赖性蛋白激酶A（PKA）、磷酸肌醇-3激酶（PI3K）、蛋白激酶C（PKC）和MAPK(16,19). 肝细胞质膜中VDR的存在尚未见报道，人类肝细胞中VDR信号通路尚未阐明。

我们研究了1α，25（OH）2-D类三和LCA激活的原代人肝细胞内信号传导，是研究胆汁酸合成和人类的最佳模型CYP7A1公司基因调控。我们的结果表明，1α，25（OH）2-D类三和LCA诱导VDR向人肝细胞质膜和细胞核的细胞内移位。膜VDR信号刺激VDR的酪氨酸磷酸化并诱导VDR与c-Src相互作用。膜VDR信号特异性激活c-Raf/有丝分裂原激活的细胞外激酶1/2（MEK1/2）/MAKP/ERK激酶1/2途径。在细胞核中，VDR信号刺激VDR、RXRα和HNF4α的磷酸化，并诱导VDR/RXRα异二聚体募集共抑制剂以抑制CYP7A1公司基因转录。这种膜VDR信号通路可能是对胆汁淤积的快速反应，以保护肝脏免受胆汁淤滞损伤。

结果

VDR配体诱导人肝细胞内VDR向质膜和细胞核移位

我们之前的研究表明，1α，25（OH）2-D类三增加人肝细胞核提取物中的VDR(14). 为了研究配体是否诱导VDR核移位或增加VDR表达，采用免疫印迹法检测用内源性VDR配体1α，25（OH）预处理的人原代肝细胞分离的总细胞蛋白提取物、胞浆、核和膜部分中的VDR蛋白2-D类三（50牛顿米)，或LCA（10μ米). 我们还用LCA-醋酸盐（10μ米)是一种无毒、高效、选择性VDR激动剂(20). 我们还用CDCA（20μ米)或胆酸（CA，20μ米). 这两种胆汁酸是FXR的内源性配体，但不是VDR。图1​1显示这些试剂中没有一种对总细胞提取物中VDR蛋白的表达水平有影响。然而，1α，25（OH）2-D类三、LCA和LCA-醋酸盐显著降低了胞浆中的VDR蛋白，但增加了核膜和质膜的VDR（图1​1).). 有趣的是，1α，25（OH）2-D类三、LCA或乙酸LCA增加了膜小窝蛋白-1水平，这与膜组分中VDR水平的增加相似。小窝蛋白-1是小窝的标记物，小窝是一种富含胆固醇、鞘磷脂和参与细胞信号传导的膜受体的膜亚结构域。CDCA和CA是弱VDR配体，对VDR的细胞内定位影响不大。

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人原代肝细胞VDR表达的免疫印迹分析。用载体（Veh，EtOH），1α，25（OH）处理人原代肝细胞2-D类三（50牛顿米)，LCA（10μ米)，LCA-醋酸盐（10μ米)，CDCA（20μ米)，或CA（20μ米)持续6 h。从人类原代肝细胞中分离出细胞质、细胞核和膜组分（40μg）用于免疫印迹分析。用兔抗人VDR抗体检测VDR。β-肌动蛋白和拉明B分别作为胞浆和细胞核的内负荷控制。监测小窝蛋白-1作为小窝膜亚结构域的标记。采用抗pan-钙粘蛋白检测钙粘蛋白作为质膜蛋白标记物。数据代表了使用从不同肝脏供体分离的原代人肝细胞（HH1472、HH1483和HH1493）进行的三个单独实验之一。

为了进一步研究1α，25（OH）的作用2-D类三我们使用共焦免疫荧光显微镜成像来检测人原代肝细胞中VDR的细胞内易位。图2​2显示在不添加配体的情况下，VDR（用Fluor Alexa染色并在488 nm处扫描，如所示绿色)主要位于胞浆中(顶行). Caveolin-1（用荧光Alexa染色，在546 nm处扫描，如图所示橙红色)定位于质膜和核周表面(紫色). 细胞核用TO-PRO-3染色(蓝色). 三幅图像的合并证实了胞浆中未连接VDR的主要定位。用1α，25（OH）处理后2-D类三、LCA或LCA-醋酸盐、VDR和caveolin-1主要定位于质膜，一些位于同一区域(黄色的). VDR也转位到细胞核(水)和一些VDR和caveolin-1在核周表面共定位(紫色). 相比之下，CA处理导致一些VDR向细胞核移位，但显然不会向膜移位。这些结果揭示了配体诱导VDR从胞浆向细胞核和质膜的胞内易位，小窝蛋白-1和VDR可能一起易位到质膜中的小窝。这些共聚焦荧光成像数据与图1所示的免疫印迹分析数据一致​1.

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共焦免疫荧光显微镜分析VDR配体对人原代肝细胞中VDR细胞内定位的影响。用Caveolin-1抗体和结合红色荧光的二级抗体检测Caveolin-1。VDR抗体和与绿色荧光缀合的第二抗体用于检测VDR。用TOPRO-3碘化物642/661 nm对细胞核进行染色。三幅图像的合并显示在右立柱用载体（Veh，EtOH）处理细胞，50 n米1α，25（OH）2-D类三, 10 μ米生命周期评价，10μ米LCA-醋酸盐，或25μ米如图所示，CA持续6小时。

LCA-醋酸盐和1α，25（OH）2-D类三激活c-Src的酪氨酸磷酸化和膜VDR

据报道，1α，25（OH）2-D类三刺激骨骼肌细胞中VDR的酪氨酸磷酸化并激活c-Src(21,22). 人类c-Src有两个主要的磷酸化位点。酪氨酸-419的磷酸化（人的Y419或鸡的Y416 c-Src）和酪氨酸530的去磷酸化（人类的Y530或鸡的Y-Src的Y527）激活c-Src。为了研究VDR配体对人肝细胞中VDR和c-Src酪氨酸磷酸化的影响，我们使用抗VDR抗体从膜组分中沉淀VDR，并使用抗磷酸酪氨酸抗体（抗p-酪氨酸）检测酪氨酸磷酸VDR。图3A​3A级表明1α，25（OH）2-D类三、LCA和LCA-醋酸盐，而不是CDCA和CA，显著增加了质膜中酪氨酸磷酸化VDR的数量。为了测试c-Src是否与血浆中的VDR相关，我们使用抗c-Src-抗体检测可能与VDR共沉淀的c-Src。图3B​3B公司结果表明，抗c-Src和抗磷酸化Y416抗体在从LCA-醋酸盐或1α，25（OH）分离的质膜组分中检测到了与VDR共沉淀的c-Src-和酪氨酸磷酸化的c-Src2-D类三处理过的人类肝细胞。进一步确认1α，25（OH）2-D类三信号传导涉及c-Src，我们用一种特殊的c-Src-抑制剂AZD0530处理原代人类肝细胞，并进行免疫沉淀分析。图3C​3C公司显示AZD0530显著降低了从1α，25（OH）处理的细胞分离的免疫沉淀剂中酪氨酸磷酸化VDR的数量2-D类三或LCA醋酸盐。这些共免疫沉淀（co-IP）分析表明，1α，25（OH）2-D类三信号传导刺激VDR的酪氨酸磷酸化以及VDR和c-Src向质膜的移位。为了测试c-Src在通过膜VDR信号调节CYP7A1中的作用，我们使用定量RT-PCR分析来研究AZD0530对原代人类肝细胞中CYP7A1 mRNA表达水平的影响。图3D​三维(左侧面板)表明AZD0530单独治疗使CYP7A1 mRNA表达水平增加了2倍，表明c-Src在抑制肝细胞中CYP7A2的基础水平表达方面具有组成性活性。AZD0530完全阻断1α，25（OH）对人原代肝细胞CYP7A1 mRNA表达的抑制2-D类三或LCA醋酸盐。为了进一步证实c-Src参与肝细胞中VDR信号传导，我们研究了AZD0530对特征良好的VDR诱导基因CYP24A1表达的影响，该基因可使1α，25（OH）失活2-D类三通过24-羟基化(23). 图3D​三维(右侧面板)表明1α，25（OH）2-D类三和LCA-醋酸盐强烈诱导人原代肝细胞中CYP24A1 mRNA的表达，AZD0530强烈阻断1α，25（OH）对CYP24A1mRNA的诱导2-D类三或LCA醋酸盐。作为阴性对照，这些VDR配体对甾醇27-羟基化酶（CYP27A1）的mRNA表达没有影响，该酶参与肝细胞胆汁酸合成（数据未显示）。这些结果支持c-Src参与膜VDR信号转导，调控CYP7A1公司和CYP24A1公司人类肝细胞中的基因表达。

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VDR配体对人原代肝细胞中酪氨酸磷酸化和VDR与c-Src相互作用以及CYP7A1 mRNA表达水平的影响。A、 血浆VDR酪氨酸磷酸化的IP测定。用载体（Veh，EtOH），1α，25（OH）处理原代人肝细胞2-D类三（50牛顿米)，LCA（10μ米)，LCA-醋酸盐（10μ米)，CDCA（20μ米)，或CA（20μ米)持续6小时。使用兔抗VDR抗体从细胞膜提取物（300μg）中免疫沉淀VDR。用小鼠抗磷酪氨酸（Anti-p-Tyr）检测VDR中的磷酸酪氨酸。保留细胞提取物（10%）作为输入。B、 维生素D受体与c-Src相互作用的Co-IP分析。用Veh，1α，25（OH）处理原代人肝细胞2-D类三（50牛顿米)或LCA-醋酸盐（10μ米)用小鼠抗VDR抗体处理细胞膜提取物（300μg）6 h，并用免疫沉淀物对使用兔抗c-Src和抗p-Y416/Y419-Src抗体的共沉淀c-Srcs进行免疫印迹分析。小鼠非免疫IgG作为阴性对照。保留细胞提取物（10%）作为输入。C、 C-Src抑制剂对质膜中VDR酪氨酸磷酸化的影响。用Veh，1α，25（OH）处理原代人肝细胞2-D类三（50牛顿米)，LCA-醋酸盐（10μ米)和/或c-Src抑制剂AZD0530（AZD）（5μ米)持续6小时。使用兔抗VDR抗体从细胞膜提取物（300μg）中免疫沉淀VDR。用小鼠抗磷酪氨酸（Anti-p-Tyr）检测VDR中的磷酸酪氨酸。用小鼠抗VDR抗体检测免疫沉淀VDR。保留细胞提取物（10%）作为输入。D、 c-Src抑制剂对CYP7A1影响的Q-RT-PCR分析(左侧面板)和CYP24A1(右侧面板)原代人肝细胞中mRNA的表达。用Veh，1α，25（OH）处理原代人肝细胞2-D类三（50牛顿米)，LCA-醋酸盐（10μ米)和/或AZD（5μ米)16小时#，统计显著差异(P（P）< 0.05; n=3），AZD处理与。车辆控制，或AZD和1α，25（OH）2-D类三（50牛顿米)或LCA-醋酸盐（10μ米)处理过的与。1α，25（OH）2-D类三（50牛顿米)或LCA-醋酸盐（10μ米). *, 统计显著差异(P（P）< 0.05; n=3），1α，25（OH）2-D类三（50牛顿米)或LCA-醋酸盐（10μ米)处理过的与。车辆控制。数据代表了使用不同供肝者（HH1479、HH1483和HH1493）的原代人肝细胞的三个单独实验之一。

ERK1/2抑制剂减弱LCA-醋酸盐和1α，25（OH）2-D类三人的抑制CYP7A1公司在人类肝细胞中

我们之前报道过LCA-醋酸盐和1α，25（OH）2-D类三被抑制的CYP7A1公司人肝细胞中的基因转录(14). 据报道，1α，25（OH）2-D类三信号快速激活骨、肠、肌肉、表皮和癌细胞等组织中的PKC、PKA、PI-3-激酶、AKT和MAPK通路(16,19). 研究1α，25（OH）2-D类三肝脏中的信号传导，并确定参与调节1α，25（OH）的激酶2-D类三信号调节CYP7A1公司利用人肝细胞中的基因、几种蛋白激酶抑制剂，研究其对LCA-醋酸盐或1α，25（OH）下调CYP7A1 mRNA表达水平的影响2-D类三在人类肝细胞中。图4A​4A级结果表明，在所有测试的抑制剂中，只有PD98059（ERK1/2抑制剂）和U0126（MEK1/2抑制剂2-D类三对人原代肝细胞中CYP7A1 mRNA表达的影响。人的瞬时转染试验CYP7A1公司利用启动子/荧光素酶报告子研究VDR配体和激酶抑制剂对报告子活性的影响。图4B​4B类结果表明，预处理PD98059和U0126，而非其他抑制剂，减弱了LCA-醋酸盐和1α，25（OH）的抑制作用2-D类三关于人类CYP7A1公司记者活动。作为阴性对照，这些抑制剂和VDR配体对人类没有任何影响CYP27A1号报告者活动（未显示数据）。这些结果表明，配体激活的VDR特异性激活MEK1/2/ERK1/2通路，以抑制CYP7A1公司人类肝细胞中的转录。

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1α，25（OH）的鉴定2-D类三和LCA激活的蛋白激酶参与抑制CYP7A1公司人类肝细胞中的基因转录。A、 实时PCR分析经激酶抑制剂处理的原代人肝细胞中CYP7A1 mRNA的相对表达。用每种抑制剂预处理原代人肝细胞1h，然后用1α，25（OH）处理2-D类三（50牛顿米)或LCA-醋酸盐（10μ米)24小时内，使用的蛋白激酶抑制剂为ERK1/2抑制剂PD98059（PD，40μ米)和MEK1/2 U0126（U，20μ米); JNK抑制剂，SP600125（SP，25μ米); p38抑制剂，SB203580（SB，20μ米); PKC抑制剂，Ro318220（Ro，2.5μ米); PKA抑制剂，H89（10μ米); 和PI3K抑制剂LY294002（LY，50μ米). B、 激酶抑制剂对HepG2细胞中CYP7A1启动子/荧光素酶报告活性影响的瞬时转染试验。将人CYP7A1/荧光素酶报告子phCYP7A1/-298-Luc转染到经PD（40μ米)，U（20μ米)，SP（25μ米)，SB（20μ米)Ro（2.5μ米)，H89（10μ米)，或LY（50μ米)1小时，然后用1α，25（OH）治疗2-D类三（5个米)或LCA-醋酸盐（5μ米)持续16 h。荧光素酶活性由β-半乳糖活性标准化。每个实验重复进行，同一个实验重复四次。乙醇被用作车辆控制。数据来自使用三个供体肝细胞（编号HH1467、HH1471和HH1472）进行的分析。*，统计显著差异(P（P）< 0.05; n=3），已处理与。车辆控制。RLU，相对灯光单位。

VDR配体激活人肝细胞中的c-Raf、MEK和ERK1/2

然后，我们使用免疫印迹分析来研究1α，25（OH）的影响2-D类三和LCA醋酸盐对原代人肝细胞中c-Raf、MEK1/2和ERK1/2磷酸化的影响。c-Raf是MEK1/2的上游血清激酶。图5A​5A级表明LCA-醋酸盐和1α，25（OH）2-D类三在10min内使c-Raf的丝氨酸磷酸化迅速，6h后达到最大值。类似地，LCA醋酸盐和1α，25（OH）2-D类三通过磷酸化时间依赖性激活ERK1/2（图5B​5B）。). 图5C​5摄氏度表明1α，25（OH）2-D类三或LCA-醋酸盐刺激MEK1/2的磷酸化，MEK1/2是ERK1/2的上游激酶。此外，LCA-醋酸盐和1α，25（OH）2-D类三-ERK1/2（PD98059）和MEK1/2（U0126）的特异性抑制剂可消除ERK1/2诱导的磷酸化，但JNK（SP600125）、p38（SB203580）和PKC（Ro318220）则无此作用（图5D​5D）。). 这些结果表明，VDR信号特异性激活了人肝细胞中的c-Raf/MEK1/2/ERK1/2通路。

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LCA-醋酸盐和1α，25（OH）的影响2-D类三原代人肝细胞中c-Raf、MEK1/2和MAPK的磷酸化。用1α，25（OH）处理原代人肝细胞2-D类三（50牛顿米)或LCA-醋酸盐（10μ米)在指定的时间内，分离细胞总蛋白提取物进行免疫印迹分析。A、 LCA-醋酸盐和1α，25（OH）作用的免疫印迹分析2-D类三c-Raf的丝氨酸磷酸化。用兔抗p-c-Raf和抗c-Raf抗体检测磷酸化c-Raf及c-Raf。B、 1α，25（OH）作用的免疫印迹分析2-D类三MAPKs ERK1/2上的LCA-醋酸盐。通过各自的抗体检测总ERK1/2和磷酸化ERK1/2。C、 1α，25（OH）作用的免疫印迹分析2-D类三和LCA-醋酸盐对MEK磷酸化的影响。通过各自的抗体检测磷酸化MEK和总MEK。D、 MAPK抑制剂对1α，25（OH）的影响2-D类三以及ERK1/2的LCA-醋酸盐活化。用ERK1/2抑制剂PD（40μ米)和U（20μ米)：JNK抑制剂，SP（25μ米); p38抑制剂，SB（20μ米); 或PKC抑制剂，Ro318220（Ro，2.5μ米)1小时，然后用1α，25（OH）治疗2-D类三（50牛顿米)或LCA-醋酸盐（10μ米)持续6 h。使用总ERK1/2或磷酸化ERK1/2抗体分离总细胞蛋白提取物进行免疫印迹分析。数据代表使用不同供体肝细胞（HH1467、HH1471、HH1742和HH1479）的四个单独实验之一。

ERK1/2磷酸化VDR和RXRα

为了进一步证实VDR配体依赖性磷酸化参与LCA醋酸盐和1α，25（OH）2-D类三人的抑制CYP7A1公司mRNA表达，一种丝氨酸磷酸酶抑制剂冈田酸（OA），与LCA-醋酸盐和1α，25（OH）一起用于治疗原代人肝细胞2-D类三虽然OA单独对CYP7A1 mRNA表达没有影响，但OA处理显著增强了LCA-醋酸盐和1α，25（OH）2-D类三抑制原代肝细胞中CYP7A1 mRNA的表达（图6A​6A）。). 这些数据进一步证明丝氨酸磷酸化参与了人类肝细胞中VDR信号的介导。我们还进行了免疫沉淀（IP）分析和在体外激酶分析以研究VDR/ERK1/2信号通路可能磷酸化人类原代肝细胞中的VDR、RXRα和HNF4α的可能性。HNF4α是一种主要的转录因子，参与CYP7A1公司基因。用U0126预处理细胞，然后用LCA-醋酸盐或1α，25（OH）处理2-D类三丝氨酸磷酸化通过小鼠单克隆抗磷酸化丝氨酸抗体（抗p-丝氨酸）检测。图6B​6亿表明LCA-醋酸盐或1α，25（OH）2-D类三诱导VDR和RXRα的丝氨酸磷酸化，但不诱导HNF4α，并且U0126阻止了此细胞检测中的磷酸化。我们还表现出高度敏感在体外ERK1/2分析。将从原代肝细胞分离的相同蛋白提取物与涂有抗磷酸-ERK1/2抗体的珠培养，以固定细胞提取物中活化的p-ERK1/2。使用含有活化ERK1/2的珠子在体外磷酸化在体外合成VDR、RXRα和HNF4α。使用抗磷脂抗体的免疫印迹分析表明，VDR和RXRα被活性ERK1/2磷酸化，U0126阻断了磷酸化（图6C​6C）。). 与IP试验相比，ERK试验表明ERK1/2能够磷酸化HNF4α。ERK1/2分析使用肝细胞中活化的ERK1/2磷酸化HNF4α。这种方法比IP分析更灵敏。已知HNF4α被许多激酶磷酸化，包括PKA、PKB、PKC和AMP活化蛋白激酶，磷酸化的HNF4 a具有较低的DNA结合、二聚化和反式激活活性（参考文献。24). 这些结果表明，LCA-醋酸盐和1α，25（OH）2-D类三诱导人肝细胞核VDR、RXRα和HNF4α的丝氨酸磷酸化。

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VDR配体对人肝细胞中CYP7A1 mRNA表达和VDR、RXRα和HNF4α磷酸化的影响。A、 蛋白磷酸酶抑制剂OA对人原代肝细胞CYP7A1 mRNA表达影响的Q-RT-PCR分析。用载体（Veh）、1α、25（OH）处理原代人肝细胞2-D类三（50牛顿米)，LCA-醋酸盐（10μ米)，和OA（40 n米)如所示，16小时后，从三个供体肝细胞（HH1479、HH1483和HH1493）收集数据。*，1α，25（OH）之间的统计显著差异2-D类三或LCA-乙酸酯处理和未处理；P（P）< 0.05; n＝3.#时，OA与1α，25（OH）之间的统计显著性差异2-D类三-或LCA-乙酸酯处理和未处理对照，P（P）< 0.05; n=3。B、 VDR、RXRα和HNF4α丝氨酸磷酸化的IP测定。用U（20μ米)1小时，然后是1α，25（OH）2-D类三（50牛顿米)或LCA-醋酸盐（10μ米)持续6小时。使用兔抗VDR、兔抗RXRα和山羊抗HNF4α抗体分别从总细胞蛋白提取物（300μg）中免疫沉淀VDR、RXRα和HNF4α。免疫印迹分析使用总抗体和丝氨酸磷酸化VDR、RXRα和HNF4α抗体。ERK1/2靶点ELK-1被监测为阳性对照。C、，体外ERK分析。用U（20μ米)1小时，然后用1α，25（OH）治疗2-D类三（50牛顿米)或LCA-醋酸盐（10μ米)将涂有抗磷酸化ERK1/2抗体的珠与细胞提取物（300μg）孵育，以在4℃下过夜固定磷酸化ERK1/2。珠子被用来磷酸化在体外合成VDR、RXRα和HNF4α。抗VDR、RXRα和HNF4α的抗体用于免疫沉淀各自的核受体。免疫印迹分析使用抗总VDR、磷酸化VDR、RXRα和HNF4α的抗体。ELK-1的ERK1/2磷酸化被监测为阳性对照。数据代表使用不同供体肝细胞（HH1479、HH1482和HH1483）的三个单独实验之一。定量实时PCR；U、 U0126。

VDR与HNF4α的配体依赖相互作用及辅活化剂和辅抑制剂的作用

我们之前报道过VDR与HNF4α相互作用(14). 为了进一步测试ERK1/2在介导VDR与HNF4α相互作用中的作用，将原代肝细胞与U0126孵育1h，然后用LCA-醋酸盐或1α，25（OH）处理2-D类三6 h，然后用抗HNF4α或抗VDR抗体免疫沉淀。图7A​第7章结果表明，经LCA-醋酸盐或1α，25（OH）预处理的原代肝细胞的细胞提取物中，VDR和HNF4α共免疫沉淀2-D类三U0126预处理阻断了这种相互作用，表明ERK1/2介导的VDR和HNF4α磷酸化可能刺激VDR和H2NF4α相互作用。我们使用哺乳动物双杂交试验进一步研究VDR与辅活化剂和辅抑制剂的相互作用。图7B​7亿表明Gal4-VDR和VP16-HNF4α的相互作用依赖于VDR配体。过氧化物酶体增殖物激活受体-γ辅激活因子1α（PGC-1α）和类固醇受体辅激活因子1（SRC-1）强烈刺激相互作用，而核受体辅激活因子1（NCoR-1）和类视黄醇和甲状腺激素受体沉默介体（SMRT）在VDR配体存在下强烈抑制VDR和HNF4α相互作用。图7C​7摄氏度显示Gal4-VDR没有与VP16-NCoR-1或VP16-SMRT交互。有趣的是，当RXRα共转染时，Gal4-VDR以VDR配体依赖的方式与VP16-NCoR-1和VP16-SMRT相互作用。这些数据表明，VDR不与NCoR-1和SMRT相互作用，并且NCoR-1或SMRT以VDR配体依赖的方式抑制VDR与HNF4α、PGC-1α和SRC-1的相互作用。

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VDR与HNF4α、RXRα、辅活化剂和辅抑制剂的配体依赖性相互作用。A、 ERK1/2通路抑制剂对VDR和HNF4α相互作用的影响。用U（20μ米)1小时，然后用1α，25（OH）治疗2-D类三（50牛顿米)或LCA-醋酸盐（10μ米)持续6小时。使用抗HNF4α或抗VDR抗体在细胞提取物（300μg）中免疫沉淀VDR和HNF4α。免疫印迹法检测共免疫沉淀VDR和HNF4α。B、 VDR和HNF4α相互作用的哺乳动物双杂交分析以及辅活化剂和辅抑制剂的作用。如图所示，将0.1μg Gal4-VDR和VP16空载体pcDNA3.1、VP16-HNF4α、PGC-1α、SRC-1、NCoR-1和/或SMRT转染Gal4报告基因构建体p5XUAS-TK-Luc（0.2μg）到HEK293细胞中。转染24 h后，用载体（EtOH）、1α、25（OH）处理细胞2-D类三（10个米)或LCA-醋酸盐（5μ米)收获前16小时。实验一式两份，同一实验重复三次。*，统计显著差异(P（P）<0.05，n=3）Gal4-VDR与PGC-1α、SRC-1或VP16-HNF4α共转染与。Gal4-VDR与VP16空载体或pcDNA3.1.#共转染，统计显著差异(P（P）< 0.05; n=3）Gal4-VDR和VP16-HNF4α与PGC-1α、SRC-1、SMRT或NCo-R-1共转染与。Gal4-VDR和VP16-HNF4α与pcDNA3.1共转染。C、 哺乳动物双杂交分析RXRα对VDR与NCoR-1、SMRT或SRC-1相互作用的影响。如图所示，GAL4报告基因构建体p5XUAS-TK-Luc（0.2μg）与0.1μg GAL4-VDR、RXRα、VP16空载体、pcDNA3.1、VP16-NCoR-1、VP16-SMRT和/或VP16-SRC-1共同转染到HEK293细胞中。转染24 h后，用载体（Veh，EtOH），1α，25（OH）处理细胞2-D类三（10个米)或LCA-醋酸盐（5μ米)收获前16小时。*，统计显著差异(P（P）<0.05，n=3）Gal4-VDR与VP16-SRC-1共转染与。Gal4-VDR与VP16空载体共转染。#，统计显著差异(P（P）<0.05，n=3），与VP16-NCoR-1、VP16-SMRT或VP16-SRC-1共转染的Gal4-VDR和RXRα与。Gal4-VDR和RXRα与VP16空载体共转染。所有转染实验重复进行，同一实验重复三次。RLU，相对光单位；U、 U0126。

VDR是CYP24A1公司人肝细胞中的基因转录

以前我们报道配体激活的VDR可诱导人肝细胞中CYP24A1 mRNA的表达(14). 为了进一步证实VDR能正向调节人类肝细胞中已知的VDR诱导基因，我们在HepG2细胞中进行了CYP24A1报告活性的瞬时转染试验。图8A​第8页表明通过LCA-醋酸盐或1α，25（OH）激活VDR2-D类三强烈刺激人CYP24A1/Luc报告活性。与PGC-1α共转染可诱导CYP24A1报告酶活性增加2倍，因为PGC-1是VDR的辅活化因子。另一方面，与NCoR-1或SMRT联合转染可使报告人活性降低60%以上。应该注意的是，CYP24A1 VDR诱导的共激活剂和共升压剂作用都依赖于VDR配体。相反，配体激活的VDR/RXRα抑制CYP7A1/Luc报告活性（图8B​8B）。). 在缺乏VDR配体的情况下，PGC-1α诱导CYP7A1报告活性。PGC-1α是HNF4α的有效辅活化剂，HNF4是CYP7A1的关键正调控因子。只有当VDR被其配体激活时，NCoR-1和SMRT才能强烈抑制CYP7A1报告活性。这些结果表明VDR对CYP24A1公司人类肝细胞中的基因转录。

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共激活剂和共抑制剂对CYP24A1和CYP7A1启动子报告活性影响的瞬时转染试验。A、 人类CYP24A1启动子/荧光素酶报告子的报告者分析，phCYP24A1/-1200-Luc。B、 人类CYP7A1启动子/荧光素酶报告子的报告分析，ph-1887Luc。报告质粒（0.2μg）与VDR（0.1μg）和RXRα（0.1μg）表达质粒或对照质粒（pcDNA3.1）以及PGC-1α、NCoR-1和SMRT表达质粒（0.1μc）共转染HepG2细胞24 h，然后用1α、25（OH）处理2-D类三（5个米)或LCA-醋酸盐（10μ米)或载体（EtOH）再放置24小时。荧光素酶活性按材料和方法每个实验一式三份，用平均值±标准偏差.*，统计显著差异(P（P）<0.05，n=3）与。车辆控制与相同的共同改造。#，统计显著差异(P（P）<0.05，n=3）与。pcDNA3共同转染样品，处理相同。RLU，相对灯光单位。

MEK1/2/ERK1/2抑制剂阻断VDR与HNF4α的相互作用和协同调节因子的招募CYP7A1公司发起人

我们之前报道过LCA或1α，25（OH）2-D类三刺激VDR、NCoR-1和SMRT占用，但抑制HNF4α、PGC1α和GRIP-1占用CYP7A1公司发起人(14). 在此，我们进一步研究了U0126对VDR配体诱导的CYP7A1染色质结构改变的影响，以证实MEK1/2/ERK1/2通路在介导VDR信号传导中的作用。图9A​9安表明1α，25（OH）2-D类三人类VDR和RXRα占有率增加CYP7A1公司启动子增加约4倍，但HNF4α占用率降低约50%。LCA-醋酸盐使VDR和RXRα的占有率增加了约10倍，但HNF4α的占有量减少了50%以上。1α，25（OH）2-D类三和LCA-醋酸盐使共抑制因子NCoR-1和SMRT的招募增加了约2-4倍，但使辅活化因子PGC-1α的招募减少了约80-90%。U0126显著降低1α，25（OH）2-D类三或LCA-乙酸酯刺激VDR、RXRα、NCoR-1和SMRT的招募，并将HNF4α和PGC-1α招募增加至CYP7A1公司发起人。这些结果证实了MEK1/2/ERK1/2通路参与VDR信号转导，促进VDR/RXRα异二聚体招募共升压因子以取代VDR/HNF4α和辅活化因子复合物CYP7A1公司发起人。

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与人相关的核受体和辅因子的ChIP测定CYP7A1公司启动子（A）和CYP24A1启动子（B）。用U0126（U）（20μ米)1小时，然后用1α，25（OH）治疗2-D类三（50牛顿米)或LCA-醋酸盐（10μ米)持续16 h。使用兔抗VDR、抗RXRα和抗HNF4α抗体以及山羊抗PGC-1α、抗NCoR-1和抗SMRT抗体免疫沉淀染色质片段。非免疫IgG作为阴性对照。留出细胞提取物（5%）作为输入。A、 Taqman引物集探针设计用于Q-PCR检测人类CYP7A1公司启动子区包含BARE-II和BARE-III（HNF4α和VDR/RXRα结合位点）和内含子5（+9127至+9193）（阴性对照），如材料和方法设计.B，Tagman引物集探针用于Q-PCR检测人类CYP24A1启动子近端区域的VDRE。数据来自使用三个供体肝细胞（HH1460、HH1479和HH1483）进行的分析。*，统计显著差异(P（P）< 0.05; n=3）与。车辆（Veh）控制#，统计显著差异(P（P）< 0.05; n=3）与。LCA-醋酸盐或1α，25（OH）2-D类三治疗。

我们还进行了类似的染色质免疫沉淀（ChIP）分析，以检测VDR和与CYP24A1启动子结合的辅激活子。图9B​9亿表明1α，25（OH）2-D类三或LCA-醋酸盐增加人体VDR和RXRα的占有率CYP24A1公司发起人。与CYP7A1相比，这些VDR配体增加了HNF4α对CYP24A1启动子的占有率。我们在人原代肝细胞中进行了腺病毒介导的HNF4α基因转导，发现腺苷-HNF4α不影响CYP24A1 mRNA，但强烈诱导CYP7A1 mRNA表达（数据未显示）。正如我们之前报道的那样，HNF4α很可能与VDR相互作用作为辅活化因子(14). 1α，25（OH）2-D类三和LCA-醋酸盐增加了协同抑制剂NCoR-1和SMRT对CYP24A1启动子的招募，但对PGC-1α结合没有太大影响。有趣的是，U0126对VDR、RXR、HNF4α、PGC-1α、NCoR-1和SMRT向CYP24A1启动子的募集没有影响，但显著降低了NCoR-2和SMRT对CYP24Al启动子的招募。因此，膜VDR/MEK1/2/ERK1/2 MAPK信号通路也参与VDR招募共抑制因子以抑制CYP24A1基因转录。总之，这些结果表明，配体激活的VDR可以通过向VDR/RXR异二聚体募集共激活因子和共抑制因子来正向或负向调节其在人类肝细胞中的靶基因转录。然而，CYP24A1的诱导和CYP7A1的抑制涉及不同的机制（参见讨论).

讨论

在这项研究中，我们发现了一种新的膜VDR信号通路，可能参与抑制CYP7A1公司胆汁酸在人肝细胞中的基因转录。与其他组织和细胞一样，VDR在人类肝细胞中具有基因组和非基因组作用。膜VDR信号的非基因组作用是对细胞刺激的一种非常快速的反应（在几分钟或几秒钟内），以激活细胞信号通路，而VDR的基因组作用是一种相对较慢的反应（几分钟到几小时）通过VDR与RXR的二聚化以及向基因启动子招募辅激活剂和/或辅抑制剂来调节靶基因转录速率，从而与激素配体结合(25). 图10​10阐明了VDR信号通路抑制人类肝细胞中CYP7A1基因表达的协调基因组和非基因组作用的拟议分子机制。VDR配体1α，25（OH）2-D类三或LCA刺激VDR的酪氨酸磷酸化和c-Src的活化。酪氨酸磷酸化的VDR与活化的c-Src形成复合物，其从细胞质转移到质膜的小窝亚结构域。配体激活的VDR也独立于酪氨酸激酶途径转位到细胞核。VDR/c-Src可能通过Shc/Grb2/Sos复合物激活G蛋白、Ras和c-Raf（Raf-1）(19). c-Raf激活MEK1/2/ERK1/2 MAPK通路，然后磷酸化核VDR、RXRα和HNF4α。在该模型中，配体激活的VDR/RXRα招募共升压因子NCo-R1和SMRT取代HNF4α和共活化因子PGC-1α和SRC-1复合物与BARE结合，并导致抑制CYP7A1公司基因转录。已经证实HNF4α同型二聚体与BARE结合，并与CYP7A1启动子上的PGC-1α和SRC-1相互作用，以刺激CYP7A1公司基因转录(1). 已知HNF4α的磷酸化可降低其二聚化和DNA结合活性(24)，从而允许VDR/RXR/NCoR-1/SMRT绑定到BARE。VDR和HNF4α也可能竞争辅活化子，或者VDR可能与HNF4β相互作用以阻止HNF4 a二聚化并与BARE结合。所有这些机制都可能抑制CYP7A1公司基因转录。

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一卡通说明了VDR信号在抑制人类肝细胞中CYP7A1基因转录中的基因组和非基因组作用。VDR配体，1α，25（OH）2-D类三或LCA刺激VDR向两个质膜的细胞内移位。VDR配体诱导VDR的酪氨酸（Y）磷酸化并激活c-Src。VDR与质膜中的c-Src相互作用。膜VDR信号可能通过激活Shc/Grb2/Sos复合物和Ras（数据未显示）激活c-Raf，随后激活MEK1/2/ERK1/2 MAPK通路。VDR也通过与热休克蛋白70的相互作用转移到细胞核，不依赖于酪氨酸激酶途径。ERK1/2转位到细胞核，随后磷酸化核VDR、RXRα和HNF4α上的丝氨酸/苏氨酸（S/T）残基。VDR/RXRα招募共升压因子NCoR-1或SMRT到BARE，以取代HNF4α/VDR/PGC-1α或SRC-1复合物，并导致其失活CYP7A1公司基因。值得注意的是，NCoR-1/SMRT被招募到与配体激活的VDR二聚体化的RXRα中。VDR与HNF4α相互作用，阻止HNF4α二聚化并与BARE结合。

已确定1α，25（OH）2-D类三通过激活激活细胞内钙的酪氨酸磷酸化-信号通路发挥快速生物反应2+-活化蛋白激酶级联导致细胞增殖、分化、凋亡、肌肉生长和免疫反应(19). 酪氨酸激酶的Src家族在控制各种细胞过程中起着关键作用，包括细胞粘附、增殖、存活和运动(26). c-Src的酪氨酸激酶活性主要受人c-Srcs上两个主要酪氨酸磷酸化位点的磷酸化调节：一个位于酪氨酸激酶结构域（Y419），另一个位于c末端（Y530）。Src与Y530结合的SH2结构域保持非活性构象。Y530的去磷酸化破坏了SH2结构域和Y530之间的分子内相互作用，导致Y419的自磷酸化和c-Src的活化。c-Src通过SH2结构域与生长因子受体酪氨酸激酶结合，导致Y530移位，从而使Y419磷酸化并激活c-Src。在本研究中，我们证明LCA-醋酸盐或1α，25（OH）2-D类三能够刺激VDR的酪氨酸磷酸化。VDR与c-Src结合可能导致人c-Src-Y419的自磷酸化并激活c-Src-。我们还提供了VDR和c-Src在质膜中相互作用的证据。此外，一种特异性c-Src抑制剂AZD0530降低了VDR磷酸化和LCA醋酸盐和1α，25（OH）的抑制作用2-D类三抑制CYP7A1 mRNA表达，并消除其对人肝细胞中CYP24A1表达的刺激作用。这些结果与c-Src在人肝细胞膜VDR信号传导中的参与一致，如在肌肉和肿瘤细胞中。已知VDR信号能够刺激骨、肠和肌肉细胞中的多种信号通路，包括AKT、ERK1/2、p38和JNK1/2激酶(18,19,27,28). 有趣的是，我们的结果表明，膜VDR信号仅激活人类肝细胞中的MEK1/2/ERK1/2，而不激活PKA、PKB、PKC、p38和JNK通路。人类肝细胞中的VDR信号具有高度特异性，可能仅限于肝细胞中细胞的增殖和分化。

核受体招募辅活化因子和辅抑制因子来调节靶基因转录。CYP24A1公司是一个特征良好的VDR靶基因，由1α，25（OH）高度诱导2-D类三激动剂或配体与VDR结合，并在配体结合域中诱导构象变化，以暴露辅激活剂结合表面，从而允许辅激活剂的结合。配体激活的VDR与RXR形成异二聚体，并与规范的DR3（由三个核苷酸间隔的直接重复）型VDR反应元件（VDRE）结合，诱导CYP24A1公司基因转录(29,30). 然而，VDR的转阻遏机制尚不清楚，也存在争议。VDR已被证明与共压制物相互作用，如NCoR-1、SMRT、Alien和Hairless(31,32,33). 据报道，未连接的VDR与SMRT上的二部分核受体相互作用域相互作用，并与VDRE结合以抑制24A1日历年基因转录，而配体与VDR的结合消除了VDR向VDRE招募SMRT并招募辅激活剂来刺激CYP24A1公司基因转录(33). 这一机制与最近的一份报告形成对比，该报告称，与VDR结合的激动剂或配体增强了VDR与RXR的二聚化，并在VDRE上同时招募辅抑制因子和辅激活因子CYP24A1公司发起人(34). 不同组织中存在的辅激活物和辅抑制物的相对数量可能决定VDR靶基因在不同组织中的表达水平。

这项研究表明VDR的功能是抑制CYP7A1公司基因及其激活物CYP24A1公司人类肝细胞中的基因。与CYP24A1公司基因CYP7A1公司启动子没有DR3型VDRE。取而代之的是1α，25（OH）2-D类三或LCA激活的VDR/RXRα与人类BARE-I和BARE-II（也是HNF4α位点）结合CYP7A1公司近端启动子(14). 在本研究中，我们发现VDR仅在RXRα和1α，25（OH）时与NCoR-1或SMRT相互作用2-D类三或存在LCA（图7C​7C）。). 这与模型一致，即当VDR激动剂激活时，RXRα（而非VDR）向VDR/RXRα异二聚体招募共抑制剂(34). 研究表明，VDR激动剂诱导了VDR螺旋12的构象变化，随后改变了RXRα上AF2结构域的构象，从而暴露了共加压素结合表面。这种主动阻遏机制与1α，25（OH）所涉及的机制不同2-D类三反馈抑制1α-羟化酶（CYP27B1），一种参与1α，25（OH）活化的酶2-D类三。中确定的阴性VDRECYP27B1型该启动子具有一个E-box序列，该序列结合一个名为VDR-interacting receptor的基本螺旋环螺旋蛋白，该受体招募配体激活的VDR/RXR、辅升压因子和William Syndrome转录因子来抑制CYP27B1型基因转录(35). VDR似乎与不同的VDRE绑定以进行监管CYP7A1公司,CYP24A1公司、和CYP27B1型不同机制的基因表达。此外，1α，25（OH）2-D类三信号可能通过组蛋白乙酰化和DNA甲基化的表观遗传机制调节基因转录(35,36).

已知胆汁酸可激活肝细胞中的几种细胞信号通路，如FGF受体4、Fas受体、表皮生长因子受体、Gαi蛋白偶联受体和TNF受体(2). 这些信号通路激活JNK、ERK和p38 MAPK通路来调节胆汁酸和葡萄糖代谢。在本研究中，我们发现了一种新的胆汁酸激活的膜受体VDR，它可能通过c-Src/ERK通路与胆汁酸活化的生长因子受体信号相互作用。最近，Gαs蛋白偶联受体TGR5（M-BAR）被鉴定为膜胆汁酸受体(37). 虽然TGR5与各种游离和结合胆汁酸结合，但LCA和牛磺酸结合LCA是TGR5最有效的活化剂(37,38). TGR5和VDR信号激活不同的通路并具有不同的生理功能。TGR5激活调节棕色脂肪组织能量代谢的cAMP/PKA信号(39). TGR5在许多组织中广泛表达，但在肝细胞中不表达(38).

总之，本研究确定了一种新的胆汁酸激活的VDR信号通路，该通路抑制CYP7A1公司通过基因组和非基因组作用在人类肝细胞中进行基因转录。配体激活的VDR从细胞质转移到质膜和细胞核。VDR-依赖性信号特异性激活c-Raf/MEK1/2/ERK1/2通路以抑制CYP7A1公司人类肝细胞中的基因转录。膜VDR信号通路的LCA激活可能是对胆汁淤积期间人类肝细胞中胆汁淤滞胆汁酸突然增加的快速反应，以抑制胆汁酸合成并保护肝脏免受胆汁淤血损伤。LCA衍生物可能是具有治疗肝脏疾病潜力的选择性VDR调节剂(40).

材料和方法

材料

人类CYP7A1报告基因phCYP7A1/-298和phCYP17A1-1887以及人类CYP27A1报告基因phCYP27A1/-1774的构建如前所述(41,42,43). 人类CYP24A1/荧光素酶报告基因phCYP24A1/-1200-Luc（核苷酸−1200至+120）由P.MacDonald博士（俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学医学院）善意提供。

人类VDR表达质粒（pcDNA3.1/VDR）由伊利诺伊州芝加哥大学Y.C.Li博士提供。LCA、CA和CDCA购自Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯市）。LCA-醋酸盐来自Steraloids，Inc.（新港，RI）。ERK1/2（PD98059）、MEK1/2（U0126）、JNK（SP600125）、p38（SB203580）、PKC（Ro318220）、PKA（H89）和PI3K（LY294002）的特定抑制剂从EMD Chemicals，Inc.（新泽西州吉布斯敦）获得。c-Src抑制剂AZD0530购自Selleck Chemicals LLC（中国上海）。蛋白磷酸酶抑制剂冈田酸购自Sigma-Aldrich。兔（sc-1009）和小鼠（sc-13133）抗VDR，兔（sc-533）和小鼠，和小鼠抗磷酸化酪氨酸抗体购自Santa Cruz Biotechnology，Inc.（加州圣克鲁斯）。老鼠抗攀爬剂购自Abcam，Inc.（马萨诸塞州剑桥市）。小鼠抗磷酸化丝氨酸抗体购自GE Healthcare Bio-Sciences Corp.（新泽西州皮斯卡塔韦）。兔抗磷酸化ERK1/2（Thr202/Tyr204）、JNK（Thr183/Tyr185）、p38（Thr180/Tyr182）、MEK1/2（Ser217/221）、c-Raf（Ser338）、c-Src（Tyr416）和ELK-1（Ser383）抗体购自Cell Signaling Technology，Inc.（纽约州普莱西德湖）。

细胞培养

人类肝母细胞瘤细胞系HepG2（美国型培养收集，弗吉尼亚州马纳萨斯）如前所述进行培养(44). 从人类供体中分离出原始人类肝细胞，并通过美国国立卫生研究院的肝组织和细胞分布系统获得（宾夕法尼亚州匹兹堡大学S.Strom博士）。如前所述，将细胞保存在肝细胞维持培养基中(44).

免疫荧光显微镜

用载体（EtOH）、1α、25（OH）处理原代人肝细胞2-D类三（50牛顿米)，LCA（10μ米)，LCA-醋酸盐（10μ米)或胆酸（25μ米)用4%多聚甲醛固定细胞6小时，用0.2%Triton X-100渗透。用兔抗VDR抗体（Santa Cruz）和Alexa Fluor 488-结合抗兔IgG抗体（Molecular Probes，Carlsbad，CA）检测VDR。使用小鼠抗veolin-1抗体（Abcam，Inc.）和Alexa Fluor 546结合的抗鼠IgG抗体（分子探针）检测小窝蛋白-1。细胞核用TO-PRO-3（分子探针）染色。染色细胞在共焦显微镜下成像，奥林巴斯Fluoview FV300（奥林巴斯，中心山谷，宾夕法尼亚州）。

瞬时转染试验

HepG2细胞在24孔组织培养板中生长到约80%的汇合处，并用LCA-醋酸盐（甾体）或1α，25（OH）处理2-D类三（开曼化学公司，密歇根州安阿伯）。按照制造商的指示，使用Tfx-20试剂（威斯康星州麦迪逊市Promega公司）将荧光素酶报告子和表达质粒转染到HepG2细胞中。如前所述进行荧光素酶报告分析(41). 检测重复进行，每个实验重复至少四次。数据表示为平均值±标准偏差.

RNA分离和实时定量PCR

原代人肝细胞在无血清培养基中保存过夜。用1α，25（OH）处理细胞2-D类三或LCA-醋酸盐，用量和时间如图所示。使用Tri-Reagent（Sigma-Aldrich）分离总RNA。使用RETROscript试剂盒（德克萨斯州奥斯汀Ambion）进行反转录反应。如前所述，对相对mRNA表达进行实时定量PCR（Q-PCR）分析(44)使用ABI PRISM 7500序列检测器（Applied Biosystems，Foster City，CA）。TaqMan PCR引物和探针是从TaqManGene Expression Assays（Applied Biosystems）中订购的。使用序列检测器1.7版软件（Applied Biosystems）分析数据。采用Applied Biosystems推荐的ΔΔCt方法计算相对mRNA表达水平（1997年第2号用户公告）。所有PCR重复进行，每个反应至少重复四次。

蛋白质提取和免疫印迹分析

为了分离总细胞蛋白提取物，在改良的放射免疫沉淀分析缓冲液（50 m）中溶解原代人肝细胞（在T25烧瓶中）米三重HCl，1%Nonidet P-40，0.25%脱氧胆酸盐，150 m米氯化钠，1米米含蛋白酶抑制剂（1 m）的EDTA米苯甲基磺酰氟、1μg/ml抑肽酶、1μg/ml胃蛋白酶抑制素；Sigma-Aldrich）30分钟。按照制造商的说明，使用核提取试剂盒（Millipore Corp.，Billerica，MA）分离细胞质和核部分。按照制造商的说明，使用质膜蛋白提取试剂盒（加州山景城Biovision公司）分离质膜组分。使用特异性抗体对蛋白质样品进行SDS-PAGE免疫印迹分析，并通过增强化学发光检测试剂盒（GE Healthcare Bio Sciences Corp.）进行检测。

IP和co-IP分析

T25烧瓶中的原代人肝细胞在无血清培养基中保存过夜，并用所示的各种化合物处理。对于IP分析，细胞蛋白提取物（300μg）与10μg兔抗VDR、兔抗RXRα或山羊抗HNF4α（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）在4℃下孵育过夜，然后与蛋白A琼脂糖珠额外孵育2小时。然后用1×PBS冷洗三次珠，在2×蛋白质负载缓冲液中煮沸5分钟，然后进行SDS-PAGE，然后用小鼠抗磷脂、小鼠抗磷脂酰肌醇（GE Healthcare Bio-Sciences Corp.）、小鼠抗VDR、小鼠抗RXRα和兔抗HNF4α抗体（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）进行免疫印迹分析。对于VDR与HNF4α相互作用的co-IP分析，使用兔抗VDR或山羊抗HNF4β抗体在细胞蛋白提取物中共免疫沉淀VDR和HNF4 a。用小鼠抗VDR或兔抗HNF4α抗体检测共沉淀VDR或HNF4β。对于VDR与c-Src相互作用的co-IP分析，使用抗VDR联用免疫沉淀膜蛋白提取物中的VDR和c-Src.并使用兔抗c-Src-和抗磷酸Src（Y416/Y419）抗体分别检测免疫沉淀剂中的c-Src/和p-Y416/Y419-c-Src。

体外ERK1/2分析

p44/42（ERK1/2）MAPK检测试剂盒（Cell Signaling Technology，Inc.）用于研究在体外根据制造商的说明，ERK1/2对VDR、RXRα和HNF4α进行丝氨酸磷酸化。简单地说，将15μl涂有抗磷酸ERK1/2抗体的珠与300μg总细胞提取物孵育，以固定磷酸-ERK1/2。在4℃下轻轻摇晃过夜后，将含有活性p-ERK1/2的固定化小球以5000×克30秒，然后用冷的1×细胞裂解缓冲液洗涤两次，用1×激酶缓冲液洗涤二次。将洗净的珠子悬浮在50μl 1×激酶缓冲液中，补充200μl米ATP，然后与在体外使用转录和翻译（TNT）裂解物系统（Promega）在30℃下合成VDR、RXRα或HNF4α30分钟。通过添加25μl 3×SDS样品缓冲液终止激酶磷酸化反应。VDR、RXRα和HNF4α通过各自的抗体（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）免疫沉淀6小时。VDR、R XRα或HNF4 a中丝氨酸残基的磷酸化通过小鼠抗磷酸抗体（GE Healthcare Bio-Sciences Corp.）检测。ERK1/2分析试剂盒中包含的纯化ELK-1作为阳性对照进行分析。

哺乳动物双杂交试验

报告质粒p5xUAS-TK-Luc包含5个上游激活序列（UAS）拷贝，融合到胸苷激酶（TK）启动子上游，荧光素酶报告基因用于哺乳动物双杂交检测(14). Gal4-VDR与VP16空载体pcDNA3.1、VP16-HNF4α、VP16-NCoR-1、VP16-SMRT、VP16_SRC-1、RXRα、PGC-1α、SRC-1、SMRT或NCoR-1共转染入人类胚胎肾（HEK）293细胞。报告者活性按上述方法进行分析。

ChIP分析

将T25烧瓶中的原代人肝细胞保存在无血清培养基中过夜，然后使用或不使用ERK1/2抑制剂（U）培养1h，然后使用载体（EtOH）、1α、25（OH）进行处理2-D类三（50牛顿米)或LCA-醋酸盐（10μ米). 根据制造商的方案，使用ChIP分析试剂盒（Millipore Corp.）进行ChIP分析。细胞在1%甲醛中交联并超声处理。使用兔抗VDR、兔抗RXRα、兔抗HNF4α、山羊抗PGC-1α、山羊抗NCoR-1或兔抗SMRT抗体（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）沉淀蛋白质-DNA复合物。添加兔非免疫IgG作为阴性对照。Q-PCR用于量化CYP7A1启动子区域BARE-I+BARE-II，该区域以前被鉴定为HNF4α结合位点，也结合VDR/RXRα(14)，根据前面描述的方法(45). CYP7A1BARE-II启动子TaqMan实时PCR引物集（Applied Biosystems）：正向引物5-GGTCTGTGTTGGAACC；反向引物5-AAAAGTGGTTAGTAACTGGCCTTGAA；TaqMan探针：TTCTGATACCTGTGGACTTA；内含子5引物组（核苷酸8127-8195），正向引物，5-TTTCTTCTGGGACCTTTCTC，反向引物，5-TCCTATCCTGTGAACGATTAGTT；TaqMan探头：CTAGCTCTGCTGCCTGACTAA。

对于VDRE与人CYP24A1启动子结合的ChIP测定，Q-PCR被设计用于检测包含两个明确定义的VDRE的区域(-285-AGTTCACCGGTGTG公司-299和-164AGGTCAGCGCGCG公司-178) (34). CYP24A1启动子的TaqMan实时PCR引物集：正向引物：−30，ATGGTCCTGGGCATAGGA。

反向引物：+24，GCTGGCGCTGCGTTTC；MGB探头：CATGGAGACAGGA。

统计分析

所有结果均表示为平均值±标准偏差用Student’st吨测试。P（P）<0.05的值被认为是治疗组和未治疗组之间具有统计学意义的差异。

鸣谢

人类原代肝细胞由美国国立卫生研究院糖尿病、消化和肾脏疾病研究所肝组织和细胞分布系统提供（#N01-DK-7-0004/HHSN267200700004C）。

脚注

这项研究得到了国家卫生拨款研究所DK44442和DK58379（发给J.Y.L.C.）以及DK92310（发给S.S.）的支持。

披露摘要：作者确认了本研究的原创性，并披露了本研究没有利益冲突。

2010年4月6日首次在线发布

缩写：BARE，胆汁酸反应元件；CA，胆酸；CDCA，鹅去氧胆酸；联合免疫沉淀；CYP7A1，胆固醇7α-羟化酶；CYP24A1，甾醇24-羟化酶；CYP27B1，固醇1α-羟化酶；CYP27A1，甾醇27-羟化酶；ERK，细胞外信号调节激酶；FXR，法尼类X受体；HEK，人胚胎肾；肝细胞核因子；免疫沉淀；LCA，石胆酸；MEK、MAPK/ERK激酶；NCoR-1，核受体辅阻遏物-1；OA，冈田酸；1α，25（OH）2-D类三，1α，25-二羟基维生素D三; 过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅活化因子；磷酸肌醇-3激酶；蛋白激酶A；蛋白激酶C；Q-PCR，实时定量PCR；RXRα，维甲酸X受体α；视黄醇和甲状腺的沉默介质SMRT；类固醇受体辅活化因子-1；TK，胸苷激酶；UAS，上游激活序列；维生素D受体；VDRE，VDR响应元件。

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文章来自分子内分泌学由以下人员提供美国内分泌学会