从培养的人类恶性细胞中产生iPSC

摘要

介绍

肿瘤是在特定的发育状态下通过获得癌基因和抑癌基因的突变而发展的。致癌突变通常以组织或细胞类型特异性的方式被观察到。¹同样，在遗传性癌症综合征中，尽管所有体细胞中都存在突变的癌症基因，但患者在特定组织中容易发生肿瘤。这表明癌症相关突变的效果受到特定细胞状态的高度影响，包括细胞环境和分化。研究致癌突变与不同组织类型相互作用的一种方法是对已建立的癌细胞系进行重新编程，使其具有多能性。虽然这已经通过核移植在实验诱导小鼠肿瘤的细胞系中实现，²由于技术限制，这一过程没有应用于人类癌症。通过转录因子组合的表达重新编程分化细胞类型的最新进展^三,4已允许诱导多能干细胞（iPSCs）从各种类型的细胞中生成，包括造血谱系的细胞。^5,6然而，到目前为止，人类肿瘤细胞还没有实现这一目标。

方法

详细方法见补充方法数据（可从血液网站；请参阅在线文章顶部的补充材料链接）。所有动物实验均由怀特黑德研究所动物护理委员会批准。

结果和讨论

为了解决人类癌细胞是否可以重新编程为iPSC，我们使用了来自急变期慢性髓细胞白血病（CML）的KBM7细胞。⁷使用KBM7细胞的近二倍体亚克隆携带费城易位。我们用表达4种重编程因子的逆转录病毒感染KBM7细胞：华侨城4号,SOX2标准,c-MYC公司、和KLF4型21天后，具有典型胚胎干（ES）细胞形态的罕见菌落扩大。两种癌源性iPS细胞系KBM7-iPS1和KBM7-iPS2生长为粘附的扁平集落(图1A） 进一步表征。KBM7-iPS1和KBM7-iPS2表达ES细胞标记物碱性磷酸酶、CD9、Tra-1-81和OCT4，并失去造血标记物CD43的表达(图1A） ●●●●。逆转录聚合酶链反应显示，重组克隆表达REX1型,FGF4类,TDGF1型,NANOG公司,GDF3型,第28行、和ZIC3型以及内源性转录物华侨城4号和SOX2标准水平与人类ES细胞相似(图1B） ●●●●。泛造血标志物CD43和CD45均不再表达(图1B类；补充图1）。这些癌源性iPSC不同于正常细胞产生的多能干细胞，这一点可以从表达BCR-ABL公司致癌基因(图1B类；补充图2）及其异常核型表明染色体不稳定（补充图2。到目前为止，对其他CML细胞系进行重新编程的尝试尚未成功（数据未显示）。

在单独的窗口中打开

图1

人KBM7白血病细胞衍生iPSCs的产生（A）介绍c-MYC公司,华侨城4号,SOX2标准、和KLF4型进入KBM7细胞导致形成罕见的粘附集落，显示出与人类胚胎干细胞（ES）形态相似以及高碱性磷酸酶活性。重新编程的KBM7细胞均染多能性标记物Tra-1-81、OCT4和CD9，但未染造血CD43（绿色免疫荧光；蓝色核复染）。（B） 从KBM7细胞、重编程KBM7细胞和人ES细胞中分离总RNA，并通过逆转录聚合酶链反应分析人ES细胞特征转录物的表达雷x1,FGF4类、和TDGF1型，内源性华侨城4号和SOX2标准,NANOG公司,GDF3型,第28行、和ZIC3型，造血特异性转录物CD43细胞和CD45型和CML特定BCR-ABL公司融合转录本。（C） 非肥胖糖尿病严重联合免疫缺陷（NOD-SCID）小鼠皮下注射癌诱导多能干细胞（iPSCs；KBM7-iPS2）导致畸胎瘤形成。肿瘤的苏木精和伊红染色切片（i，原始放大倍率×40）显示了广泛的胚胎癌区域（ii，原始放大倍数×100；iii，原始放大倍率×400）和外胚层来源的原始神经外胚层组织（iv，原始放大率×100；v，原始放大×400）。分化为肌肉（中胚层；vi，原始放大倍数×400）和纤毛呼吸上皮（内胚层；vii，原始放大倍率×600）也存在。（D） 甲基化分析华侨城4号和NANOG公司KBM7细胞、生成的iPSCs和hES细胞的启动子区域。浅灰色方块表示未甲基化；黑色方块，甲基化胞嘧啶磷酸鸟苷。数字表示甲基化胞嘧啶-磷酸-鸟苷的百分比。

并非所有4种重编程因子都是从体细胞生成iPSCs的严格要求。^8——10我们询问这四个因素是否都是癌细胞重新编程所必需的。出乎意料的是c-MYC公司重编程混合物导致细胞死亡。移除华侨城4号,SOX2标准，或KLF4型有一个不太引人注目的表型和粘附菌落形成。然而，这些菌落保持了CD43标记的表达，并且没有表现出ES细胞的形态（补充图3），这表明这4个因素中没有一个是可有可无的。

在慢性粒细胞白血病的慢性期BCR-ABL公司突变驱动细胞膨胀，但细胞保持分化能力。¹¹继发性病变导致急变危象，其特征是不能进行分化。¹²我们研究了从类似CML爆发期的KBM7细胞衍生的iPSCs是否能够进行分化。验证重组细胞获得多能性的最严格测试是畸胎瘤形成。¹³将癌源性iPSCs（KBM7-iPS2）皮下注射到非肥胖糖尿病严重联合免疫缺陷（NOD-SCID）小鼠体内。这导致了畸胎瘤的形成(图1C类；补充图4）。组织学分析表明，存在代表所有3个胚层的组织。大肿瘤区域包含原始神经外胚层组织（外胚层衍生）和类似胚胎癌的结构。观察到病灶区包含类似纤毛呼吸上皮（内胚层）和肌肉（中胚层）的结构。体外分化试验表明，这些细胞生成类胚体，并分化为表达Nestin的神经上皮玫瑰花状结构和神经元形态的βIII-管蛋白阳性细胞（补充图5）。

CML细胞对BCR-ABL信号的精细依赖性形成了伊马替尼（STI-571；格列卫）成功临床抑制疾病的基础。^14,15人们对这种依赖的机制知之甚少。有人认为，肿瘤细胞中遗传改变的积累导致了一种新的遗传程序，在这种程序中，后天致癌病变成为不可或缺的组成部分。¹⁶我们使用癌源性iPSC来研究癌基因依赖性。与亲代KBM7细胞相比，KBM7-iPS1和KBM7-iPS2对伊马替尼完全耐药(图2A） ●●●●。在多能干细胞中观察到癌基因成瘾的丧失，但在神经细胞或来源于多能干2细胞的成纤维细胞样细胞中也观察到癌细胞成瘾的消失(图2A） ●●●●。将每个转录因子单独导入KBM7细胞后，未观察到伊马替尼耐药(图2B） 感染4种转录因子7天后观察到(图2B） ●●●●。大多数细胞失去泛造血标记CD45的表达(图2C） 这表明，当细胞仅表达任一转录因子时，未观察到一定程度的去分化(图2C） ●●●●。1周后，4种因子的表达诱导了部分去甲基化华侨城4号和NANOG公司检测到启动子和NANOG（补充图6A）。尽管这些细胞表现出去分化的迹象，但它们还没有完全类似于缺乏LIN28和E-cadherin表达的多能干细胞（补充图6B）。我们研究了向造血谱系分化是否会恢复癌基因成瘾。从KBM7-iPSCs衍生的类胚体在补充造血细胞因子的无血清培养基中培养。尽管需要进一步的实验来确定这些细胞能够分化为所有血统的程度，但CD34、CD43和CD45阳性的细胞可以观察到造血分化的迹象。在培养基中加入伊马替尼3天后，造血标记物阳性的细胞数量显著减少，而非造血细胞的活性则不受影响(图2D类；补充图7）。这些实验表明，尽管KBM7细胞中存在致癌损伤和调控电路异常连接，但重新编程的过程很容易消除BCR-ABL依赖性，BCR-ABL依赖性通过向造血谱系分化而恢复。

在单独的窗口中打开

图2

KBM7细胞重编程导致癌基因成瘾逃逸KBM7-iPSCs对1μM BCR-ABL激酶抑制剂伊马替尼（Gleevec）的治疗不敏感，而亲代KBM7细胞高度敏感。KBM7细胞、重新编程的KBM7-iPS2细胞和非造血分化衍生物在没有（顶行）或添加1μM伊马替尼的情况下培养3天（底行）。所有图像均使用10倍物镜的标准尼康显微镜采集。（B） 感染逆转录病毒构建物编码的KBM7细胞的存活率表明感染后7天伊马替尼治疗的cDNA。只有当这四种因子联合表达时，KBM7细胞才对伊马替尼不敏感。使用XTT（2,3-双-（2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基）-2H-四氮唑-5-羧基苯胺）转化分析测定细胞活力。给出的值是未感染对照培养物的百分比。数据是三次执行的典型实验的平均正负SD值。（C） KBM7细胞感染表达cDNA的逆转录病毒7天后的流式细胞术直方图显示，4种重编程因子的组合导致CD45（泛造血标记物）的表达缺失。（D） 流式细胞术分析分化为造血谱系的KBM7-iPSCs显示CD45和CD43抗体染色的不同亚群。伊马替尼治疗导致这些亚群的减少。

我们在这里展示了人类癌症细胞系可以被重新编程为限制多能性的状态。其他人类癌细胞是否可以被重新编程为iPSC还有待观察。有趣的是，重新编程的KBM7-iPSCs中存在的致癌突变并不能完全阻止畸胎瘤形成过程中发生的细胞分化，尽管我们不能排除成熟程度不如从非癌细胞衍生的畸胎瘤中观察到的成熟程度。最后，我们的结果可能表明，维持BCR-ABL依赖性需要特定分化的表观遗传细胞状态，这为针对癌基因成瘾的治疗药物的异质性反应提供了理论基础。这可能导致BCR-ABL抑制剂无法完全治愈疾病。

补充材料

致谢

脚注

工具书类