洛伐他汀对活性氧的抑制下调血管内皮生长因子的表达并改善血视网膜屏障的破坏数据库/数据库老鼠

细胞培养。

如前所述，分离并培养原代牛视网膜毛细血管内皮细胞（RCEC）(25). 原代人视网膜微血管内皮细胞购自Cell Systems（华盛顿州柯克兰），并保存在含有10%FBS、30μg/ml内皮细胞生长补充剂、90μg/ml肝素、1%胰岛素-转铁蛋白-硒-A补充剂（ITS）和1%抗生素/抗真菌溶液的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）中。汇合的单层细胞在含有1%FBS的DMEM中静止8小时，然后在所需条件下处理。为了评估缺氧的影响，将细胞暴露于缺氧（2%O₂)或常氧（21%O₂)，使用ProOxC系统正确调节氧气浓度（纽约州拉科纳市BioSpherix）。所有实验均使用第三代至第八代细胞进行。

RCEC腺病毒感染。

表达人Nox4（Ad-Nox4）的腺病毒载体(26)，或缺失FAD-NADPH结合位点的Nox4显性阴性突变体（Ad-Nox4^ΔFAD)(26)或RNA干扰靶向人类Nox4（起始密码子的核苷酸418–436）（Ad-Nox4i），或控制小干扰RNA（siRNA）（Ad-Ctrli）(27)在293个AD细胞中扩增，并根据制造商的协议使用Adeno-X Maxi纯化试剂盒（加州山景城Clontech实验室）进行纯化。以表达β-半乳糖的腺病毒（Ad-LacZ）为对照。次级流入的人RCEC在补充有10%FBS的DMEM中生长，并以50倍感染率（MOI）感染腺病毒。感染48小时后，在实验前用含1%FBS的DMEM使细胞静止8小时。

玻璃体内注射腺病毒。

使用UltraMicroPump（佛罗里达州萨拉索塔市世界精密仪器公司）在深度麻醉的小鼠体内进行腺病毒的玻璃体内注射，并遵循一项记录在案的方案(28). 简单地说，在解剖显微镜下，在角膜缘后1毫米处用一根31号的尖头针头切开。将安装在10μl微量注射器上的34 gauge钝针插入玻璃体腔。对微量注射器进行校准，以提供含有10个⁹踩下脚踏开关一次的病毒颗粒。3周后，对小鼠进行视网膜血管通透性测定或人工杀死。解剖视网膜进行Western blot分析或切片以测量NADPH依赖的ROS原位生成。

视网膜血管通透性测量。

通过使用伊文思蓝白蛋白法测量从血管到视网膜的白蛋白渗漏来量化视网膜血管通透性。详情请参阅在线补充，网址为http://diabetes.diabetesjournals.org/cgi/content/full/db09-1057/DC1。

检测细胞内ROS生成。

CM-H评估细胞内ROS生成₂DCFDA和DHE(29). 简单地说，RCEC被播种到96个板块中并生长到汇合处。静止后，细胞分别与1μmol/l洛伐他汀和0.1μmol/lDPI孵育24 h和4 h，然后缺氧16 h^ΔFAD用温热的Hank平衡盐溶液清洗细胞48小时，然后用10μmol/l CM-h在37°C下培养₂DCFDA 45分钟或5μmol/l DHE在无酚DMEM中30分钟。在荧光显微镜下拍摄细胞照片（德国汉堡奥林巴斯），并使用荧光微孔板阅读器（马萨诸塞州沃尔瑟姆Perkin Elmer）对荧光强度进行量化，二氯荧光素（DCF）在485 nm激发，535 nm发射，DHE在485纳米激发，645 nm发射。

实时RT-PCR。

根据制造商的方案，使用RNeasy迷你试剂盒（加利福尼亚州巴伦西亚的齐亚根）从人类RCEC和人类中性粒细胞中提取总RNA。按照制造商的说明，使用iScript cDNA合成试剂盒（加利福尼亚州Hercules的Bio-Rad实验室）从1μg RNA合成cDNA。如我们之前的研究所述，使用SYBR绿色PCR主混合液（Bio-Rad Laboratories）进行实时RT-PCR(25). 用于实时PCR的特异引物如下：Nox1：正向：5′-CTTCCTCCACTGCTGGGATA-3′，反向：5′-TGACAGCTATTGCGCT-3′(30); gp91phox/No2：正向：5′-CACAGTGTGTTCAGCT-3′，反向：5′-GCACAGCCAGTAGAGATAGATA-3′(30); 和Nox4：正向：5′-ACTTTTCATTGCGTCCTC-3′，反向：5′-AGAACTGGGTCCACAGAA-3′(31). 靶基因的mRNA水平用18S rRNA标准化。

免疫细胞化学。

细胞用10%甲醛固定10分钟，用0.5%Triton X-100渗透5分钟。用10%正常驴血清在PBS中封闭1小时后，用兔抗Nox4抗体（1:250）孵育细胞在4°C下过夜，然后在室温下用仲荧光素异硫氰酸酯偶联亲和纯化的驴抗兔IgG（1:200）1小时。用含有DAPI的VECTASHIELD安装介质对细胞核进行染色。在荧光显微镜（奥林巴斯）下对载玻片进行可视化和拍照。图像代表三个独立的实验。

蛋白质印迹分析。

用蛋白酶抑制剂混合物、苯甲基磺酰氟和原钒酸钠在放射免疫沉淀分析裂解缓冲液中裂解视网膜和细胞。对裂解产物进行超声波处理，并在14000 rpm的转速下离心10 min。蛋白质浓度通过双茚二酸蛋白质分析测定（皮尔斯生物技术公司，伊利诺伊州罗克福德）。用12%的SDS-PAGE溶解25微克蛋白质，并转移到硝化细胞膜上。阻断后，用以下初级抗体在4°C下将膜印迹过夜：抗Nox4（1:1000）、抗VEGF（1:500）、抗HIF-1α（1:1000）、抗磷酸化STAT3（1:1000）和抗β-肌动蛋白（1:5000）抗体。在室温下与辣根过氧化物酶结合二级抗体（1:2000）孵育1小时后，使用生物成像系统（Syngene，Frederick，MD）用增强化学发光底物制备膜。用密度计对条带进行半定量。

Nox4是RCEC中NADPH氧化酶的主要亚型。

NADPH氧化酶是内皮细胞活性氧的主要来源；然而，NADPH氧化酶在RCEC中的确切作用和机制尚不清楚。我们首先测定了人类RCEC中主要NADPH氧化酶亚型的表达，包括Nox1、Nox2和Nox4，并将其与人类中性粒细胞进行了比较。如所示图2A类在RCEC中，Nox4的mRNA表达至少是Nox1和Nox2的100倍。相反，中性粒细胞中Nox2的表达显著高于Nox1和Nox4(图2A类). 这些结果表明，尽管所有亚型都在这两种细胞类型中表达，但在RCEC中，Nox4是NADPH氧化酶的主要亚型，而Nox2是中性粒细胞中的主要亚类。

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图2。

RCEC中Nox亚型的表达及缺氧和洛伐他汀对Nox4的调节。A类：通过实时RT-PCR测定人RCEC和中性粒细胞中Nox1、Nox2和Nox4的mRNA表达，并相对于18S rRNA水平进行表达（平均值±SE，n个= 3).B类：人RCEC暴露于缺氧4 h，Nox4 mRNA通过实时RT-PCR定量（平均值±SE，n个= 3).C类：通过免疫细胞化学方法测定了Nox4在人RCECs中的细胞分布。A–C：Nox4染色。D–F：核染色。Nox4在正常氧环境下RCEC的核周分布(A类)和缺氧(B类). 细胞缺氧16小时导致Nox4强度增加(B类)被洛伐他汀（1μmol/l）逆转(C类)。D类：通过Western blot分析测定牛RCEC中Nox4的表达，并通过密度测定法进行半定量（平均值±SE，n个= 3).E类和F类：用1μmol/l洛伐他汀或100 nmol/l DPI预孵育牛RCEC 24 h或4 h，然后暴露于缺氧中16 h。用二氯荧光素（DCF）测量细胞内ROS生成(E类)和DHE(F类). 在每种条件下从30个重复获得结果，代表三个独立实验（平均值±SE）。G公司：用100 nmol/l DPI、100μmol/l预先培养牛RCEC我-NAME、1μmol/l鱼藤酮或10μmol/l别嘌呤醇4 h，然后暴露于缺氧16 h。用DCF测量细胞内ROS生成（平均值±SE，n个= 3). **P（P）<0.01 vs.常氧；†P（P）< 0.05; ‡P（P）与缺氧相比，<0.01。（该图的高质量数字表示可在在线期刊上获得。）

洛伐他汀减弱RCEC低氧诱导的Nox4表达和ROS生成。

缺氧是内皮细胞中VEGF表达的有效诱导剂(33). 接下来我们研究了缺氧条件下RCEC中Nox4的表达和ROS的生成。结果表明，缺氧处理4h后，Nox4 mRNA表达显著增加3.2倍(图2B类). 低氧处理16小时后，Nox4蛋白水平也显著升高(图2C类和D类). 此外，低氧处理的细胞内ROS生成显著增加(图2E类和F类). 有趣的是，一项免疫细胞化学研究表明，Nox4定位于核周隔室(图2C类). 缺氧处理导致Nox4信号强度增加，但没有导致任何转移到其他亚细胞区室。

为了确定洛伐他汀对RCEC中Nox4表达的影响，用洛伐他丁或众所周知的NADPH氧化酶抑制剂DPI预处理细胞4h，然后暴露于缺氧16h(图2C类和D类). 此外，洛伐他汀和DPI显著改善RCEC低氧诱导的ROS生成(图2E类和F类). 由于DPI也可作为其他黄素蛋白的抑制剂(34)为了描述缺氧诱导的活性氧的来源，RCEC用不同的抑制剂进行预处理，这些抑制剂抑制几个活性氧生成系统，包括鱼藤酮（线粒体电子传递链抑制剂）、别嘌呤醇（黄嘌呤氧化酶抑制剂）和我-NAME（一氧化氮合酶抑制剂）。结果表明，每种抑制剂都在一定程度上减弱了低氧诱导的活性氧水平，表明低氧可能会激活多种促进活性氧生成的途径(图2G公司). 然而，在非常低的浓度（100 nmol/l）下DPI显示出最显著的效果(图2G公司)。

洛伐他汀对高糖暴露的RCEC中Nox4和VEGF表达的下调。

高血糖是糖尿病血管并发症的主要病因之一。为了评估高糖对Nox4表达的影响，RCEC暴露于25 mmol/ld日-分别用实时RT-PCR和Western blot检测葡萄糖或相同浓度的甘露醇作为渗透控制液6～24h后Nox4表达的mRNA和蛋白水平。结果表明，与渗透压控制相比，高糖暴露6h的细胞中Nox4 mRNA显著增加(图3A类). 在24小时时，高葡萄糖也会增加Nox4的蛋白水平，而洛伐他汀则以剂量依赖的方式显著降低了Nox4的蛋白水平(图3B类). 同时，在高糖处理的细胞中，VEGF的表达显著增加，而洛伐他汀处理后VEGF表达减弱(图3C类)。

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图3。

洛伐他汀下调高糖环境下RCEC中Nox4和VEGF的表达。A类：通过实时RT-PCR定量研究用25 mmol/l葡萄糖（HG，高糖）或甘露醇处理6 h的人RCEC中Nox4 mRNA的表达。B类和C类：用25 mmol/l葡萄糖（HG）或甘露醇处理牛RCEC 24 h，加或不加洛伐他汀（0-5μmol/l）。Nox4的表达(B类)和血管内皮生长因子(C类)通过Western blot分析测定并通过密度测定法定量（平均值±SE，n个= 3). *P（P）< 0.05; **P（P）与对照组相比<0.05；†P（P）< 0.05; ‡P（P）<0.01 vs.高糖。

抑制NADPH氧化酶活性可降低RCEC中HIF-1α和VEGF的表达。

为了确定Nox4活性的增加是否是缺氧条件下RCEC中VEGF表达的潜在介质，用DPI预处理细胞4 h，然后暴露于缺氧条件下16 h。结果表明，低剂量（100 nmol/l）的DPI足以降低缺氧诱导的VEGF的表达(图4A类). 此外，这种效应与HIF-1α的下调有关，HIF-1是负责低氧诱导VEGF表达的主转录因子(图4B类). 此外，用洛伐他汀预处理细胞后，细胞VEGF表达显著减弱，HIF-1α水平呈剂量依赖性降低(图4C类和D类)。

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图4。

NADPH氧化酶抑制剂或洛伐他汀下调RCEC中HIF-1α和VEGF的表达。用DPI预处理牛RCEC(A类和B类)4小时或洛伐他汀(C类和D类)24小时后暴露于缺氧16小时。VEGF的表达(A类和C类)和HIF-1α(B类和D类)通过Western blot分析测定并通过密度测定法定量。结果表示为平均值±SE(n个= 3). *P（P）< 0.05; **P（P）<0.01 vs.常氧；†P（P）<0.05；†P（P）与缺氧相比，<0.01。

Nox4的过度表达增加了RCEC中ROS的生成并上调了VEGF的表达。

为了进一步确定Nox4对视网膜内皮细胞ROS生成的影响，我们以腺病毒表达Nox4（Ad-Nox4）或腺病毒表达Lac Z（Ad-Lac Z）感染人RCEC作为对照。Nox4的过度表达导致细胞内ROS生成的基础水平适度但显著增加(图5A类). Nox4表达与ROS产生之间差异的原因尚不清楚。一种可能的解释是，Nox4在产生活性氧的同时，也可能调节其他氧化还原酶，以增强活性氧清除和/或抑制活性氧的产生，从而维持活性氧的低基础水平。虽然这一推测值得进一步研究，但我们发现用siRNA敲低Nox4会增加RCEC中Nox2 mRNA的表达（未显示）。同样，在Nox2中观察到Nox4 mRNA上调^−/−基因敲除小鼠(35). 这些数据表明氮氧化物酶具有相互调节作用。此外，Ad-Nox4治疗显著增加HIF-1α(图5B类)和VEGF表达(图5C类). 这些结果支持NADPH氧化酶在RCECs中调节HIF-1α和VEGF的关键作用。

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图5：。

Nox4调节RCEC中ROS生成、HIF-1α和VEGF的表达。A–C：人类RCEC感染Ad-LacZ或Ad-Nox4 48小时。Nox4表达和ROS生成(A类)，HIF-1α的表达(B类)和VEGF(C类)已确定（平均值±SE，n个= 3). *P（P）与Ad-LacZ相比<0.05。D–H型以下为：人类RCEC感染了Ad-LacZ或Ad-Nox4^ΔFAD48小时，然后缺氧16小时。D类：实时PCR检测显性负性Nox4的mRNA表达，并用18S rRNA标准化（平均值±SD，n个= 3).E类,上部面板：显示RCEC中ROS生成的DCF代表图像。E类,一：Ad-LacZ+常氧。E类,b条：Ad-LacZ+缺氧。E类,c（c）：Ad-Nox4^ΔFAD+缺氧。E类,下部面板：通过DCF测量细胞内ROS生成。采用Amplex红法测定细胞外活性氧水平。在每种条件下从30个重复获得结果，代表三个独立实验（平均值±SE）。F类：NADPH氧化酶活性测定如研究设计与方法（指±SD，n个= 3).G公司和H（H）：VEGF的表达(G公司)和HIF-1α(H（H）)通过Western blot分析测定并通过密度测定法定量（平均值±SE，n个= 3). **P（P）与Ad-LacZ+常氧相比，<0.01；†P（P）< 0.05; ‡P（P）<0.01 vs.Ad-LacZ+缺氧。（这一数字的高质量数字表示可在网上获得）。

抑制Nox4可降低缺氧RCEC中ROS的生成和VEGF的表达。

接下来，我们询问Nox4活性是否对人RCEC低氧诱导的ROS生成和VEGF表达至关重要。通过腺病毒过度表达Nox4（Ad-Nox4）的显性负突变体来抑制Nox4活性^ΔFAD). Nox4的mRNA表达^Δ时尚经实时RT-PCR证实(图5D类). 用荧光探针CM-H测量细胞内ROS生成₂DCFDA和H₂O（运行）₂通过Amplex红试验测定释放到培养基中的浓度。此外，在细胞匀浆中测定NADPH氧化酶活性。结果表明，Ad-Nox4^ΔFAD细胞内ROS水平和细胞外ROS（H₂O（运行）₂)缺氧条件下RCEC释放(图5E类). 保持不变的是，抑制Nox4显著降低NADPH依赖的ROS生成，并减少缺氧介导的NADPH氧化酶活性增加(图5F类)。

为了进一步阐明Nox4在低氧诱导的HIF-1α和VEGF表达中的作用，我们测定了感染Ad-Nox4的人RCEC中HIF-1β和VEGF的水平^ΔFAD缺氧16小时后，正如预期的那样，缺氧诱导HIF-1α和VEGF表达显著增加。Ad-Nox4型^ΔFAD治疗几乎完全消除了低氧诱导的VEGF上调(图5G公司). 此外，在Ad-Nox4中HIF-1α水平显著降低^ΔFAD-处理后的细胞与感染对照病毒的细胞的比较(图5H（H）)。

在RCEC中，Nox4是高糖介导的ROS生成、STAT3激活和VEGF表达所必需的。

为了确定抑制Nox4是否影响高糖诱导的ROS和VEGF表达，用Ad-LacZ和Ad-Nox4感染牛RCEC^ΔFAD48小时，然后暴露于高糖中24小时Ad-Nox4^ΔFAD显著减弱高糖诱导的ROS生成(图6A类)并在很大程度上阻断了接触高糖的细胞NADPH氧化酶活性的增加(图6B类). 此外，抑制Nox4可消除高糖诱导的VEGF表达上调(图6C类). 有趣的是，高糖并没有改变HIF-1α的表达（未显示），这表明HIF-1β与高糖诱导的RCEC中VEGF的表达无关。相反，高糖显著增加STAT3的磷酸化，STAT3是另一个激活VEGF表达的关键转录因子(36)(图6D类). Ad-Nox4治疗^ΔFAD减弱了高糖诱导的STAT3磷酸化，表明Nox4通过激活STAT3参与高糖介导的ROS生成和VEGF表达。

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图6。

抑制Nox4可减弱RCEC中高糖诱导的ROS生成、STAT3激活和VEGF表达。牛RCEC感染了Ad-LacZ或Ad-Nox4^ΔFAD48h后用25mmol/l葡萄糖处理。甘露醇被用作渗透控制。A类：DCF检测到细胞内ROS生成。Ad-Nox4型^ΔFAD显著减轻高糖诱导的ROS生成。在每种条件下从30个重复获得结果，代表三个独立实验（平均值±SE）。B类：NADPH氧化酶活性测定如研究设计与方法（指±SE，n个= 3).C类和D类：VEGF的表达(C类)STAT3的磷酸化(D类)通过Western blot分析测定并通过密度测定法定量（平均值±SE，n个= 3). *P（P）< 0.05; **P（P）与对照组相比<0.01；†P（P）< 0.05; ‡P（P）<0.01 vs.高糖。

本研究得到了美国国立卫生研究院拨款P30 EY12190、P20RR024215、青少年糖尿病联合会拨款5-2009-475、美国卫生援助基金会（AHAF）拨款M2010088和俄克拉荷马州科技进步中心（OCAST）的研究奖助。

没有报告与本文相关的潜在利益冲突。

内容完全由作者负责，不一定代表国家研究资源中心或国家卫生研究院的官方观点。

这项研究的部分内容在视觉和眼科研究协会（ARVO）上发表。

作者感谢Lily Wong博士和Olga Nikolgeva博士提供的卓越技术援助。