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美国财务会计准则委员会J。2010年6月；24(6): 1759–1767.
数字对象标识：1096年10月10日/fj.09-145664
预防性维修识别码：项目经理2874483
PMID：20065104

地高辛抑制视网膜缺血诱导的HIF-1α表达和眼部新生血管

吉田俊彦,*†,1 张华峰,‡§,1 Takeshi我是,*† Jikui Shen公司,*† 格雷格·塞门扎,‡§‖#**††,2和彼得·坎波奇亚罗*†,2
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

地高辛和其他强心甙抑制培养细胞中低氧诱导因子-1（HIF-1）的转录活性并抑制肿瘤异种移植生长。我们测试了地高辛降低缺血组织中HIF-1水平的假设体内并抑制新生血管。使用建立良好的小鼠眼部新生血管模型来验证我们的假设。在患有缺血性视网膜病变的小鼠中，眼内或腹腔注射地高辛可显著降低视网膜HIF-1α蛋白和编码多种低氧调节的促血管生成蛋白及其受体的mRNA的水平。从出生后第12天开始每天腹腔注射2 mg/kg（P）或在P12单次玻璃体内注射100 ng地高辛可使P17的视网膜新生血管减少>70%。地高辛还减少了CXCR4的数量+单元格和F4/80+缺血视网膜中的巨噬细胞和Bruch膜破裂部位的脉络膜新生血管显著减少。地高辛通过降低HIF-1α水平抑制视网膜和脉络膜新生血管，从而阻断多种促血管生成途径。由于地高辛除了抑制VEGF信号外，还抑制多条通路，因此在治疗伴有新生血管和/或过度血管通透性的视网膜和脉络膜疾病患者时，地高辛可能比特定的VEGF拮抗剂更具优势。它也可能有助于治疗其他组织中的新生血管疾病-Yoshida，T.、Zhang，H.、Iwase，T.，Shen，J.、Semenza，G.L.、Campochiaro，P.A.地高辛抑制视网膜缺血诱导的HIF-1α表达和眼部新生血管形成。

关键词：年龄相关性黄斑变性、血管生成、心脏糖苷、糖尿病视网膜病变

缺血性视网膜病变是美国工龄人群中中度和重度视力丧失的最常见原因(1)它们是一组疾病，其中不同的原发性损伤导致视网膜血管受损，导致视网膜灌注不良区域。在糖尿病视网膜病变中，主要损害是高血糖；在早产儿视网膜病中，是指在视网膜血管发育的特定阶段暴露于高于正常水平的氧气；在视网膜中央静脉和分支静脉阻塞中，静脉流出受阻，增加静水压，减少灌注；镰状细胞视网膜病是指非变形镰状红细胞阻塞视网膜血管；视网膜血管炎是炎症。无论潜在原因如何，视网膜缺血是一个会聚点，之后所有这些疾病都会发生严重的致病事件。其中一个事件是低氧诱导因子1（HIF-1）的稳定，它随后激活包含低氧反应元件的基因转录(2,三,4,5)这些HIF-1应答基因的产物共同作用，促进视网膜新生血管（NV）、脉络膜NV和/或过度视网膜血管渗漏(6).

一个特别重要的HIF-1应答基因编码血管内皮生长因子（VEGF），它在视网膜和脉络膜NV中起着关键作用，两者都被VEGF拮抗剂强烈抑制(7,8,9,10,11,12)然而，其他HIF-1诱导基因的产物与视网膜和/或脉络膜NV的发展有关，包括血管生成素2（ANGPT2）(13,14,15,16)血小板衍生生长因子-B（PDGF-B）(17,18,19)，胎盘生长因子-1（PGF）(20, 21)和促红细胞生成素（EPO）(22, 23)骨髓源性细胞向缺血性视网膜的募集也有助于眼部NV，可能部分基于低氧诱导的干细胞因子（SCF）和基质衍生生长因子-1（SDF-1）的产生，它们与募集细胞表面的同源受体CD117（cKit）和CXCR4结合(24, 25)HIF-1对于VEGF、PGF、PDGF-B、ANGPT2、SCF和SDF-1在小鼠肢体、皮肤和眼部新生血管模型中的表达是必要和充分的(6, 26)因此，多个HIF-1应答基因似乎与眼部NV有关。最重要的是，VEGF水平的增加仅在视网膜深毛细血管床中诱导NV(8)，HIF-1α水平的增加足以在脉络膜和视网膜的所有血管床中诱导NV(6).

我们最近利用基于细胞的报告分析筛选抑制HIF-1转录活性的药物。该筛选确定地高辛和其他10种心肌糖苷是HIF-1α蛋白合成的有效抑制剂，具有IC50在广泛转化的人类肝、淋巴和前列腺细胞系中，值<100 nM(27)地高辛治疗小鼠导致肿瘤异种移植物中HIF-1转录活性和VEGF mRNA表达受到抑制，从而显著抑制肿瘤生长。当肿瘤细胞通过地高辛不抑制的表达载体表达HIF-1α时，肿瘤生长体内未被地高辛治疗抑制，表明地高辛的抗癌作用是基于其抑制肿瘤中HIF-1α合成的能力(27)根据这些数据以及HIF-1通过激活一些促血管生成蛋白的表达在介导缺血诱导的新生血管形成中的关键作用，我们假设地高辛也可能起到病理性血管生成抑制剂的作用。在本研究中，我们使用成熟的眼部NV小鼠模型验证了这一假设。

材料和方法

老鼠

无病原体C57BL/6小鼠（Charles River，Wilmington，MA，USA）根据视力和眼科研究协会关于在眼科和视力研究中使用动物的声明以及约翰·霍普金斯大学动物护理和使用委员会的指南进行治疗。

脉络膜NV小鼠模型

如前所述，脉络膜NV是由激光光凝导致Bruch膜破裂引起的(28)简单地说，用盐酸氯胺酮（100 mg/kg体重）麻醉5-6周龄雌性C57BL/6小鼠，并扩张瞳孔。使用OcuLight GL二极管激光器（Iridex，加利福尼亚州山景城，美国）的裂隙灯输送系统和作为接触镜的手持式盖玻片，在每只眼睛后极的9、12和3点钟位置进行激光光凝（75μm光斑大小，0.1-s持续时间，120 mW），以观察视网膜。激光产生组织气泡，表明布鲁赫膜破裂，是获得脉络膜NV的重要因素；因此，本研究只包括产生气泡的烧伤。在激光诱导Bruch氏膜破裂后，立即将小鼠随机分为不同的治疗组，包括玻璃体内注射1μl含有不同浓度地高辛的PBS或PBS，或每天腹腔注射溶媒或2 mg/kg地高辛。如前所述，玻璃体内注射在解剖显微镜下使用哈佛泵微量注射系统（哈佛仪器，马萨诸塞州霍利斯顿，美国）和拉玻璃微量吸管进行(29).

14天后，向小鼠灌注1 ml PBS，其中含有50 mg/ml荧光标记葡聚糖（2×106Da平均分子质量；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）和脉络膜扁平支架通过荧光显微镜进行检查。使用尼康数码静态相机DXM1200（尼康仪器公司，美国纽约州纽约市）拍摄图像。使用图像分析软件（Image-Pro Plus；Media Cybernetics，Silver Spring，MD，USA）测量每个破裂部位脉络膜NV的总面积，研究人员对治疗组进行遮蔽。

氧诱导缺血性视网膜病变

C57BL/6小鼠置于75%O中2在出生后第7天（P）和第12天回到室内空气中，眼内注射1μl含有0.0001、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1或0.25μg地高辛的PBS或PBS，或每天腹腔注射溶媒或2 mg/kg地高辛。在第17页，如前所述测量视网膜表面视网膜NV的面积(30,31,32)简单地说，P17小鼠眼内注射1μl大鼠抗小鼠血小板内皮细胞粘附分子-1（PECAM-1）抗体（Pharmingen，加州圣何塞，美国）；12小时后，将其安乐死，并在室温下将眼睛固定在PBS缓冲福尔马林中5小时。在室温下以1:500的稀释度解剖、清洗视网膜，并用山羊抗鼠多克隆抗体与Alexa 488（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）结合培养45分钟。与治疗组相比，一名蒙面的观察者通过图像分析测量了每个视网膜的NV面积。

视网膜骨髓源性细胞的评估

将C57BL/6小鼠置于75%的O中2在P7和P12，将他们返回到室内空气中，并接受玻璃体内注射1μl PBS或含有0.05μg地高辛的PBS。在P17，小鼠眼内注射1μl藻红蛋白结合的抗CXCR4抗体（Pharmingen，加州圣何塞，美国）或F4/80抗体（EBioscience，加州圣地亚哥，美国）；8小时后，对小鼠实施安乐死，将其眼睛取出并在室温下用磷酸盐缓冲福尔马林固定5小时。解剖视网膜，用含有0.25%Triton X-100的PBS清洗，然后平贴。用尼康荧光显微镜观察载玻片，CXCR4的数量+每平方毫米的电池数或F4/80的数量+通过图像分析计算每个视网膜的巨噬细胞数量，研究人员对治疗组进行掩蔽。

免疫印迹分析

将三只不同小鼠的三个视网膜汇集在RIPA缓冲液中并进行溶解。用10%SDS-PAGE对等量的蛋白质进行分级。使用单克隆抗HIF-1α抗体H1α67（Novus Biologicals，Littleton，CO，USA）进行免疫印迹分析(27).剥离印迹，并用抗β-肌动蛋白的多克隆抗体进行重制，以确认蛋白质载量相等。

定量实时RT-PCR（qrtPCR）

按照制造商的说明，使用TRIzol试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）分离RNA，然后使用DNase（Ambion，Austin，TX，USA。寡核苷酸引物(表1)使用Beacon Designer软件（Premier Biosoft，加利福尼亚州帕洛阿尔托，美国）进行设计，并使用iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad，加利福尼亚州赫拉克勒斯，美国）制备cDNA。cDNA样品按1:10稀释，使用iQ SYBR Green Supermix和iCycler实时PCR检测系统（Bio-Rad）进行实时PCR。对于每对引物，通过梯度PCR优化退火温度，并根据严格标准建立所有分析的线性(27)根据阈值周期计算每个靶mRNA相对于18S rRNA的表达(C类t吨)作为2−Δ(Δ计算机断层扫描)，式中ΔC类t吨=C类t吨 目标−C类t吨 18秒和Δ（ΔC类t吨) = ΔC类t吨 地高辛− ΔC类t吨 美国公共广播电视公司.

表1。

qrtPCR引物

姓名前轮驱动版本
PLGF公司GGATGTGTCTGTGAATGC公司CCTCTGAGTGGCTGGTTAC公司
血管内皮生长因子GGCTGTAACGAAG公司CTCTCTATGTGCTGGCTTTG
SDF1（SDF1）GAGAGCCACATCGCAGAG公司TTTCGGGTCAATGCACTTG公司
SCF公司CCTTAGGAATGACAGCAGTAGC公司AGCCAATACAGCAGAATGAG公司
欧洲专利局加拿大政府TGACTTGGTATCTGGGACTG公司
角度2CTGTGCGGAAAATCTTCAAGTC公司TGCCATCTCTCGGTTG
CD117号GCCACGTCTCCAGCACTCTG公司GTCGCCAGCTTCAACTATTAACT公司
欧洲电力公司GGGCTCCGAAACTTCTGTG公司ATGACTTTCGTGACTCACCT公司
第2级CGGCCAGGTACATAGAGA公司TCACATCTCCGAAAAACATCAGC公司
CXCR4系列GAAGTGGGGTCTGGACAT公司TTGCCGACTATTGCCAGTCAAG公司
血管内皮生长因子受体1TGGCTCTACGACCTTAGACTG公司笼状物笼状物笼状物笼状物笼状物笼状物笼状物笼状物笼状物笼状物笼状物笼状物笼状物笼状物笼状物笼状物笼状物笼状物笼状物笼状物笼状物笼状物笼状物笼状物笼状物笼状物笼状物笼状物笼状物笼状物笼状物笼状物笼状物笼状物笼状物笼状物笼
血管内皮生长因子2TTTGGCAAATACCTTCAGA公司GCAGAAGATACTGTCACCAC公司
RPL13A型GAGGCCCTACCATTTCCGA公司GGCTTCAGCGAACACTT公司

酶联免疫吸附试验

根据制造商的说明，使用商业试剂盒（R&D Systems，Minneapolis，MN，USA）测量小鼠视网膜组织裂解液中的SDF-1蛋白水平。视网膜在PBS中通过超声溶解，并使用来自每个视网膜的50μl小份溶解液进行分析。SDF-1水平基于标准曲线测定，并以纳克/微克总蛋白质表示。

统计分析

数据表示为平均值±东南方使用Student’st吨测试或ANOVA，使用Dunnett的多重比较校正，以及P（P）<0.05被认为是显著的。

结果

地高辛抑制缺血视网膜HIF-1α蛋白表达

当小鼠暴露于75%的O时2在P7到P12，VEGF的表达降低，从而阻止视网膜血管的发育，导致新发育的视网膜血管退化，导致视网膜非灌注区(33)在P12返回室内空气后，视网膜缺氧，导致2小时内HIF-1α水平升高，持续增加≥5天(5)与在室内空气中升高的P15小鼠视网膜中的HIF-1α水平相比，在P12接受PBS眼内注射的缺血性视网膜病P15小鼠的视网膜中HIF-1β水平显著升高(图1). 眼内注射0.25μg地高辛的患有缺血性视网膜病变的P15小鼠的HIF-1α水平低于注射PBS的小鼠的眼睛，与房间空气对照组的视网膜水平相当。

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地高辛降低缺血视网膜中HIF-1α蛋白水平。在P12，患有缺血性视网膜病变的小鼠在左眼（O.S.）和右眼（O.D.）眼内注射0.25μg地高辛或PBS。在P15，从3只PBS或地高辛处理过的小鼠的缺氧视网膜和保存在室内空气（RA）中的对照小鼠制备混合的全组织裂解物。使用识别HIF-1α的单克隆抗体进行免疫印迹分析。来自HIF-1α敲除（KO）或野生型（WT）小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的裂解物，在1%O培养基中培养2分别作为阴性和阳性对照。去除印迹，并使用抗β-肌动蛋白抗体作为负荷对照进行免疫印迹分析。

地高辛选择性抑制HIF-1靶基因的表达

为了确定地高辛是否抑制缺血视网膜中HIF-1的转录活性，我们使用qrtPCR来确定已知HIF-1靶基因编码的BNIP3、GLUT1和EPO mRNA的水平。地高辛治疗可显著降低缺血视网膜中BNIP3、GLUT1和EPO mRNA的水平(图2). 相反，编码核糖体蛋白且不受HIF-1调节的RPL13A mRNA的表达不受地高辛的抑制。

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地高辛特异性抑制缺血视网膜中HIF-1靶基因的表达。患有缺血性视网膜病变的小鼠每天在P12和P15之间腹腔注射PBS或2 mg/kg地高辛，然后实施安乐死。分离出视网膜总RNA，并使用BNIP3、GLUT1、促红细胞生成素（EPO）或RPL13A mRNA的特异性引物进行qrtPCR分析。注射地高辛的小鼠视网膜mRNA水平与注射PBS的眼睛视网膜mRNA的水平相比出现了翻倍的变化（平均值±东南方;n个=每个视网膜16个）*P（P）< 0.05与。PBS；未配对的t吨测试。

地高辛降低缺血视网膜中促血管生成因子和/或其受体的mRNA水平

HIF-1转录激活多个编码刺激NV蛋白的基因(6)在P12处眼内注射0.25μg地高辛的缺血性视网膜病变P15小鼠中，与在P12部位眼内注射PBS的缺血性视网膜病小鼠相比，几种促血管生成配体（包括VEGF、SDF-1、SCF、PDGF-B和PGF）的mRNA显著降低(图3A类). 地高辛处理的缺血视网膜中ANGPT2的mRNA没有显著降低，但其受体Tie2的mRNA水平降低(图3B类). 地高辛可显著降低VEGF（VEGFR2）、SDF-1（CXCR4）、SCF（CD117）和PDGF-B（PDGFRβ）受体的mRNA(图3B类). PGF受体VEGFR1的mRNA水平没有降低。

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眼内地高辛降低缺血视网膜中编码血管生成生长因子及其同源受体的mRNA水平。在P12，患有缺血性视网膜病变的小鼠被眼内注射0.25μg地高辛或PBS，在P15，小鼠被安乐死。分离出视网膜总RNA(n个=8/组），并使用编码血管生成生长因子的mRNA特异性引物进行qrtPCR分析(A类)包括SDF-1、VEGF、SCF、PGF、PDGF-B和ANGPT2或这些因子的同源受体CXCR4、VEGFR2、CD117（CKIT）、VEGFR1、PDGF-β受体（PDGFRB）或TIE2(B类). 与注射PBS的眼睛视网膜相比，注射地高辛的小鼠视网膜mRNA水平的折叠变化显示（平均值±东南方;n个=每个视网膜8个）*P（P）<0.05（未配对）t吨测试与。PBS）。

地高辛降低缺血视网膜SDF-1蛋白

由于地高辛降低了缺血视网膜中多种促血管生成因子及其受体的mRNA，因此可以合理假设这些mRNA的蛋白质编码减少。为了验证这一假设，我们使用ELISA来测量SDF-1蛋白水平。在P15处眼内注射0.25μg地高辛的缺血性视网膜病变小鼠视网膜中SDF-1蛋白的水平显著低于在P12处眼内注入PBS的缺血性视网膜病小鼠（补充图1A类). 同样，与PBS治疗的小鼠相比，在P12、P13和P14腹膜内注射2 mg/kg地高辛的缺血性视网膜病变小鼠的SDF-1显著降低(图4).

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地高辛降低缺血视网膜中SDF-1蛋白水平。P12时，对患有缺血性视网膜病变的小鼠进行眼内注射0.25μg地高辛或PBS。P15时，对小鼠实施安乐死，制备视网膜裂解物，平均±东南方(n个=4）用ELISA法测定SDF-1水平（总蛋白的ng/μg）*P（P）< 0.05与。PBS；未配对的t吨测试。

地高辛抑制缺血诱导的视网膜NV

当患有缺血性视网膜病的小鼠每天在P12和P17之间腹腔注射PBS时，通过在视网膜表面选择性地染色NV的技术，对PECAM-1进行染色的视网膜平架(30)显示了大量NV补丁(图5A类). 在P12和P17之间每天腹腔注射2 mg/kg地高辛的小鼠，视网膜表面几乎没有NV(图5B类). 通过图像分析测量NV显示，地高辛处理小鼠的视网膜NV面积减少了75%(图5C类;P（P）<0.00001，未配对t吨测试）。与P12眼内注射PBS的小鼠相比，眼内注射地高辛≥0.01μg的小鼠NV显著降低，注射0.05μg或更多地高辛后NV受到强烈抑制(图5D–I型).

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地高辛抑制缺血诱导的视网膜新生血管。P7时，将C57BL/6小鼠幼崽置于75%氧气中；在P12时，他们返回室内空气，每天腹腔注射PBS或2 mg/kg/d的地高辛，或单次眼内注射0（PBS）、0.0001、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1或0.25μg的地高辛。在P17，通过选择性染色新血管的技术对PECAM-1进行免疫荧光染色的视网膜扁平支架显示，腹腔注射PBS的小鼠视网膜表面有大量新生血管(A类)静脉注射地高辛的小鼠视网膜表面几乎没有新生血管(B类). 图像分析证实，与PBS处理的小鼠相比，地高辛处理的小鼠具有统计学上显著的减少（未配对t吨试验）在视网膜新生血管区域(C类). 与P12眼内注射PBS的小鼠相比(D类)，注射0.25(E类), 0.1, 0.05 (F类)，或0.01微克(G公司)地高辛的剂量，但不是注射0.005、0.001的剂量(H（H）)或0.0001μg，显示视网膜新生血管区域显著减少（ANOVA和Dunnett的多重比较校正）(我).

地高辛减少缺血视网膜中的骨髓源细胞

缺血视网膜SDF-1生成增加促进CXCR4的募集和保留+骨髓源性细胞参与视网膜NV的发病机制(24, 25)与在P12眼内注射PBS的小鼠相比，该小鼠表现出许多CXCR4+P17视网膜表面的细胞(图6A类)，小鼠眼内注射0.05μg地高辛后，CXCR4显著降低+视网膜中的细胞(图6B、 C). 地高辛处理小鼠的视网膜也显示出F4/80的显著降低+巨噬细胞(图6D–F型).

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地高辛阻断骨髓源细胞向缺血视网膜的募集。P7时，将C57BL/6小鼠幼崽置于75%氧气中；在第12页，他们被送回室内，并在眼内注射PBS或0.05μg地高辛。在P17处，视网膜平片被抗CXCR4免疫荧光染色(A、 B类)显示CXCR4减少+地高辛处理的视网膜细胞(B类)与。PBS处理小鼠(A、 C类). 巨噬细胞是CXCR4+用F4/80抗体选择性染色的细胞；F4/80染色视网膜(D、 E类)地高辛处理的小鼠缺血视网膜中的巨噬细胞减少(E类)与用PBS处理的相比(D、 F类). 统计比较由未配对者进行t吨测试。

地高辛抑制Bruch膜破裂部位的脉络膜NV

脉络膜NV发生于Bruch膜和视网膜色素上皮疾病，如年龄相关性黄斑变性（AMD），尽管尚不清楚缺氧是否起作用，但HIF-1已被证实与此有关(34)激光光凝导致Bruch膜破裂导致脉络膜NV，VEGF的抑制在该模型和AMD导致的脉络膜NV患者中强烈抑制NV(10, 12, 35, 36)与激光光凝后每天腹腔注射PBS 14天的小鼠相比，在Bruch的膜破裂部位有大面积的脉络膜NV(图7A类)，每天腹腔注射2 mg/kg地高辛14天的小鼠脉络膜NV病变面积显著减少(图7B、 C类). 激光光凝后立即眼内注射0.25μg地高辛，与注射PBS的眼睛相比，14天后脉络膜NV的面积也显著减少(图7D–F型).

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地高辛抑制布鲁赫膜破裂部位的脉络膜新生血管。成年C57BL/6小鼠在每只眼睛的3个位置进行激光光凝，使布鲁赫膜破裂，然后每天腹腔注射PBS进行治疗(A类)或2 mg/kg地高辛(B类)或单次眼内注射PBS(D类)或0.25μg地高辛(E类). 14天后，在腹腔注射PBS的小鼠中，荧光标记右旋糖酐灌注小鼠的脉络膜扁平支架显示出大面积的脉络膜新生血管(A类)在接受地高辛腹腔注射的小鼠中显著减少(B、 C类). 与眼内注射PBS治疗的眼睛相比(D类)眼内注射地高辛后，布鲁赫膜破裂处脉络膜新生血管的面积明显减少(E、 F类). 统计比较由未配对者进行t吨测试。

讨论

地高辛是钠的抑制剂+/K（K）+几十年来用于治疗充血性心力衰竭或心律失常患者的ATP酶。在一个基于细胞的筛选中，发现地高辛和其他10种心脏苷类药物可将HIF-1活性降低88%以上，以识别抑制HIF-1转录活性的药物(27)地高辛还抑制肿瘤异种移植生长，这种作用取决于其抑制HIF-1α表达的能力(27)在本研究中，我们证明地高辛可以阻断缺氧诱导的视网膜HIF-1α上调，并抑制缺氧诱导的多个HIF-1靶基因的表达。全身给药或眼内注射地高辛可强烈抑制Bruch膜破裂部位缺血诱导的视网膜NV和脉络膜NV。在缺血性视网膜病变模型中观察到高效能的剂量依赖性，其中单次眼内注射100 ng地高辛可实现约70%的最大抑制。系统给予2 mg/kg/d地高辛后，视网膜NV也降低了>70%，脉络膜NV降低了>60%。

血管内皮生长因子（VEGF）在视网膜和脉络膜NV的发病机制中起着关键作用，有效的VEGF拮抗剂的开发彻底改变了AMD所致脉络膜NV的治疗(7,8,9,10,11, 35, 36)然而，每月注射雷尼珠单抗的治疗使不到一半的新生血管性AMD患者的视力显著改善；VEGF以外的促血管生成因子可能介导无反应患者的NV(35, 36)其他与视网膜和脉络膜NV相关的因素包括PDGF-B(17,18,19, 37)，SDF-1(24, 25)和ANGPT2(13, 14, 16)PGF和EPO已被证明能刺激视网膜NV，但没有关于它们对脉络膜NV影响的信息(20,21,22,23).

考虑到许多可能导致视网膜和脉络膜NV的促血管生成因素，考虑联合治疗是合理的。在动物模型中，联合使用VEGF和PDGF拮抗剂比单独使用两者更有效(19)VEGF拮抗剂不会导致脉络膜新生血管的退化(35, 36)一项将雷尼珠单抗与结合PDGF-B的适配体结合的研究为脉络膜新生血管的消退和新生血管性AMD患者的疗效提供了初步证据(38, 39)同时阻断VEGF和PDGF信号传导的一种有效方法是阻断VEGF和PDGF受体酪氨酸激酶（RTK）活性的药物，这是我们已经确定的抑制视网膜和脉络膜NV的最有效的一类药物(10, 40,41,42)已测试的RTK抑制剂具有不同的激酶抑制谱，但它们都能阻断VEGFR1、VEGFR2和PDGFRβ。地高辛对视网膜和脉络膜NV的抑制水平与RTK抑制剂相似，这表明通过阻断HIF-1而同时抑制多种促血管生成药物可能比单一治疗更具优势。

地高辛除了直接作用于视网膜细胞以减少促血管生成因子的产生外，还显著减少了缺血视网膜中巨噬细胞的数量，这些巨噬细胞对视网膜和脉络膜NV起着重要作用(25, 30, 43)地高辛抑制缺血视网膜中SCF的表达，这可能会减少其他骨髓源细胞的募集，例如内皮祖细胞，这些细胞被认为在眼部NV中起作用(44, 45)因此，地高辛可以阻断视网膜和脉络膜NV的刺激通过多种机制，反映了HIF-1作为缺血诱导血管生成主调节器的作用(46)并提供了一种在使用单一药物的同时实现联合治疗效果的方法。

地高辛是一种治疗充血性心力衰竭的治疗窗口相对狭窄的心脏活性药物。然而，单次眼内注射100纳克地高辛的强烈效果表明其有效性，应考虑剂量递增研究，以确定低于充血性心力衰竭所用剂量的口服剂量是否能有效阻断眼部NV。最终，眼内注射地高辛缓释制剂可以为一大类因眼部NV或过度血管通透性而复杂的致盲性疾病提供有效和持续的治疗。

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院/国家眼科研究所EY012609（P.A.C.）和约翰·霍普金斯细胞工程研究所（G.L.S.）的支持。G.L.S.是约翰·霍普金斯大学的C.Michael Armstrong教授。P.A.C.是George and Dolores Eccles眼科学和神经科学教授。

工具书类

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文章来自实验生物学联合会会刊由以下人员提供美国实验生物学学会联合会