组织化学与细胞化学杂志。2010年6月；58(6): 481–497.
工作中的成像酶：酶组织化学的代谢图谱
荷兰阿姆斯特丹大学学术医学中心细胞生物学和组织学系
2009年12月3日收到；2010年1月12日接受。
摘要
为了理解蛋白质在生物和病理过程中的功能，报告分子（如荧光蛋白）已成为可视化这些蛋白质在完整动物、组织和细胞中的位置的不可或缺的工具。对于酶来说，成像它们的活动也可以提供关于其功能的信息，而这并不一定与它们的位置相关。代谢图谱可以对酶的活性进行成像。研究中的酶形成荧光反应产物，或通过荧光底物或显色底物或具有不同光谱特性的荧光底物的转化而着色。大多数显色染色方法是在二十世纪后半叶发展起来的，但在现代细胞生物学和病理学中仍有新的应用。荧光方法在过去十年中发展迅速。本综述对目前在活体动物、组织的非固定冷冻切片和活细胞中进行代谢绘图的方法进行了批判性评估，并参考了所选方法的协议。（《组织化学与细胞化学杂志》58:481–4972010）
关键词：代谢、非侵入性、冷冻切片、活细胞、组织化学、细胞化学、显微镜、图像分析
T型他 活动 属于 酶，细胞生理学中的运动单位，在许多层面上受到调节。首先是转录调控，它决定特定基因的mRNA是否产生以及产生多少拷贝。然后编辑mRNA。mRNA的寿命决定了在核糖体翻译过程中每个mRNA分子可以产生多少酶蛋白拷贝。翻译控制也参与了这一水平的酶调节。然后，翻译后调控通过蛋白质的糖基化、磷酸化、乙酰化、硫酸化和蛋白水解裂解等过程精细调节合成蛋白质的活性(Boonacker等人，2004年;Bogyo和Cravatt 2007;Bogyo 2009年). 最后，细胞中的酶活性在不同的隔间和拥挤的环境中发挥作用。细胞质和细胞器中装载着大分子，这些大分子通过分子相互作用（例如复合物的形成）影响彼此的活动(佩勒姆2000;加文等人，2002年;Alattia等人，2007年). 这可能导致底物通道化，极大地促进代谢途径最终产物的形成(富尔顿1982;阿塞伦萨和格拉纳2006;Beg等人，2007年). 在细胞外基质中，其他调节机制，如与成分的结合，控制着酶的最终活性(Weissleder和Pittet，2008年;Scarpellini等人，2009年).
所有这些变量共同决定了酶的活性。因此，一种酶在细胞中的mRNA或蛋白质的定位或测量无法预测其在这些细胞中的活性() (Hazen等人，2000年;Baruch等人，2004年;Boonacker等人，2004年;Bogyo和Cravatt 2007). 同样，纯化酶在稀释溶液或组织或细胞匀浆中的活性测量可能无法反映该酶在拥挤的分隔细胞中的活性(Baruch等人，2004年;Ramanujan等人，2008年).
蛋白质的定位(A类)和活动(B类)蛋白酶组织蛋白酶B在人结肠相邻冰冻切片中的表达。(A类)组织蛋白酶B蛋白的免疫组织化学定位及银增强(Koehler等人，2000年). 组织蛋白酶B蛋白由反射对比显微镜显示的白点表示。(B类)以N-Cbz-Ala-Arg-Arg-4-甲氧基-2-萘胺为荧光底物和5-硝基水杨醛为偶联剂的代谢定位组织蛋白酶B活性(Van Noorden和Frederiks 1992年,2002). 黄色荧光代表组织蛋白酶B的活性，而绿色荧光是非特异性的亚硝基水杨醛染色。上皮细胞（e）含有低水平组织蛋白酶B蛋白，该蛋白仅在粘膜表面较老的上皮细胞（ms）中活跃，在粘膜表面发生凋亡，而在隐窝中不活跃（c）。固有层基质（lp）含有大多数组织蛋白酶B蛋白，仅在不同区域显示活性（星号）。棒材=50μm。
活细胞或组织成像在分析过程中保持细胞和组织的完整性，可能是生成反映体内情况的酶活性数据的最佳方法(Yuste 2005年;Sadaghiani等人，2007年;Ramanujan等人，2008年). 活组织中酶反应的成像更为复杂，但使用未固定的低温恒温器切片与切片顶部培养基中的组织保护剂相结合，可以在几乎真实的情况下确定酶反应(Van Noorden和Frederiks 2002年). 代谢图谱最复杂的形式是体内非侵入性的。尽管存在技术困难，但已经取得了相当大的进展，特别是在酶活性成像方面，以可视化病理损伤，如肿瘤、动脉粥样硬化损伤和关节炎。
这篇综述批判性地评估了过去10年来活体动物、组织和细胞代谢图谱的发展。
荧光与吸光度
当酶将荧光或显色底物转化为荧光或有色产物时，可以及时成像酶反应。成像荧光可能对细胞有害，因为荧光分子的激发会产生自由基，特别是氧自由基，从而导致细胞死亡(斯蒂芬斯和艾伦2003;Hoebe等人，2007年,2008). 有多种方法可以减少或避免荧光成像的细胞毒性(斯蒂芬斯和艾伦2003;Frigault等人，2009年)但限制荧光成像光毒性的最激烈方法是应用受控光曝光显微镜（CLEM；日本东京尼康），其原理是并非所有像素都接收相同数量的激发光。调节每个像素的曝光时间的反馈系统在曝光的早期阶段决定像素是前景还是背景。背景像素只接受有限的曝光。前景中明亮的像素接收到的光线少于接受完全曝光的暗淡像素。最终图像是根据曝光时间和荧光量信息构建的。这样，根据图像的构成，所需的激发光曝光量减少了2-10倍() (Hoebe等人，2007年,2008).
以DQ明胶为底物的人脑肿瘤组织（多形性胶质母细胞瘤）明胶酶（MMP-2和MMP-9）活性原位酶谱。使用配备滨松E717-63光电倍增管（滨松；日本滨松市）和自制控制曝光显微镜（CLEM）电子设备的尼康C1 Eclipse共焦显微镜（尼康仪器；荷兰阿姆斯特尔芬）进行实时成像。使用尼康Plan Apo 40×/1.0物镜和尼康EZ-C1 3.90软件。将声光调制器（Isomet；Springfield，VA）放置在20 mW的488 nm氩离子激光器的光路中。使用12位模拟数字转换器和0.104×0.104×0.4μm的体素在288×288×7（X，Y，Z）像素处采样图像。图像之间的时间是45秒。收集了100张图像，但没有(A类)和(B类)CLEM的使用。所示图像是最大强度投影。明胶酶活性的荧光产物是荧光素，它因激发光照射而褪色。注意使用CLEM时减少了褪色。通过免疫组织化学检测，巨噬细胞的活性最高，而神经胶质瘤细胞的活性较低。(C类)用CLEM定量巨噬细胞（黑线）和胶质瘤细胞（绿线）中的时间相对荧光（图像），以及不带CLEM的巨噬细胞（红线）和神经胶质瘤细胞中的时间相关荧光（蓝线）。棒材=10μm。
彩色酶产品成像对细胞相对无害。在细胞中成像彩色酶产品所需的相对光量仅是在细胞内成像荧光所需光量的一小部分。此外，荧光分子激发期间自由基的生成仅限于自荧光。当细胞术或图像分析用于量化有色反应产物的形成时，这种损害甚至更小，因为白光不能用于有效的量化。窄带通滤波器用于产生单色光，以进行精确的吸光度测量(Chieco等人，1994年,2001).
使用活细胞时需要认真考虑的另一个方面是细胞对酶底物的渗透性和产品的不渗透性。理想情况下，基质在细胞中的浓度在短时间内与培养基中的浓度相同，而产物仍留在细胞中。通过这种方式，可以在不同底物浓度下监测酶的反应，从而可以确定酶的动力学特性，例如最大速度（V最大值)，迈克尔斯常数(K（K）米)和代谢通量(). 然而，细胞膜通常是酶底物的扩散屏障。有很多方法可以绕过这个障碍：（1）将底物微注射到单个细胞中；（2） 细胞电穿孔；（3） 用顺势疗法浓度的固定剂对细胞进行化学固定，该固定剂只渗透细胞膜，而不会使细胞内蛋白质失活；（4） 用洋地黄素、胆汁盐或洗涤剂处理细胞；（5） 膜透性前基质的使用；以及（6）使用荧光底物产生不同波长的荧光酶产物。
NADP代谢图谱+-人脑肿瘤（多形性胶质母细胞瘤）中依赖性异柠檬酸脱氢酶（IDH）的活性(A类)和没有(B类)IDH1突变。采用显色法，以硝基BT四唑盐、异柠檬酸盐为底物，NADP为辅酶，在37℃下进行代谢绘图。有色反应产物的形成时间（秒）代表NADP-依赖的IDH活性。图片显示了在600、1200和1800秒的培养时间下，在异柠檬酸盐存在下的测试反应，以及在无底物的培养时间为1800秒，在非突变条件下的对照反应(A类)并发生变异(B类)胶质母细胞瘤。(C类)利用图像分析和585 nm的单色光，对非突变[野生型（WT）、试验型（T）和对照型（C）]和突变[（M）T和C）胶质母细胞瘤中有色反应产物（formazan）的及时形成进行定量(Chieco等人，1994年,2001). 注意IDH1突变样品中的活性降低(B、 C类)（Bleeker等人出版）。棒材=100μm。
在我们手中，微注射、细胞顺势固定、膜透性前基质和产生不同波长荧光产品的荧光基质是可选择的方法。第一种方法耗时，但即使在注射过程中也可以进行成像。电穿孔不太合适，因为细胞需要相当长的时间才能恢复，而底物一旦进入细胞，酶反应就会开始。顺势疗法固定也能产生良好且可重复的结果；但这需要非常准确地完成；太少不会产生结果，因为细胞仍然是不可渗透的，而太多会使细胞内蛋白质失活。许多酶对固定非常敏感。例如，红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）活性染色是检测G6PD缺乏症的重要诊断工具，G6PD缺陷症是人类最常见的遗传性酶缺乏症，并且与X染色体相连。用细胞化学方法以外的方法无法可靠地检测到杂合子女性(Peters和Van Noorden 2009). 只有在室温下用0.025%新鲜制备的戊二醛渗透红细胞30分钟，细胞化学方法才成功(). 我们没有用任何其他测试方法成功地对细胞进行化学渗透(Van Noorden等人，1982年). 使用膜透性前底物的最佳示例是含有酯的底物，例如醋酸盐。含有酯的分子通常表现出细胞渗透性，可能是因为亲水基团被屏蔽了(Haugland等人，2005年;Kim等人，2007年). 细胞内酯酶分解酯类，然后底物可以被研究中的酶处理。
许多底物是荧光的，例如乙氧基间苯二酚、基于ELF97的底物、基于甲酚紫的底物，基于荧光共振能量转移（FRET）的底物和双色淬火底物（见下文）。当底物通过酶转化为产物时，荧光转移到另一个波长。这使得能够在两个不同波长下同时成像局部衬底水平和产物形成()（有关协议，请参阅Boonacker等人，2003a;Creasy等人，2007年). 这与检查底物是否进入特定的细胞室或确定酶活性的局部动力学有关(Van Noorden和Frederiks 1992年).
[Ala-Pro]的荧光图像2-甲酚紫，二肽基肽酶IV的底物(A类)和甲酚紫，二肽基肽酶IV活性的产物(B类)和图像的组合A类和B类活的人类T细胞(C类). 激发波长为494 nm(A类)和594纳米(B类)，在550–580 nm处发射(A类)在>620 nm时(B类)分别是。底物荧光以绿色记录(A、 C类)产品荧光为红色(B类)和黄色(C类). 棒材=20μm。经允许，Boonacker等人，《组织化学与细胞化学杂志》51:959–9682003。
由开发的双色淬火MMP-7基板McIntyre等人（2004）还可以对基质和产品浓度进行局部测量。底物的一个荧光部分允许监测未分离底物和裂解产物，另一个允许选择性监测裂解MMP-7产物。
酶的产物应该在产生它的细胞中积累。许多显色酶组织化学方法都是这样做的，如，因为反应产物是不溶于水的，并且在产生它的地方沉淀。荧光酶产品经常从细胞中扩散出来。为了尽可能限制这种扩散效应，应在反应开始后的短时间内进行成像(Boonacker和Van Noorden 2001).
冷冻切片和活细胞的代谢图谱
荧光基底
荧光底物，特别是蛋白酶底物的发展是动态的。在过去的十年里，许多新的底物被开发出来并应用于解决生物和病理问题(Baruch等人，2004年). 本文详细综述了基于荧光色素7-氨基-4-甲基香豆素、Body-FL、Body-TR-X、甲酚紫、Cy 5.5、ELF97、荧光素、罗丹明、MNA、NSA和间苯二酚的荧光底物Boonacker和Van Noorden（2001）本文讨论了过去十年中开发和/或应用的活细胞成像方法。
乙氧基间苯二酚
使用含氟底物乙氧基间苯二酚成像-O（运行）-脱乙基酶活性，将其转化为resurufin，是暴露于平面卤代烃和多环芳烃等污染物的生物标志物。它是受体介导的细胞色素P450依赖性单加氧酶诱导的参数(Donato等人，2004年). 它被认为是水环境污染的生物标志物，并应用于鱼类完整的活的分离肝细胞(Viarengo等人，2007年). 它通常用于微孔板中的肝细胞。使用显微荧光光谱法测定resorufin的产量。它也可以应用于使用共焦激光扫描显微镜的单个肝细胞（有关协议，请参阅Taira等人，2007年). 这些作者表明，resorufin生产是特定的。乙氧基间苯二酚和间苯二芬都具有荧光，但波长不同。乙氧基resorufin和resorufin的激发波长分别为450 nm和540 nm，发射波长分别为560 nm和610 nm。显示了在分离的肝细胞中产生的间苯二酚。除了在环境研究中作为生物标记物应用外，它还可以应用于毒理学研究(Taira等人，2007年;Barhoumi等人，2009年).
乙氧基间苯二酚活性在活体大鼠肝细胞中产生的荧光间苯二醛-O（运行）-代表P450依赖性单加氧酶的脱乙基酶(Taira等人，2007年). resurufin的积累主要发生在细胞核附近，表明其定位于内质网。棒材=10μm。经许可，Taira等人，《细胞生物毒理学》23:143–151，2007年。
类固醇底物
17β-羟基类固醇脱氢酶是一种多功能或兼职蛋白质，可转化类固醇，并参与脂肪酸的β-氧化等功能。酶的缺乏会导致精神和运动技能的丧失。帕金森病患者的大脑活动减少。它结合帕金森氏病的病理标志物β-淀粉样肽Froemming和Sames（2007）这允许在活细胞中进行代谢绘图。
PhiPhiLux和CaspaLux基板
PhiPhiLux和CaspaLux caspase底物（Oncoimmunin；Gaithersburg，MD）被引入为含有淬灭罗丹明的细胞透性荧光caspase基质(Komoriya等人，2000年;Telford等人，2002年). 这些底物通过扩散进行的细胞渗透令人惊讶，因为它们含有一个由18个氨基酸组成的环状肽，具有半胱氨酸蛋白酶裂解位点，并且在两端有一个罗丹明分子相互结合并因此被猝灭。甚至有人声称底物进入活细胞的细胞器(Telford等人，2002年). 尽管具有这些特性，但近年来，除了检测活体肠绒毛顶部上皮细胞脱落过程中的凋亡外，底物很少用于检测活细胞中的caspase活性(Watson等人，2005年).
NucView基板
最近开发的DEVD-NucView488 caspase-3荧光底物与FLICA和PhiPhiLux底物相比，在实时检测活细胞凋亡方面具有优越的性能(Cen等人2008). 底物具有很高的细胞渗透性，在半胱氨酸蛋白酶-3裂解后与DNA结合时，产物具有强荧光。未观察到毒性，凋亡细胞在此过程中进展正常。与DNA的结合使凋亡形态学的荧光成像成为可能。研究发现，在DEVD-NucView488存在下变为荧光的细胞百分比与annexin-V染色测定的凋亡细胞数量最为匹配。它似乎是实时成像活细胞凋亡的首选底物。
FRET基板
基于FRET的底物是有吸引力的活细胞代谢图谱底物，如Boonacker和Van Noorden（2001）。含有两个引起FRET的不同相邻荧光团的底物的水平可以在细胞中测定，也可以在没有FRET现象的情况下测定产物的形成，从而能够测定酶的局部动力学参数。PhiPhiLux半胱天冬酶底物已改性为基于FRET的底物(Myc等人，2007年).
激酶活性已使用基于FRET的底物可视化(Nagai等人，2000年). 开发了两种位于转录因子cAMP依赖性蛋白激酶A的激酶诱导结构域侧翼的GFP变体作为底物。底物的磷酸化降低GFP之间的FRET，从而在活细胞中实现成像激活动力学。因为底物是通过转染基因的转录由细胞表达的，所以没有细胞通透性障碍。希望能为其他激酶开发出类似的底物，以便在活细胞中进行激酶活性成像。此外，用同样的方法可以成像出使相同蛋白质去磷酸化的特定磷酸酶活性。这种方法在未来非常有前景，前提是基因构建可以用于被特定激酶磷酸化和被特定磷酸酶去磷酸化的蛋白质。有关原理和协议，请参阅Baruch等人（2004）.
显色底物
最近开发了许多合成底物，它们通过酶活性转化为有色产品。这些底物通常既有显色性又有荧光性。如上所述，有色反应产物相对于荧光产物的优势在于，在显微镜下检测细胞中的有色反应产物所需的光剂量相对较低，因此与基于荧光的方法相比，这些方法的细胞毒性较小。另一方面，荧光产品具有更好的空间分辨率，因为荧光在黑暗中充当灯泡，而彩色产品吸收光线（例如，比较和具有和). 另一方面，当对细胞成像时，可以使用图像分析对每个细胞进行定量测量，当对组织冷冻切片成像时，也可以使用单位体积组织进行定量测量() (Chieco等人，1994年,2001). 本文不综述非固定低温恒温器切片的显色方法，因为有效的特异性和定量方法已在以下方面进行了综述：Lojda等人（1979年）,斯托沃德和皮尔斯（1991），以及Van Noorden和Frederiks（1992年,2002)，包括协议。
葡萄糖-6-磷酸酶(A、 B类)和硫胺素焦磷酸酶(C类)大鼠肝脏的光镜活性(A类)和电子显微镜水平(B、 C类). 使用半透膜作为凝胶培养基和冷冻段之间的组织保护剂培养未固定的冷冻段(Song等人，1996年). 棕色的(A类)电子密度(B、 C类)反应产物是磷酸铅，在葡萄糖-6-磷酸存在下由磷酸酶活性产生(A、 B类)或磷酸硫胺素(C类)和铅离子。葡萄糖-6-磷酸酶在肝小叶门脉周围区（pp）比中央周围区（pc）更为活跃(A类)并定位于内质网（er）的内腔，已知内质网中存在酶(B类). 当葡萄糖-6-磷酸被硫胺素磷酸取代时，电子致密反应产物磷酸铅存在于高尔基体（ga）的内腔中，已知该酶位于此处。m、 线粒体；n、 细胞核；nu，核仁；g、 颗粒。酒吧：A类=200微米；B、 C类=1微米。
这些方法的底线是，冷冻切片中组织的分子组成必须保持完整。当冷冻切片在水介质中培养时，大量大分子从切片中扩散到介质中，留下切片的骨骼状图像。因此，必须对切片进行保护，方法是向培养基中添加聚乙烯醇，使其拥挤，类似于冷冻切片中的细胞质。这样，只有小分子从培养基扩散到切片中，反之亦然() (Van Noorden和Vogels 1989年;Van Noorden和Frederiks 1992年).
或者，在切片和凝胶培养基之间插入半透膜，再次将大分子保持在切片中的适当位置(Song等人，1996年;Schellens等人，2003年). 这些保护措施保持酶的活性和切片组织的形态不受影响，培养后甚至可以进行电子显微镜检查(). 冷冻组织通常具有可用于电子显微镜的形态(Vogels等人，1993年,2009)，尽管普遍认为这是不可能的，因为在冷冻过程中会形成冰晶。即使在组织保护条件下酶培养后的冷冻切片也显示出可接受的形态。通过这种方式，酶活性可以精确定位()并使用图像分析进行测量() (Chieco等人，1994年,2001). 用这种方法可以原位测定动力学参数。这些参数可能与稀释溶液中的参数有显著不同(Van Noorden and Butcher 1991年;Van Noorden等人1997a;Boonacker等人，2002年).
Winzer等人（2001）应用显色四氮唑盐法定量测定从牙鲆分离的活肝细胞中的G6PD活性，以检测污染对肝脏代谢的影响。这一方法使他们能够解释为什么雌性比目鱼（而非雄性比目鱼）在沿海和河口地区由于化学污染的生物效应而患上肝癌(Koehler和Van Noorden 2003年). 研究表明，NADPH是关键的代谢产物，因为它用于解毒，特别是在这些生物体的肝脏中，而NADPH也需要用于卵母细胞雌性肝脏中卵黄蛋白原（蛋清）的合成。得出的结论是，后一个过程比NADPH解毒过程具有更高的优先级，因为从进化角度来看，生殖成功比单个雌性的生存更为相关。
G6PD活性在人类红细胞中定位的方法与检测G6PD缺乏症的方法相同，G6PD缺陷症是一种X染色体传播的红细胞疾病，影响全球4亿人。男性要么有缺陷，要么没有缺陷，但女性可能有杂合缺陷，这会导致红细胞缺乏，而红细胞缺乏(). G6PD活性的代谢图谱是确定杂合缺陷的唯一方法(Peters和Van Noorden 2009). G6PD缺乏症主要出现在疟疾流行或已经流行的地区。疟疾的治疗药物可导致G6PD缺乏者严重溶血。建议使用廉价且易于执行的测试，如荧光斑点测试，来诊断男性，并使用代谢图谱来诊断女性。这些方法正被应用于各种诊所的诊断(Gurbuz等人，2005年).
Gal-2SBPO是一种新型的双显色和荧光底物，是β-半乳糖苷酶的底物，其产物2SBPO在630 nm处具有吸收峰，在670 nm处发出荧光。还合成了2SBPO的肽偶联物，用于蛋白质水解活性的代谢图谱，如二肽基肽酶IV的代谢图谱(Ho等人，2006年,2007).
β-半乳糖苷酶的另一种显色和荧光底物DDAOG也可用于体内和活细胞。其产物具有远红外荧光特性。基质本身也是荧光的。β-半乳糖苷酶裂解后，斯托克斯位移为50 nm至红色(Tung等人，2004年). β-半乳糖苷酶是一种常用的报告基因，类似荧光素酶和荧光蛋白。
新颖的技术
许多有趣的替代显微镜方法正在开发中，用于成像活细胞和组织中的代谢过程。这里简要讨论这些问题。
偏振敏感共焦显微镜
极化敏感共焦荧光显微镜成像酶活性由毕格罗等人（2004）用Body-FL标记的牛血清白蛋白作为胰蛋白酶和蛋白酶K的底物进行蛋白水解，绘制了高分辨率图谱。成像原理是基于荧光各向异性作为荧光偏振状态的测量。与猝灭型荧光基质相比，其主要优点是基质和产物都具有荧光性，但只有各向异性不同。因此，可以在细胞室和产品形成中确定局部底物浓度。
结论
酶组织化学是最古老的组织化学技术。Gomori于1939年创立了酶组织化学，当时他发表了检测细胞内磷酸酶活性的方法。免疫组织化学和原位杂交是几十年后才引入的。尽管Novikoff、Karnovsky、Seligman、Pearse、De Duve、Holt、Chayen、Butcher、Lojda和Gossrau等巨头扩展并验证了酶组织化学armentarium(斯托沃德和皮尔斯1991)在上个世纪的80年代和90年代，这种方法失去了对免疫组织化学和原位杂交的影响。基因和基因表达受到了几乎所有的关注。研究酶活性被认为是过时的，直到科学家意识到基因表达对我们的功能影响甚微。在本世纪的第一个十年里，酶活性定位和成像因其专注于功能而得到了强劲的复兴。活细胞、组织和动物的成像，结合酶活性的定位，成为代谢图谱的有力匹配。用于新陈代谢图谱绘制的armentarium正在迅速扩大，并且可以通过其活动成像的酶的列表正在变得越来越长。在活细胞、组织和动物中进行代谢绘图的前景看起来很光明。
