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癌细胞。作者手稿；PMC 2011年5月18日发布。
以最终编辑形式发布为：
癌细胞。2010年5月18日；17(5): 510–522.
2010年4月15日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.ccr.2010.03.017
预防性维修识别码：项目经理2872684
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院198493
PMID：20399149

定义胶质瘤独特亚群的CpG岛甲基化表型的鉴定

Houtan Noushmehr公司,1,* 丹尼尔·韦森伯格（Daniel J.Weisenberger）,1,* 克里斯汀·迪夫斯,2,* 海蒂·S·菲利普斯,三 卡南·普贾拉,三 本杰明·P·伯曼,1 飞盘,1 克里斯托弗·佩洛斯基,4 埃里克·苏尔曼,4 克里希纳·P·巴特,2 Roel G.W.Verhaak公司,5,6 凯瑟琳·霍德利,7,8 D.尼尔·海斯,7,8 查尔斯·佩罗,7,8 希瑟·K·施密特,9 李丁,9 理查德·威尔逊,9 大卫·范登伯格,1 慧申,1 亨利克·本特森,10 皮埃尔·诺维亚尔,10 莱斯利·M·科普,11 乔纳森·巴克利,1,12 詹姆斯·赫尔曼,11 斯蒂芬·巴林,11 彼得·莱尔德,1,**† 肯尼斯·阿尔达佩,2,**和癌症基因组图谱研究网络
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关联数据

补充资料

总结

我们在癌症基因组图谱（TCGA）的背景下，分析了272例胶质母细胞瘤肿瘤中启动子DNA甲基化的变化。我们发现，样本的一个明显子集在大量位点上显示协同超甲基化，表明存在胶质瘤-CpG岛甲基化表型（G-CIMP）。我们在一组非TCGA胶质母细胞瘤和低级别胶质瘤中验证了G-CIMP。G-CIMP肿瘤属于前神经亚组，在低度恶性胶质瘤中更为常见，表现出明显的拷贝数改变，与印尼盾1体细胞突变。G-CIMP肿瘤患者在诊断时较年轻，且预后显著改善。这些发现从分子和临床角度确定G-CIMP是人类胶质瘤的一个独特亚群。

关键词：DNA甲基化、胶质瘤、CIMP、IDH1、TCGA

介绍

人脑胶质瘤表现为异质性疾病，主要由肿瘤细胞的组织学外观来定义。星形细胞瘤和少突胶质瘤构成浸润性胶质瘤(Adamson等人，2009年). 起源的细胞尚未确定，然而，晚期胶质瘤中致瘤性干细胞样前体细胞的鉴定表明，人脑胶质瘤可能起源于神经干细胞(Canoll和Goldman，2008年;德克斯，2006;Galli等人，2004年).

世界卫生组织（WHO）根据组织学分级对胶质瘤进行了细分，这是分化状态、恶性潜能、治疗反应和生存率的指标。胶质母细胞瘤（GBM），也称为IV级胶质瘤，占所有胶质瘤的50%以上(Adamson等人，2009年). GBM患者的总体中位生存时间只有15个月(Brandes等人，2001年;Martinez等人，2010年;Parsons等人，2008年). 大多数GBM被诊断为从头开始或原发性肿瘤，男性更常见。约5%的GBM肿瘤被称为继发性GBM，是低度恶性肿瘤（II/III级）的进展，见于年轻患者，在性别间分布更均匀，生存时间更长（参见(Adamson等人，2009年;Furnari等人，2007年).

目前，人们对描述和编译人类GBM肿瘤的基因组和转录组变化以确定异常功能的分子通路和肿瘤亚型非常感兴趣。癌症基因组图谱（TCGA）试点项目确定了一组GBM肿瘤的原始DNA序列和拷贝数、DNA甲基化、基因表达和患者临床信息的遗传变化(癌症基因组图谱研究网络，2008年). TCGA还重申了TP53型,PTEN公司,EGFR、RB1 NF1,ERBB2号机组,PIK3R1、和PIK3CA公司突变并检测到NF1型GBM患者的突变(癌症基因组图谱研究网络，2008年). 使用更全面的方法对原发性GBM肿瘤进行DNA测序分析(Parsons等人，2008年)还发现了异柠檬酸脱氢酶1的新的体细胞突变(印尼盾1)在所有GBM患者中有12%发生这种情况。印尼盾1仅在第132密码子的精氨酸残基检测到突变，最常见的变化是R132H突变(Parsons等人，2008年;Yan等人，2009年)这使得α-酮戊二酸直接催化合成R（右）（−）-2-羟基戊二酸(Dang等人，2009年).印尼盾1继发性GBM病例、年轻个体的突变丰富，同时患者生存率增加(Balss等人，2008年;Hartmann等人，2009年;Yan等人，2009年). 较高的IDH1型突变率见于II级和III级星形细胞瘤和少突胶质瘤(Balss等人，2008年;Bleeker等人，2009年;Hartmann等人，2009年;Yan等人，2009年)，表明印尼盾1突变通常发生在进展型胶质瘤中，而不是发生在从头开始GBM。相关基因突变IDH2型基因频率较低，通常与包含印尼盾1突变(Hartmann等人，2009年;Yan等人，2009年).

癌症特异性DNA甲基化变化是人类癌症的标志，其中，全球DNA低甲基化通常与CpG岛的高甲基化同时出现（综述于(Jones和Baylin，2007年)). 启动子CpG岛超甲基化通常导致相关基因的转录沉默(Jones和Baylin，2007年). CpG岛超甲基化事件也被证明可作为人类癌症的生物标志物，用于血液和其他体液的早期检测，用于预后或预测治疗反应以及监测癌症复发(莱尔德，2003年).

丰田及其同事首次在人类结直肠癌中发现了CpG岛甲基化表型（CIMP）(Toyota等人，1999年)作为肿瘤子集中基因子集的癌症特异性CpG岛超甲基化。我们使用MethyLight技术确认并进一步表征了大肠CIMP(Weisenberger等人，2006年). 结直肠CIMP的特征是近端结肠肿瘤，与BRAF公司突变和微卫星不稳定性MLH1型启动子超甲基化与转录沉默(Weisenberger等人，2006年).

DNA甲基化改变在人脑胶质瘤中已被广泛报道，并且已有多篇报告显示人类GBM和其他胶质瘤亚型中启动子相关的CpG岛超甲基化(Kim等人，2006年;Martinez等人，2009年;Martinez等人，2007年;Nagarajan和Costello，2009年;Stone等人，2004年;Tepel等人，2008年;Uhlmann等人，2003年). 几项研究已经注意到原发性和继发性GBM在表观遗传学变化方面的差异。总体而言，继发性GBM的启动子甲基化频率高于原发性GBM(Ohgaki和Kleihues，2007年). 特别是RB1型发现在次要GBM中的常见率约为三倍(Nakamura等人，2001年).

超甲基化MGMT公司启动子相关的CpG岛在很大比例的GBM患者中显示(Esteller等人，2000年;Esteller等人，1999年;Hegi等人，2005年;Hegi等人，2008年;赫尔曼和巴林，2003年).MGMT公司编码O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶，该转移酶从鸟嘌呤的O-6位置移除烷基。GBM患者MGMT公司高甲基化显示出对替莫唑胺等碱性药物的敏感性，并伴随着改善的结果(Esteller等人，2000年;Esteller等人，1999年;Hegi等人，2005年;Hegi等人，2008年;赫尔曼和巴林，2003年). 然而，最初的启动子甲基化MGMT公司与替莫唑胺联合治疗，可能会导致选择性压力，导致失配修复功能丧失，导致具有高突变表型的侵袭性复发肿瘤(Cahill等人，2007年;Hegi等人，2005年;Silber等人，1999年;癌症基因组图谱研究网络，2008年).

在这里，我们报告了为TCGA收集的272个GBM肿瘤的DNA甲基化分析，并将其扩展到低度恶性肿瘤，并描述了显示CIMP的人脑胶质瘤的不同亚群。

结果

GBM患者中不同DNA甲基化亚群的鉴定

我们在一组272个TCGA GBM样本中测定了DNA甲基化谱。在本研究开始时，我们依赖于Illumina GoldenGate平台，使用标准的Cancer Panel I和定制的阵列(癌症基因组图谱研究网络，2008年) (图S1A-C，实验程序），但迁移到更全面的Infinium平台(图1,图S1C)，因为它是可用的。DNA甲基化测量与两个平台之间共享的CpG二核苷酸高度相关（Pearson’s第页= 0.94,图S1D). 这两个平台都对每个基因大约两个CpG二核苷酸的样本进行了检测。尽管这意味着可以对一些启动子的非代表性CpG进行评估，但考虑到非常高程度的局部相关DNA甲基化行为，大多数基因启动子可能会获得代表性的结果(Eckhardt等人，2006年).

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TCGA GBM肿瘤和对照样本的聚类确定了CpG岛甲基化表型（G-CIMP）

使用1503个Infinium DNA甲基化探针进行无监督一致性聚类，这些探针的DNA甲基化β值在91个TCGA GBM样本中变化最大。DNA甲基化簇通过面板顶部的色码进行区分：红色共识簇1（n=12个肿瘤）；蓝色共识簇2（n=31个肿瘤）；绿色一致性聚类3（n=48个样本）。每个DNA甲基化簇内的每个样本都按照其基因表达簇成员（前神经、神经、经典和间充质）的关键描述进行了着色标记。五个基因的体细胞突变状况(表皮生长因子受体,印尼盾1,NF1型,PTEN公司、和TP53型)黑色方块表示，灰色方块表示样本中没有突变，白色方块表示该基因未在特定样本中筛选。G-CIMP阳性样本标记在矩阵底部。A）共识矩阵由k平均值群集(K（K）= 3). 样本以相同的顺序列在x个和年轴。共识指数值的范围为0到1，0表示差异很大，1表示非常相似。B）相同1503个最变异探针的一维层次聚类，保留图1A中相同的样本顺序。每行代表一个探针；每列代表一个样本。每个样本中每个探针的DNA甲基化水平（β值）用图例中所示的色标表示；白色表示缺少数据。M。新加坡证券交易所I处理的DNA（n=2）、WGA-DNA（n=2）和正常大脑（n=4）样本包括在热图中，但对无监督聚类没有贡献。八个对照样本中的探针与y轴GBM样本热图。另请参见图S1和表S1.

我们在每个平台上选择了变异最大的探针，并进行一致性聚类以识别GBM亚组(Monti等人，2003年). 我们使用GoldenGate或Infinium数据确定了三个DNA甲基化簇，在两个平台上运行的样本的簇成员调用中有97%的一致性（61/63）(表S1). 簇1在两个平台上形成了一个特别紧密的簇，具有高度特征的DNA甲基化特征(图1,图S1)这让人想起结直肠癌中描述的CpG岛甲基化表型(Toyota等人，1999年;Weisenberger等人，2006年). 结直肠癌中的CIMP的特征是肿瘤亚群中基因亚群的相关癌症特异性CpG岛超甲基化，而不仅仅是整个基因组中通用CpG岛甲基化频率的随机增加(丰田等，1999年;Weisenberger等人，2006年). 簇1 GBM样本在一个位点子集上显示出类似的协同甲基化变化。因此，我们将簇1肿瘤指定为具有胶质瘤CpG岛甲基化表型（G-CIMP）。结合Infinium和GoldenGate数据，272份TCGA GBM样本中有24份（8.8%）被鉴定为G-CIMP亚型(表S1).

基因表达簇内G-CIMP肿瘤的特征

四种基因表达亚型（前神经型、神经型、经典型和间充质型）先前已通过TCGA GBM样本进行鉴定和表征(Verhaak等人，2010年). 我们将每个样本的DNA甲基化共识簇分配与其基因表达簇分配进行了比较(图1,图2A,图S1A–B,表S1). G-CIMP样本簇在原神经性GBM肿瘤中高度富集，而DNA甲基化簇2和簇3分别在经典表达组和间充质表达组中中度富集。在24例G-CIMP肿瘤中，21例（87.5%）属于神经前表达组。这些G-CIMP肿瘤占所有神经原性GBM肿瘤的30%（21/71），表明G-CIMP瘤是神经原性GB M肿瘤的一个独特亚群(图2A和图S2A,表S1). 少数非脑源性G-CIMP肿瘤属于神经（2/24肿瘤，8.3%）和间叶（1/24肿瘤，4.2%）基因表达组。

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G-CIMP肿瘤作为原神经基因表达亚群中GBM的一个独特亚型的特征

A）整合每个DNA甲基化和基因表达簇中的样本。样品主要根据其基因表达亚型进行分类：P（P），发音；N个，神经；C类，经典；M（M），间充质。每个DNA甲基化簇内肿瘤的数量和百分比(红色，集群1（G-CIMP）；蓝色集群2；绿色，簇3）表示每个基因表达亚型。B）基因表达和DNA甲基化簇的成对比较散点图图1和图S1相同的双字母代表自我比较，而混合双字母代表基因表达和DNA甲基化之间的成对相关性。轴颠倒以说明相似性增加。C）GBM患者在每个基因表达簇中诊断时的年龄分布。样本由沿着每个抖动图顶部确定的基因表达簇划分，并由每个表达子组中的G-CIMP状态进一步细分。G-CIMP阳性样本表示为红色数据点，G-CIMP阴性样本表示为黑色数据点。每个亚组的诊断年龄中位数用水平实心黑线表示。D–F）GBM甲基化和基因表达亚型的Kaplan-Meier生存曲线。在每个曲线图中，生存率百分比与诊断后的时间（以周为单位）进行曲线图绘制。所有存活数据超过五年的样本都被审查。D）四种GBM表达亚型之间的Kaplan-Meier生存曲线。神经前肿瘤在蓝色，神经肿瘤在绿色，典型肿瘤在红色间充质肿瘤金.E）三个DNA甲基化簇之间的Kaplan-Meier生存曲线。1组肿瘤位于红色，第2组肿瘤位于蓝色第三组肿瘤位于绿色.F）神经前G-CIMP阳性、神经前G-CIMP阴性和所有非脑GBM肿瘤之间的Kaplan-Meier生存曲线。前神经G-CIMP阳性肿瘤位于红色，神经前G-CIMP阴性肿瘤位于蓝色所有非脑GBM肿瘤都在黑色。另请参阅图S2.

为了综合了解G-CIMP状态和基因表达差异之间的关系，我们对不同分子亚群的成员进行了配对比较(图2B). 我们计算了五种不同亚型（G-CIMP阳性前神经、G-CIMP阴性前神经、经典、间叶和神经肿瘤）每种可能成对组合的DNA甲基化和表达的平均欧氏距离。我们观察到普通合伙人,GN（通用）,GC公司、和总经理对(图2B)支持G-CIMP阳性肿瘤是GBM肿瘤的一个独特的分子亚群的假设，更具体地说，G-CIMP状态进一步完善了神经前体亚群。事实上，在神经前肿瘤中，G-CIMP阳性肿瘤与间叶肿瘤明显不同(总经理而G-CIMP阴性的神经前肿瘤与间叶肿瘤相对相似(颗粒物配对）。我们将下游分析重点放在前神经亚群中G-CIMP阳性与G-CIMP阴性肿瘤之间的比较上，以避免将前神经特征误认为G-CIMP相关特征。

G-CIMP肿瘤的临床特征

我们通过回顾每个患者可用的临床协变量，进一步确定了G-CIMP肿瘤的特征。尽管神经前GBM肿瘤患者比所有其他非脑GBM患者（平均年龄57.5岁）稍年轻（平均年龄56岁），但这在统计学上并不显著（p=0.07）。然而，与非G-CIMP神经前肿瘤患者相比，G-CIMP肿瘤患者在诊断时明显年轻（中位年龄分别为36岁和59岁；p<0.0001；图2C).

与其他基因表达亚型相比，前神经亚型患者的总体生存率没有显著提高(图2D)，但根据DNA甲基化状态定义的组的存活率存在显著差异(图2E、2F,图S2B). 我们观察到，与神经前G-CIMP阴性患者（中位生存期42周）或所有其他非神经性GBM患者（中位数生存期54周）相比，神经前G-CIMP阳性患者的生存期明显更好（中位存活期150周）。在Cox多变量分析中，调整患者年龄、复发与非复发肿瘤状态以及继发GBM与原发GBM状态后，G-CIMP状态仍然是患者生存率提高的重要预测因素（p=0.0165）。

G-CIMP肿瘤中IDH1序列的改变

9个基因被发现具有与神经原性G-CIMP阳性肿瘤显著相关的体细胞突变(图S3A,表S2).印尼盾1体细胞突变，最近主要在继发性GBM肿瘤中发现(Balss等人，2008年;Parsons等人，2008年;Yan等人，2009年)，在我们的数据集中与G-CIMP紧密相关(表1)，有18个印尼盾1主要在23例（78%）G-CIMP阳性肿瘤和184例G-CIMP阴性肿瘤中观察到突变印尼盾1-野生型（p<2.2×10−16). G-CIMP阳性的5例不一致病例，印尼盾1-与G-CIMP阳性相比，野生型在年龄上没有显著差异，印尼盾1-突变型（中位年龄分别为34岁和37岁；p=0.873）。然而，G-CIMP阳性的五个不一致的病例，印尼盾1-与G-CIMP阴性患者相比，野生型肿瘤在诊断时明显年轻，印尼盾1-野生型（中位年龄分别为37岁和59岁；p<0.008）。有趣的是，五名患者中有两名在诊断后存活了五年以上。我们没有观察到任何IDH2公司TCGA数据集中的突变。肿瘤同时显示G-CIMP阳性和印尼盾1突变在原发性GBM中发生频率较低，但在16个复发（治疗）肿瘤中富集，在4个继发性GBM中甚至更高(表1). 我们还发现了与神经原性G-CIMP阳性肿瘤显著相关的种系突变（9个基因）和杂合性缺失（6个基因）的例子(图S3B-C,表S2).

表1

G-CIMP和印尼盾1原发性、继发性和复发性GBM的突变状态

比较所有分析的GBM肿瘤的G-CIMP和IDH1突变状态（p<2.2x10−16)、原发性肿瘤、复发性肿瘤和继发性肿瘤。P值通过费希尔精确试验计算得出。另请参见图S3和表S2.

所有肿瘤G-CIMP公司总计
−+
IDH1型野生型1845189
突变体01818
总计18423207
原发性肿瘤G-CIMP公司总计
−+
印尼盾1野生型1714175
突变体01212
总计17116187
复发性肿瘤G-CIMP公司总计
−+
印尼盾1野生型12012
突变体044
总计12416
次要G-CIMP公司总计
肿瘤−+
印尼盾1野生型112
突变体022
总计1三4

神经前G-CIMP肿瘤的拷贝数变异

为了阐明神经原性G-CIMP阳性肿瘤中的关键改变，我们分析了基因中心拷贝数变化数据（参见补充信息). 我们确定了神经原性G-CIMP阳性和G-CIMP阴性肿瘤之间2875个基因的显著拷贝数差异(图3A,表S3). 尽管7号染色体扩增是侵袭性GBM肿瘤的标志(癌症基因组图谱研究网络，2008年)前神经G-CIMP阳性肿瘤中，沿着7号染色体的拷贝数变异减少。确定了染色体8q23.1-q24.3和10p15.3-p11.21的增益(图3B和3C). 8q24区域包含MYC公司癌基因富含序列变异，以前曾被证明是几种人类癌症的危险因素(Amundadottir等人，2006年;Freedman等人，2006年;Haiman等人，2007a;Haiman等人，2007b;舒马赫等人，2007年;Shete等人，2009年;Visakorpi等人，1995年;Yeager等人，2007年). 在神经原性G-CIMP阳性肿瘤中，伴随着染色体10p的增加，我们还检测到G-CIMP阴性肿瘤中相同染色体臂的缺失(图3C). 比较所有G-CIMP阳性和G-CIMP阴性样本时，获得了相似的拷贝数变化结果(图S4). 这些发现表明，与G-CIMP阴性肿瘤相比，G-CIMP阳性肿瘤具有明显的拷贝数变异特征。

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G-CIMP基因组中拷贝数变异的重要区域

23748个基因座的拷贝数变异（横跨22个常染色体，并沿x个-axis）进行分析。纯合缺失以深蓝色表示，半合缺失以浅蓝色表示，中性/白色无变化，增益以浅红色表示，高级扩增以深红色表示。A）前神经G-CIMP阳性和G-CIMP阴性肿瘤之间的拷贝数差异。列出了Cochran-Armitage趋势、总扩增/缺失百分比和原始拷贝数值测试。日志10（FDR调整P（P）值）在G-CIMP阳性和G-CIMP阴性前神经之间沿年-“调整后的P值正负”面板中的轴。在此面板中，红色垂直线表示重要性。8q23.1-q24.3和10p15.2-11.21中的基因区域用星号标识，并在面板中突出显示B类和C类分别是。另请参见图S4和表S3.

神经原性G-CIMP肿瘤DNA甲基化和转录组表达变化的鉴定

为了更好地了解胶质母细胞瘤中CpG岛超甲基化，我们研究了这些样本的差异甲基化CpG位点(图1B). 在3153个CpG位点中，有3098个（98%）位点在前神经G-CIMP阳性和前神经G-CIMP阴性肿瘤之间发生了不同程度的甲基化(图4A). 总共有1550个独特的基因，其中1520个基因在其启动子区域内被高甲基化，30个基因被低甲基化。我们通过降低调整后的p值和增加β值差异来对探针列表进行排序，以确定神经原性G-CIMP阳性肿瘤中差异最大的超甲基化CpG探针(表S3).

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前神经G-CIMP阳性和G-CIMP阴性肿瘤转录组与表观遗传学差异的比较

A）为G-CIMP关联分析的所有CpG基因座的火山图。前神经G-CIMP阳性和前神经G-CIMP阴性肿瘤之间DNA甲基化的β值差异绘制在x轴上，而FDR校正的Wilcoxon签名秩检验的前神经G-CIMP阳性肿瘤和前神经G-CIMP阴性肿瘤间差异的p值绘制在y轴上（−1*log10标度）。两个亚型之间有显著差异的探针被涂成红色。B）安捷伦基因表达平台上分析的所有基因的火山图。C）星爆图用于比较TCGA Infinium DNA甲基化和安捷伦基因表达数据，该数据通过11984个独特基因的拷贝数信息进行标准化。日志10（FDR调整P（P）值）绘制DNA甲基化曲线(x个-轴）和基因表达(年-轴）。如果G-CIMP阳性肿瘤中的平均DNA甲基化β值或平均基因表达值较高（大于零），则-1乘以log10（FDR-调整P（P）值），提供正值。黑色虚线表示FDR调整P（P）值为0.05。中的数据点红色表明那些基因表达水平显著上调或下调，并且在原神经G-CIMP阳性肿瘤中显著低甲基化或高甲基化的肿瘤。中的数据点绿色表明与前神经G-CIMP阴性肿瘤相比，前神经G-CIMP阳性肿瘤中的基因表达水平显著下调且高甲基化的基因。另请参见图S5和表S3.

安捷伦转录组数据用于检测在G-CIMP阳性和阴性前神经样本中显示差异表达和G-CIMP DNA甲基化的基因。根据区域拷贝数变化调整基因表达值，如补充信息在神经原性G-CIMP阳性肿瘤中，共有1030个基因显著下调，654个基因显著上调(图4B,表S3). 差异下调基因集高度富集了多糖、肝素和糖胺聚糖结合、胶原蛋白、血小板反应蛋白和细胞形态发生（p<2.2E-04，表S3). 此外，显著上调的基因集在涉及转录调控、核酸合成、代谢过程和基于钙粘蛋白的细胞粘附的功能类别中高度富集（p<6.2E-04）。锌指转录因子也被发现在表达显著上调的基因中高度富集（p=3.1E-08）。当进行排列分析和使用Affymetrix基因表达数据时，也获得了类似的结果（数据未显示）。我们还鉴定了20个miRNAs，它们在神经原性G-CIMP阳性和神经原性G-CIMP阴性肿瘤之间的基因表达存在显著差异(图S5,表S3).

标准化基因表达和DNA甲基化基因列表的整合确定，与原神经亚群中的G-CIMP阴性肿瘤相比，G-CIMP阳性肿瘤中总共有300个基因具有显著的DNA超甲基化和基因表达变化。其中，263例在神经前G-CIMP阳性肿瘤中显著下调和高甲基化(图4C，右下象限）。为了验证这些差异表达和甲基化基因，我们使用替代表达平台（Affymetrix）重复了分析，并得出了一致的结果(图S5). 排名靠前的基因包括FABP5、PDPN、CHI3L1和LGALS3型(表2)，在一项独立的分析中被确定为GBM的高预后，高表达与较差的预后相关(Colman等人，2010年). 基因本体分析显示，与间充质亚型、肿瘤侵袭和细胞外基质相关的基因的G-CIMP特异性下调是最重要的术语(表S3). 在转录沉默、染色质结构修饰和细胞代谢过程激活中起作用的基因在原神经G-CIMP阳性肿瘤中的基因表达增加。原神经G-CIMP阳性样本中差异表达的其他基因见表S3.

表2

神经前G-CIMP阳性肿瘤中前50个差异最大的高甲基化和下调基因

基因通过减少基因表达日志进行排序2比率。β值差异表示神经前体G-CIMP阳性和神经前体G-CIMP阴性之间的β值平均值（DNA甲基化值）的差异。折叠更改是日志2神经前体G-CIMP阳性和神经前体G-CIMP阴性表达强度平均值的比率。另请参见表S3.

基因名称DNA甲基化基因表达
Wilcoxon等级P值贝塔值差异Wilcoxon等级P值折叠更改
G0S2号机组2.37E-07号0.762.12E-13号机组−3.92
RBP1型2.37E-07号0.841.07E-14号机组−3.9
FABP5公司2005年3月30日0.31.39E-12号机组−3.53
CA3类4.50电子-060.432.06E-06年−2.82
RARRES2公司4.74E-07号0.636.25E-10版−2.69
OCIAD2型2.06E-04年0.321.23E-08−2.64
加州承载比12005年3月30日0.373.77E-09年−2.45
PDPN（PDPN）3.87E-03型0.231.47E-07年−2.43
LGALS3型2.37E-07号0.722009年9月7日−2.42
CTHRC1型3.50E-04型0.451.44E-07号机组−2.34
CCNA1型4.66E-03型0.292.95E-05年−2.14
臂c31.76E-03号机组0.317.76E-05号−2.13
瑞士标准65.74E-04号机组0.222006年9月7日−2.11
C11或632.37E-07号0.647.95E-11号机组−2.05
GJB2型2.16E-03型0.242.94E-07号−2.04
KIAA0746号机组1.66E-060.582.97E-07年−1.94
莫斯科2号2.37E-07号0.666.85E-12型−1.91
CHI3L1公司2006年11月7日0.134.11E-06年−1.9
RARRES1公司6.38电子050.415.93E-09−1.89
AQP5类4.50E-06型0.436.86E-14号机组−1.87
SPON2号机组8.68E-05年0.32.50E-05−1.87
RAB36型2.06E-04年0.266.49E-11号机组−1.86
CHRDL2公司2.64E-03型0.071.15E-07（2007年1月15日）−1.81
TOM1L1型2.37E-07号0.664.57E-14号机组−1.8
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LDHA公司4.50E-04型0.551.83E-07号机组−1.74
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DKFZP586H2123型1.59E-05型0.534.83E-05−1.66
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FLJ21963型4.60E-05年0.262007年8月7日−1.63
CRYGD公司2007年4月7日0.542.81E-08年−1.62
LECT1级5.74E-04号机组0.323.73E-07号−1.61
EPHX2型2.37E-07号0.533.73E-06日−1.6
LGALS8型3.20E-03日0.194.15E-13段−1.6
C7或462.37E-07号0.354.11E-06年−1.58
第三层2.37E-07号0.624.76E-08年−1.57
TTC12型9.48E-07段0.534.52E-06号机组−1.57
ITGBL1公司1.42E-03型0.21.86E-07号机组−1.57
B3GNT5型1.66E-060.662.36电子-07−1.55
非甲烷NAT32005年3月30日0.625.93E-09−1.55
FZD6型6.38电子050.342006年2月28日−1.55
FKBP5型9月16日至04日0.232009年9月22日−1.54
SLC25A20型1.56E-04型0.61.41E-08年−1.53
基质金属蛋白酶92.06E-04年0.372.09E-03版−1.53

为了扩展这些发现，对差异沉默的基因进行NextBio(www.nextbio.com网站)meta分析，以确定与我们的263个高甲基化和低调节基因列表显著相关的数据集。与之前发布的各种数据集中的GBM相比，低、中粒度胶质瘤中的下调基因存在重叠(Ducray等人，2008年;Liang等人，2005年;Sun等人，2006年) (图S5,表S3). 263个基因集与每个额外数据集的重叠不太可能是偶然的（所有分析p<0.00001）。为了进一步描述该基因集的特征，我们在一组Affymetrix分析数据中测试了这些基因表达值的生存相关性，这些数据来自已发布的和公开的、可获得临床注释的来源。该数据集包括伦勃朗数据集中的队列(Madhavan等人，2009年)以及其他来源，并且不包括TCGA数据（因为TCGA数据用于推导基因列表）。在这个组合数据集中，263-基因集的表达与患者的预后显著相关(图S5G). 总之，这些发现表明G-CIMP阳性的GBM肿瘤具有表观遗传相关的基因表达差异，这与低度恶性胶质瘤以及预后良好的高级肿瘤更为一致。

G-CIMP在GBM中的验证和低度胶质瘤的发病率

为了验证G-CIMP基因座的存在并更好地描述胶质瘤中G-CIMP的频率，MethyLight被用来检测7个高甲基化基因座中8个G-CIMP区域的DNA甲基化水平(安科德43,高频电子设备,MAL公司,LGALS3型,财务会计准则-1,FAS-2型、和RHO-F)和一个次甲基裂解位点，5号码头，在肿瘤样本中。在已知G-CIMP状态（10 G-CIMP阳性和10 G-CIPP阴性）的20个TCGA样本的石蜡包埋组织中评估了这8个标记物。我们观察到阵列平台上的G-CIMP调用与MethyLight标记之间的完美一致性，从而验证了平台和诊断标记面板的技术性能。这20个样本被排除在下面描述的验证集之外。如果至少有六个基因表现为G-CIMP阳性5号码头小组中其余基因的DNA低甲基化和/或高甲基化。使用这些标准，我们测试了一组独立的非TCGA GBM样本的G-CIMP状态。208例肿瘤中有16例（7.6%）为G-CIMP阳性(图5A)，与TCGA数据中的发现非常相似。

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MethyLight在II、III和IV级胶质瘤中的G-CIMP患病率

A）胶质瘤的甲基化分析显示CIMP状态与肿瘤分级相关。在360个肿瘤样本中检测了8个G-CIMP DNA甲基化标记物。每个标记如果甲基化则编码为红色，如果未甲基化则为绿色。其中一个标记(5号码头)在CIMP中未甲基化，而其余七个标记显示G-CIMP特异性超甲基化。如果8个基因中≥6个具有G-CIMP定义的高甲基化或低甲基化，则确定G-CIMP阳性状态。G-CIMP阳性状态用黑线表示(面板右侧)，灰色线表示非G-CIMP。带有标识的样品印尼盾1突变显示为黑线和未知样本印尼盾1突变为灰线。白线表示未知印尼盾1状态。B）G-CIMP状态与按肿瘤分级的患者预后的关系。在每个Kaplan-Meier生存曲线中，G-CIMP阳性病例用红线表示，G-CIMP-阴性病例用黑线表示。C）胶质瘤患者G-CIMP随时间的稳定性。使用八标记MethyLight面板对15个新诊断肿瘤样本进行G-CIMP阳性检测。8例肿瘤被归类为G-CIMP阳性(左上面板)7例肿瘤被归类为G-CIMP阴性（非G-CIMP，左下面板). 对于G-CIMP阳性病例，还评估了初次切除后2~9年的第二次手术的样本(右上面板)以及非G-CIMP案例(右下面板). 每个标记如果甲基化则编码为红色，如果未甲基化则为绿色。

为了进一步扩展这些观察结果，我们确定了印尼盾1一组独立的100个胶质瘤（WHO II、III和IV级）的突变状态。48人中IDH1型-突变型肿瘤35例（72.9%）为G-CIMP。然而，只有3/52例（5.8%）没有印尼盾1突变为G-CIMP阳性（比值比=42；95%置信区间（CI），11–244；图S3D)验证G-CIMP与印尼盾1突变。

基于G-CIMP状态与渐进特征的关联，而非从头开始GBM通路，我们假设G-CIMP状态在中低级别胶质瘤中更常见。我们通过使用八基因MethyLight面板评估60例II级和92例III级胶质瘤的G-CIMP DNA甲基化来扩展此分析。与GBM相比，II级肿瘤中G-CIMP阳性肿瘤约增加10倍，而III级肿瘤中，G-CIMP呈阳性的肿瘤比例适中(图5A,图S3E). 当按组织学类型区分低粒和中粒胶质瘤时，少突胶质瘤中G-CIMP阳性似乎是星形细胞瘤（43/95，45%）的两倍（52/56，93%）。G-CIMP阳性状态与WHO认可的每一级弥漫性胶质瘤患者生存率的提高相关，表明G-CIMP状态是胶质瘤患者存活率的预后（p<0.032，图5B). 调整患者年龄和肿瘤分级后，G-CIMP状态是生存率的独立预测因子（p<0.01）(图S3F). 总之，这些发现表明G-CIMP是低度胶质瘤中普遍存在的分子标志，并可提高这些肿瘤的生存率。

G-CIMP在递归时的稳定性

由于表观遗传事件可以是动态的过程，我们检查了G-CIMP状态在胶质瘤中是否是一个稳定的事件，或者它是否会在疾病过程中发生变化。为了验证这一点，我们从15名肿瘤复发后接受第二次手术的患者中获取了一组样本，首次手术和第二次术之间的时间间隔长达8年。我们使用八烯MethyLight面板来确定其G-CIMP状态，发现八个样本为G-CIMP阳性，而七个样本为阴性。有趣的是，在G-CIMP阳性病例中，8/8（100%）的复发样本保持了G-CIMP的阳性状态。同样，在7例G-CIMP阴性病例中，所有7例在复发时均保持G-CIMP阳性，表明G-CIMP表型随时间的推移而稳定(图5C).

讨论

在本报告中，我们确定并表征了人脑胶质瘤中一个独特的分子亚群。对TCGA样本的表观遗传变化的分析表明，存在一定比例的GBM肿瘤，其基因座子集的DNA甲基化高度一致，表明存在CpG岛甲基化表型（G-CIMP）。G-CIMP阳性样本与继发或复发（治疗）肿瘤相关，与印尼盾1突变。G-CIMP肿瘤也表现出相对缺乏GBM中常见的拷贝数变化，包括表皮生长因子受体扩增、7号染色体获得和10号染色体丢失。有趣的是，G-CIMP肿瘤显示出拷贝数的改变，这在患有印尼盾1最近一份报告中的突变(Sanson等人，2009年). DNA甲基化数据与基因表达数据的整合表明，G-CIMP阳性肿瘤代表神经前肿瘤的一个子集。G-CIMP阳性肿瘤在GBM整体和神经前亚群中均显示出良好的预后，这与之前的报道一致印尼盾1突变型肿瘤(Parsons等人，2008年;Yan等人，2009年). 有趣的是，在五个不一致的G-CIMP阳性病例中，印尼盾1-野生型肿瘤，两名患者在诊断后存活了五年以上，这表明G-CIMP阳性状态可能会带来良好的预后，而不依赖于印尼盾1突变状态。然而，需要更多不一致案例的研究来仔细剖析G-CIMP状态与印尼盾1生存突变。神经前肿瘤在很大程度上改善了预后(菲利普斯等人，2006年)可以由G-CIMP正子集进行说明。这些发现表明，G-CIMP可用于进一步将表达定义的组细化为具有临床意义的其他亚型。

G-CIMP与印尼盾1所有胶质瘤分级的突变，且两者的患病率均随肿瘤分级的增加而降低。肿瘤分级仅由形态学定义，因此在分子亚型方面可能是异质的。在IV级/胶质母细胞瘤中，肿瘤是倾向于年轻且预后相对良好的患者的子集。只有通过使用诸如印尼盾1以及G-CIMP状态，可以前瞻性地识别此类患者。相反，这些标记物也可用于鉴别低、中度胶质瘤患者，这些患者可能表现出与肿瘤分级相关的不良预后。

在本研究检查的非TCGA独立验证集中印尼盾140/43（93%）的中低级别胶质瘤中检测到突变，但只有7/57（13%）的原发性GBM。同样，我们在II级肿瘤中检测到的G-CIMP阳性胶质瘤是IV级GBM的近10倍。G-CIMP胶质瘤在所有肿瘤级别的生存率都有所提高，这表明G-CIMP神经胶质瘤的分子特征鼓励肿瘤表现型的侵袭性降低。与此相一致，我们在一组基因中发现了G-CIMP特异性DNA甲基化变化，这些基因的表达与患者预后显著相关。我们观察到，这一大部分差异沉默基因参与了特定的功能类别，包括间充质、肿瘤侵袭和细胞外基质的标志物。这一概念建立在我们先前发现的胶质瘤间充质亚群的基础上，该亚群显示预后不良(Phillips等人，2006年). 根据该模型，G-CIMP阴性肿瘤中这些基因的甲基化不足将导致这些基因的表达相对增加，从而促进肿瘤进展和/或缺乏对当前可用治疗方式的反应。G-CIMP基因列表与先前的基因表达分析（荟萃分析）的比较表明，由于关键间充质基因的沉默，G-CIMP阳性肿瘤的侵袭性可能较小。

我们发现少数启动子高度甲基化的基因伴随相关基因表达的显著降低（293/1520，19%）。这与之前的报告一致，在之前的报告中，我们发现类似的低频率反向相关的启动子高甲基化和基因表达(Houshdaran等人，2010年;Pike等人，2008年). 大多数基因的启动子超甲基化与基因表达之间缺乏反向关系可能归因于多种情况，包括一些非甲基化基因缺乏合适的转录因子，以及一些带有甲基化启动子的基因使用替代启动子。表观遗传学控制着表达潜能，而不是表达状态。

RBP1型和G0S2号机组是在G-CIMP肿瘤中显示表观遗传学沉默的最强证据的两个基因。RBP1型以前有报道称在癌细胞系和原发性肿瘤中表现出表观遗传沉默，其编码蛋白与维甲酸受体（RAR）的关联已被很好地描述(Esteller等人，2002年).G0S2号机组基因表达受维甲酸（RA）调节，并编码一种促进原代细胞凋亡的蛋白质，表明其具有抑癌作用(Kitareewan等人，2008年;Welch等人，2009年). 维生素A代谢产物RA对胚胎和成人生长都很重要。RA在RAR介导的神经元发育和分化中具有多种作用（综述于(Malik等人，2000年)). 有趣的是，对乳腺癌细胞的研究表明RBP1型通过降低所有-反式-PI3K/Akt信号通路去表达介导的维甲酸生成和RAR水平和活性的丧失，导致细胞分化和肿瘤进展的丧失((Farias等人，2005a),(Farias等人，2005年b)). 这种机制可能有助于描述G-CIMP肿瘤发生的分子特征。因此，解剖低度恶性胶质瘤中G-CIMP肿瘤的基因表达和DNA甲基化改变将有助于更好地理解突变的作用印尼盾1以及G-CIMP DNA甲基化对肿瘤分级和患者生存率的影响。

G-CIMP甲基化的高度协同性表明，这种现象可能是由反作用因子的缺陷引起的，该反作用因子通常参与保护CpG岛启动子的特定亚群免受DNA甲基化的侵害。该因子功能的丧失将导致广泛的协同DNA甲基化改变。我们认为一些CIMP基因的转录沉默可能为获得特定的遗传损伤提供了有利的环境。事实上，我们最近发现IGFBP7型被启动子高甲基化沉默BRAF公司-突变型CIMP+大肠肿瘤(Hinoue等人，2009年). 突变株致癌诱导衰老BRAF公司已知是由胰岛素样生长因子结合蛋白7(Wajapeyee等人，2008年). 因此，CIMP介导的IGFBP7型为获取BRAF公司突变。G-CIMP状态与印尼盾1GBM肿瘤中的突变很像大肠CIMP，其中DNA超甲基化与BRAF公司突变(Weisenberger等人，2006年). 我们假设未知G-CIMP靶点的转录沉默可能为获得印尼盾1突变。

在我们对G-CIMP肿瘤的综合分析中，我们观察到与细胞代谢过程相关的功能基因上调以及大分子的正调控。该表达谱可能反映了肿瘤增殖状态的代谢调节以及功能获得印尼盾1突变(Dang等人，2009年). 这种新陈代谢调整可能与Warburg的观察结果一致，即增殖的正常细胞和肿瘤细胞需要生物量和能量生产，并将葡萄糖主要转化为乳酸，而不考虑氧气水平，而非增殖分化细胞强调高效能产（参见(Vander Heiden等人，2009年)).

总之，我们的数据表明G-CIMP状态将胶质瘤分为两个不同的亚组，具有不同的分子和临床表型。这些分子分类对胶质瘤患者的不同治疗策略具有指导意义。对胶质瘤分子亚群的进一步观察和表征可能会为深入了解胶质瘤的发展和进展提供更多信息，并可能导致对这些肿瘤患者进行靶向药物治疗。

实验程序

样品和DNA甲基化分析

TCGA GBM肿瘤的基因组DNA由TCGA生物样本核心资源（BCR）分离，并按照之前的描述交付给USC(癌症基因组图谱研究网络，2008年). 一个样品（TCGA-06-0178）印尼盾1我们的分析中删除了突变，因为很明显，用于DNA甲基化分析的组织类型不正确。来自表面健康个体的四个大脑基因组DNA样本作为对照。所有组织样本（患者和健康个体）均采用机构审查委员会批准的方案从南加州大学（TCGA GBM样本）、约翰·霍普金斯医学院（正常大脑样本）和德克萨斯大学MD安德森癌症中心（胶质瘤验证样本）获取。对组织样本进行识别，以确保患者的机密性。基因组DNA甲基化在体外与M。新加坡证券交易所还包括I甲基化酶或全基因组扩增（WGA），分别作为DNA甲基化的阳性和阴性对照。详情请参阅补充信息.

GoldenGate分析是根据制造商的要求进行的，如前所述(Bibikova等人，2006年). GoldenGate甲基化分析调查了多达1536个CpG位点的DNA甲基化-在OMA-002探针组中，共对横跨807个独特基因位点的1505个CpGs进行了检测(Bibikova等人，2006年)，并且在OMA-003探针组中研究了跨越相同数量的独特基因区域的1498个CpG(癌症基因组图谱研究网络，2008年).

根据制造商的说明进行Infinium甲基化分析。该分析生成了27578个CpG二核苷酸的DNA甲基化数据，这些二核苷酸跨越14473个注释良好的唯一基因启动子和/或5′基因区域（从转录起始点的−1500到+1500）。有关化验信息，请访问网址：www.illumina.com探测信息可在TCGA数据门户网站上获得。本分析包括91份TCGA GBM样品（第1、2、3和10批）的数据。第1-3批（63个样品）在Inifium和GoldenGate上运行，而第4-8批（182个样品）仅在GoldenGate上分析，第10批（28个样品）只在Infinium上分析。所有数据都已打包并存放在TCGA数据门户网站上(http://tcga.cancer.gov/dataportal).图S1C图示了不同DNA甲基化平台之间重叠样本的维恩图。有关DNA甲基化检测协议和TCGA GBM数据存档版本的更多详细信息，请参阅补充信息.

集成TCGA数据平台

虽然辅助数据（表达、突变、拷贝数）可用于其他肿瘤样本，但我们只包括那些有DNA甲基化分析的样本（GoldenGate或Infinium）。由于安捷伦基因表达平台包含大量DNA甲基化数据可用的基因，因此我们将初步分析仅限于安捷伦的基因表达数据集。在适当的情况下，我们使用Affymetrix基因表达数据确认了结果。其他详细信息请参阅补充信息.

差异DNA甲基化和差异基因表达的聚类分析和测量

通过去除靶向X和Y染色体的探针、靶向CpG位点五个碱基对内含有单核苷酸多态性（SNP）的探针以及含有≥10个碱基的重复元素序列的探针来筛选每个平台的探针。接下来，我们在每个DNA甲基化平台的肿瘤组中保留了变化最大的甲基化探针（标准偏差>0.20）。这些最终数据矩阵用于无监督共识/层次聚类分析。采用非参数方法（Wilcoxon秩和检验）确定两组感兴趣的DNA甲基化差异或差异表达的探针/基因。有关更多信息，请参见补充信息.

使用MethyLight技术的G-CIMP验证

肿瘤样本由神经病学家（K.a.）审查，以确保诊断的准确性以及质量控制，从而将正常组织污染降至最低。MethyLight实时PCR策略如前所述执行(Eads等人，2000年;Eads等人，1999年). 其他详细信息请参阅补充信息.

路径和荟萃分析及统计分析

其他工具包括分子特征数据库（MSigDB数据库v2.5）、注释、可视化和集成发现数据库（DAVID）和NextBio™使用R软件（R版本2.9.2，2009-08-24，（R发展核心团队，2009年))和生物导体封装(Gentleman等人，2004年)，除非另有说明。其他详细信息请参阅补充信息.

重要性

胶质母细胞瘤（GBM）是一种高度侵袭性的脑肿瘤，患者的中位生存期仅为一年多。癌症基因组图谱（TCGA）项目旨在描述癌症基因组的特征，以确定改进癌症预防、检测和治疗的方法。利用TCGA数据，我们确定了具有特征性启动子DNA甲基化改变的GBM肿瘤子集，称为胶质瘤CpG岛甲基化表型（G-CIMP）。G-CIMP肿瘤具有独特的分子特征，包括高频率的IDH1突变和特征性的拷贝数改变。G-CIMP肿瘤患者的诊断年龄较小，生存期延长。G-CIMP肿瘤的分子改变定义了具有特定临床特征的人脑胶质瘤的一个独特亚群。

集锦

  • 胶质瘤中CpG岛甲基化表型（G-CIMP）的鉴定
  • G-CIMP与印尼盾1突变
  • G-CIMP患者在诊断时更年轻，生存率也有所提高
  • G-CIMP在中低级别胶质瘤中更为常见

补充材料

01

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02

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03

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04

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致谢

这项工作得到了NIH/NCI拨款U24 CA126561和U24 CA143882-01（P.W.L和S.B.B.）以及脑肿瘤基金合作组织、V基金会、罗斯基金会和SPORE拨款P50CA127001（K.A.）的支持。我们感谢丹尼斯·马格林特（Dennis Maglinte）和南加州大学表观基因组中心（USC Epigenome Center）成员的有益讨论，感谢安德烈亚娜·里维拉（Andreana Rivera）的技术援助，感谢玛丽索尔·格雷罗（Marisol Guerrero）的编辑协助。

脚注

利益冲突声明

P.W.L.是Epigenomics，AG的股东、顾问和科学顾问委员会成员，该公司对DNA甲基化标记具有商业利益。这项工作没有得到Epigenomics，AG.K.A.的支持。K.A.是Castle Biosciences的顾问和科学顾问委员会成员，该公司对分子诊断有商业利益。这项工作没有得到Castle Biosciences的支持。

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

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