自噬是一种分解代谢过程，其中受损或多余的细胞质成分在应激条件下降解；它在真核生物中进化保守，与发育和生理学密切相关(1,2). 自噬的形态学特征是形成双膜细胞溶质小泡，即自噬体，它隔离细胞质。然后自噬体与溶酶体融合，导致货物降解。自噬体形成的机制与分泌或内吞途径中用于囊泡形成的机制不同，据说是从头开始的，因为它不是通过预先存在的细胞器直接出芽而发生的。相反，有核结构，即吞噬体，似乎通过增加膜而膨胀，可能通过囊泡融合。这种机制的一个结果是，它可以隔离任何大小的货物，包括完整的细胞器或入侵微生物，而这种能力对自噬功能至关重要。当诱导自噬时，对膜的需求很大，该领域的一个主要问题是膜的来源；几乎每个细胞器都参与了这个作用(三). 早期分泌途径可能是自噬的膜来源之一(4,5).
Rab GTPases是膜交通的关键调节因子，介导包括囊泡栓系和膜融合在内的多种事件。这些分子开关在非活性构象（GDP-结合构象）和活性构象之间循环。酵母Rab Ypt1，对ER-Golgi和Golgi交通至关重要(6)被称为TRAPP的多聚鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）激活(7,8). 已确定TRAPP复合物的两种形式(9). 这两个复合物共享几个亚单位，包括四个（Bet3、Bet5、Trs23和Trs31），这四个亚单位对激活Ypt1至关重要。最近描述了这些亚单位如何促进核苷酸交换活性(10). 复合物的第一种和较小形式TRAPPI调节ER-Golgi流量(11). 第二个和更大的综合体TRAPPII负责调节高尔基交通(12,13). 这两种复合物都是将囊泡束缚到受体室所需的束缚因子。TRAPPI复合物识别ER衍生囊泡上的外壳（COPII）(11)而TRAPPII复合物识别高尔基衍生囊泡上的外壳（COPI）(12,13). TRAPPII特有的亚单位，与COPI涂层复合物结合(13). 我们建议TRAPPII特异性亚单位掩盖TRAPPI上的COPII结合位点，从而将该GEF转化为识别新类别囊泡的栓系因子(10,13).
TRAPP复合物包括三个非必需亚单位Trs33、Trs65和Trs85(9,14). 先前的研究表明，Trs85是细胞质到液泡靶向（Cvt）通路（一种特殊类型的自噬）和大自噬（细胞质的非特异性自噬(15,16). 这些早期的研究没有解决Cvt通路和自噬是否需要Trs85或TRAPP的自由库。在这里，我们证明Trs85是第三个TRAPP复合物TRAPPIII的一部分，TRAPPIII在自噬中起特殊作用。TRAPPIII是一个Ypt1全球环境基金，由Trs85亚单位针对PAS。与这一建议一致，我们还表明Ypt1对特异性和非特异性自噬都是必需的。
结果
Trs85是Ypt1全球环境基金第三个TRAPP复合体的组成部分。
酵母自噬需要Trs85的发现(15,16)提出可能存在一个单独的Trs85池，在自噬相关过程中发挥作用。为了解决这一可能性，我们在Superdex-200柱上分离细胞液，并对Trs85、Trs65和Trs33的柱馏分进行吸光度测定。Trs33和Trs65（TRAPPII特异亚单位）标记了TRAPPI和TRAPPII复合物在这些组分中的位置(,中部和底部). 有10个TRAPP亚单位（Trs130、Trs120、Trs85、Trs65、Trs33、Trs31、Trs23、Trs20、Bet5和Bet3）。其中三个亚基（Trs130、Trs120和Trs65）是TRAPPII所特有的(9,14). Trs33在分数8、9（TRAPPII）和12（TRAPPI）中达到峰值()，而Trs65-myc主要在组分8和9中发现（TRAPPII）。通过监测表位标记的Trs85（Trs85-myc），确定Trs85在这些组分中的位置，该表位标记版本被证明具有功能(图S1A类和B类). 在Superdex-200色谱柱上，Trs85-myc的含量高于Trs65-myc，且主要存在于8–10色谱柱馏分中(,顶部和中部).
Trs85不与Trs130、Trs120和Trs65共沉淀。(A类)Trs85存在于Superdex-200柱馏分8-10中。分离纯化的裂解产物（来自菌株SFNY1295和SFNY1302），并用抗myc抗体进行Western blot分析(顶部和中部)或抗Trs33抗体(底部). (B类)Trs130、Trs120和Trs65不会与裂解物中的Trs85共沉淀。用抗myc抗体对清除的裂解产物进行免疫沉淀，并对所示TRAPP亚单位进行免疫印迹。顶部用抗myc抗体印迹下部具有亚单位特异性抗体。星号表示Trs120的降解产物。
Trs85-myc的分馏表明可能存在一个Trs85池，该池在TRAPPI或TRAPPII中均不存在。为了解决这种可能性，我们从裂解物中免疫沉淀Trs85-myc，并将沉淀的TRAPP亚单位与Trs33-myc和Trs65-myc的沉淀进行比较。这些数据表明，Trs85与Trs33-myc和Trs20共沉淀，但不与Trs65-myc、Trs130或Trs120共沉淀（或者Trs120的分解产物，参见和参考。9) ().
为了鉴定与Trs85共沉淀的其他TRAPP亚单位，我们分离了从Trs85-myc菌株制备的放射性标记裂解物，并从Superdex-200柱馏分8沉淀Trs85；通过分离未标记的裂解物来鉴定沉淀物中的污染蛋白质。该分析表明，Trs85-myc与Trs33、Trs31、Trs23、Bet3、Trs20和Bet5共沉淀(，将车道1与车道2中的未标记控制进行比较）。通过从馏分8中沉淀Trs85-myc并对Trs33、Trs31、Trs23、Bet3、Trs20和Bet5进行印迹，确认了这些共沉淀带的一致性(). TRAPPII特异性亚单位Trs65、Trs130、Trs120和Trs120的分解产物（参见)未在馏分8的Trs85-myc沉淀物中检测到（比较车道2和车道1中的Trs120-myc沉淀物). 总之，这些发现表明Trs85不是TRAPPII复合物的组成部分。此外，当对含有Trs85-myc的裂解物进行分馏时，没有一个小TRAPP亚单位能从馏分12（TRAPPI）中沉淀出来(，将车道2中的TRAPPI复合体与车道1和车道3中的未标记控制进行比较），当Bet3-myc从分数12中沉淀时，未检测到Trs85(图S2). 总之，这些发现表明Trs85不是TRAPPI或TRAPPII复合物的组成部分，后者是ER-Golgi和Golgi交通所必需的(9,12). 与这一观察结果一致，我们观察到从内质网通过高尔基复合体运输液泡蛋白酶Prc1在trs85型Δ电池(图S3A类)或影响细胞生长(图S3B类). 虽然早期的研究表明Trs85是TRAPPI和TRAPPII复合物的一个亚单位(9)，我们在这里报告的数据表明情况并非如此。相反，Trs85似乎是第三种TRAPP复合物的特定成分，称为TRAPPIII，它是自噬和Cvt途径所必需的（参见图S4以总结不同TRAPP复合物中的亚基）。TRAPP络合物的早期表征是通过从Superdex-200柱馏分中沉淀Bet3-myc来完成的(9)；由于Bet3存在于所有三种TRAPP复合物中，我们推测在早期研究中TRAPPIII没有从TRAPPI和TRAPPII中分离出来。
识别激活Ypt1的第三个TRAPP复合物。(A类)Trs85-myc与Trs33、Trs31、Trs23、Bet3、Trs20和Bet5共沉淀。对放射性标记的裂解物（分别来自菌株SFNY1295和NY915）进行分级，并对级分8进行免疫沉淀，如材料和方法. (B类)确认与Trs85共沉淀的TRAPP亚单位。将由菌株SFNY1295制备的裂解物在Superdex-200柱上分馏。用抗myc抗体免疫沉淀组分8，并用所示TRAPP亚单位的抗体进行Western blot分析。(C类)Trs130、Trs120和Trs65不与来自馏分8的Trs85共沉淀。对放射性标记的裂解物（来自菌株SFNY1301和SFNY1295）进行分离，并对部分8进行免疫沉淀。Trs65上方出现的两个暗带是污染物（请参阅中未标记的控件A类车道2）。星号表示Trs120的降解产物。(天)Trs85不是TRAPPI复合物的成分。分离放射性标记的裂解物（来自菌株SFNY1295、SFNY656和NY915），并对部分12进行免疫沉淀。(电子)TRAPPIII是Ypt1全球环境基金。TRAPPII从含有TAP标记Trs65（SFNY1075）的菌株中纯化，TRAPPIII从表达TAP标记的Trs85（SFNY1080）的菌株通过用IgG-Sepharose微球培养裂解液纯化(8). 然后使用这些小球检测GTPγS对Ypt1的摄取。将显示的数据归一化为IgG-Sepharose微球上Trs33的含量。
TRAPPIII复合物包含Ypt1全球环境基金活动所需的所有亚单位(10). 为了确定Trs85是否是功能性Ypt1 GEF的组成部分，我们将TAP标记的Trs85固定在IgG-Sepharose微球上，并评估其刺激GTPγS在Ypt1上摄取的能力。作为对照，我们还检测了TRAPPII（TAP-tagged Trs65），其Ypt1 GEF活性与TRAPPI相当(10). TAP标记的Trs85和Trs65都刺激了Ypt1对GTPγS的摄取，达到大致相同的水平(). 这些发现表明，Trs85是Ypt1全球环境基金的一个组成部分，与TRAPPI和TRAPPII不同。
非特定自噬需要Ypt1。
观察到自噬需要Ypt1全球环境基金的一个组成部分(15,16)表明此事件可能还需要Ypt1。为了解决这种可能性，我们检测了这种GTPase在自噬中的作用。Ypt1是ER-Golgi贩运机制的重要组成部分，其丢失会导致细胞死亡(6,17). 为了避免这个问题，我们使用了条件密码1突变体。这个埃及1-1,密码1-3和密码1A136D型突变体是温度条件下的部分功能丧失等位基因YPT1型在非许可温度下阻止ER-Golgi通信(18). 为了开始我们的分析，我们使用了Pho8Δ60（缺乏N末端60氨基酸的空泡碱性磷酸酶）分析，这为测量自噬活性提供了一种定量方法(19). 在野生型酵母中，氮饥饿诱导自噬并将Pho8Δ60从胞质溶胶输送到液泡腔中，从而导致Pho8的激活。这个埃及1-1突变体在所有温度下都生长不良，在允许温度（30°C）和非允许温度（14°C）下，Pho8Δ60的激活都有缺陷(). 这个埃及镑1A136D型相对于同基因亲本菌株，突变体在允许温度（25°C）下的活性有所降低，在37°C下Pho8Δ60活性基本上完全阻断(图S5A类)，而密码1-3在容许温度（25°C）下基本正常，但在37°C下受阻()表明这两种情况下的自噬功能均受损。这些结果也表明该缺陷不是等位基因特异性的。
Ypt1参与酵母的非特异性自噬。(A类)同基因野生型（WT）和指示的密码1突变菌株在允许温度（30℃或25℃）的生长培养基（SMD）中培养至指数期，然后转移至非允许温度（14℃或37℃）；这个埃及1-1突变体对生长具有低温敏感性，并在14°C下进行了分析。同时，在每个温度下将细胞切换到氮气饥饿（SD-N）培养基中4小时。收集每个条件下的细胞裂解液，并对Pho8Δ60活性进行分析。误差条指示SE(B类)等基因野生型和密码1突变菌株用GFP-Atg8转化，生长到指数阶段，如A类然后转移到非允许温度下30分钟。添加雷帕霉素（0.2μM）4小时。显示GFP-Atg8和液泡限制膜的外荧光图像（用FM 4–64染色）。（比例尺，2.5μm）
作为分析自噬的第二种方法，我们检测了自噬蛋白Atg8（融合到GFP）向液泡的移位。在野生型细胞中，GFP-Atg8定位于PAS和胞浆。雷帕霉素治疗可诱导自噬并导致GFP-Atg8进入液泡。这个过程可以通过空泡腔内的GFP信号来证明。在允许或非允许温度下，所有野生型菌株都在PAS和/或空泡腔中显示GFP-Atg8定位(,图S5B类). 相比之下密码1-3和密码1A136D型在非许可温度下的突变体，以及埃及1-1在任何一种温度下，菌株都显示出GFP-Atg8转运的阻断，如雷帕霉素处理后突变细胞的液泡腔中缺乏GFP信号所示(和图S5B类).
自噬需要通过分泌途径的膜流(4,5)我们观察到的自噬缺陷可能是分泌受阻的间接结果。出于这个原因，我们还分析了密码1-2突变体，对生长不敏感，在体外但在体内阻断膜交通(17). 这个密码1-2突变体显示Pho8Δ60活性缺陷(图S5A类)以及在高温下向液泡输送GFP-Atg8(图S5B类). 虽然我们在空泡腔内偶尔观察到GFP荧光密码1-2突变体，表现出空泡GFP-Atg8定位的细胞百分比为17%密码1-2相比之下，37°C时野生型为90%。
以前的研究表明trs85型Δ突变体在自噬体形成中有缺陷(16)以及GFP-Atg8对PAS的本地化(15). 为了将Ypt1和Trs85置于自噬途径中，我们检测了GFP-Atg8在两种不同的细胞中的定位密码1等位基因。我们发现，在PAS中，GFP-Atg8点减少了约24%、47%和26%trs85型Δ,密码1-2、和密码1-3分别是突变体(图S6A类). 此外，与野生型相比，这些突变体显示每个细胞具有一个以上GFP-Atg8点的细胞数量显著增加(图S6B类)这表明Atg8在PAS的招募和本地化方面存在缺陷。结合先前的数据，这些结果表明Ypt1和Trs85在自噬体的生物发生中起作用。
特定自噬需要Ypt1。
为了扩展我们对Ypt1在自噬中的作用的分析，我们检测了一种选择性自噬类型，即Cvt途径，该途径将常驻水解酶氨肽酶I（prApe1）的前体形式传递到液泡，在液泡中被蛋白水解激活。正如预期，atg1处累积prApe1的Cvt途径缺陷的Δ突变细胞(). 相反，野生型细胞主要含有成熟型Ape1(). 这个密码1突变菌株在prApe1的加工过程中表现出不同的缺陷，包括部分缺陷(埃及1-1,密码1-2、和ypt1-3)以完成区块(密码1第136天). 一般来说，在允许温度和非允许温度下可以看到等效的缺陷，这表明Cvt途径对Ypt1的功能状态特别敏感。突变蛋白很可能即使在允许的温度下也不能保持完整的功能。这些结果表明Ypt1在特异性自噬中发挥作用。
这个密码1突变体对Cvt途径有缺陷。等基因野生型和密码1突变菌株用于和一个atg1处Δ对照菌株在富培养基（SMD）中以指示的允许温度培养至指数期，然后移至指示的非允许温度培养60分钟。蛋白质提取物通过SDS/PAGE进行解析，并用抗Ape1抗血清进行Western blot分析。prApe1和成熟Ape1的位置如图所示。
A成分活性密码1突变体抑制trs85型Δ缺陷。
如果Ypt1参与将膜流导向自噬途径，我们假设Ypt1的高表达可能显示自噬活性增强。因此，我们过度表达Ypt1，并使用Pho8Δ60检测自噬。富培养基中自噬活性无变化；然而，饥饿后，我们观察到Pho8Δ60活性增加了约30%()表明Ypt1是自噬过程的限制因素。
Ypt1过度表达增强了自噬，组成活性Ypt1绕过了对其GEF的要求。(A类)野生型（WT；TN124），atg1处Δ和Ypt1过表达（OE Ypt1）细胞在30℃下生长，并转移到SD-N培养基中培养4 h。蛋白质提取物通过Pho8Δ60分析进行分析。误差条表示SE。星号表示与WT级别的显著差异，P（P）< 0.05. (B类)重量，atg1处Δ和密码1Q67L型细胞的生长和分析与A类. (C类)重量，atg1处Δ，以及trs85型携带空载体或编码Ypt1或Ypt1的质粒的Δ细胞Q67L型在富培养基至指数生长阶段生长。蛋白质提取物通过SDS/PAGE进行解析，并用抗Ape1抗血清进行Western blot分析。
我们通过确定Ypt1的组成活性（即GTP-结合）形式是否影响自噬来扩展我们的分析。首先，我们表示密码1Q67L型突变体在镀锌1启动子并检测对非特异性自噬的影响。即使在基础条件下（营养丰富的培养基），当存在密码1Q67L型(). 饥饿诱导自噬时，活性也有类似的增加(). 其次，为了进一步研究含Trs85的TRAPPIII复合物作为Ypt1自噬特异性GEF的作用，我们表达了组成活性密码1Q67L型因以下原因而删除的菌株中的突变体TRS85型并监测对Cvt通路的影响。如前所述trs85型Δ突变体只积累了Ape1的前体形式，类似于atg1处Δ控制应变(，车道1和3）。野生型Ypt1在trs85型Δ突变体对prApe1处理没有影响(，车道4）。相反密码1Q67L型突变体导致prApe1完全成熟，表明它能有效地传递到液泡中(，车道5）。因此，组成性活性形式的Ypt1抑制了由Trs85丢失引起的Cvt通路中的缺陷。
Trs85将Ypt1引导至PAS。
Trs85是自噬所必需的观察结果(15,16)并且是Ypt1的自噬特异性GEF的一部分，这增加了TRAPPIII靶向PAS的可能性。为了解决这一点，我们检查了Trs85和Ypt1的定位。在酵母中，自噬体被认为是在PAS形成的。因此，如果Ypt1和Trs85在自噬中起直接作用，那么它们应该定位于PAS。因此，我们将Ypt1和Trs85的定位与Trs65和Trs130进行了比较。Trs65和Trs130仅存在于TRAPPII复合物中，而Trs65不需要用于Cvt途径或自噬(15,16). 所有蛋白质都用GFP标记，并用RFP-Ape1（PAS标记物）在细胞中表达。细胞生长到中期，然后饥饿45分钟，然后确定RFP-Ape1和GFP标记蛋白之间的共定位程度。Ypt1和Trs85与PAS共定位的比率远高于Trs65或Trs130（分别约为44%、34%、4%和10%）(和表S1). 缺少细胞atg1处Δ在自噬体形成中有缺陷，导致自噬蛋白在PAS处积聚(20). 因此，我们检测了Ypt1和TRAPP亚基在atg1处Δ应变。我们发现在缺乏Atg1的情况下，共定位增加，这在Trs85中最为明显(和表S1)；然而，即使在atg1处Δbackground、Trs65和Trs130与PAS标记没有显示出显著的共定位。为了验证Trs85的点状外观不是由于三重GFP标签的多重聚合，我们在多重敲除（MKO）菌株中表达了Trs85-3xGFP。MKO菌株缺乏24自动液位计已知自噬体形成所需的基因酿酒酵母(21). 当Trs85-3xGFP在MKO株中表达时，伴随弥散细胞溶质染色，偶尔出现点状突起(图S7). 观察到的少数Trs85-3xGFP点在富培养基或饥饿条件下均未与RFP-Ape1共定位，表明该嵌合体在缺乏Atg蛋白的情况下不会聚集，也不会与prApe1共同定位。这些发现表明，Trs85定位于PAS，而不是Trs65或Trs130，并且这种定位依赖于Atg蛋白。与Trs85和Trs65位于单独的TRAPP复合物中的概念一致，我们发现Trs85的细胞质池更大(和图S8A类).
Ypt1和Trs85本地化为PAS。(A类)野生型（WT，SEY6210），atg1处Δ（WHY1），第9天Δ（JKY007），以及trs85型表达RFP-Ape1和GFP-Ypt1的质粒转化Δ（YJH3）细胞；(B类)WT（YJH9），atg1处Δ（YCB151），以及第9天表达整合RFP-Ape1和Trs85-3xGFP的Δ（MDY15）细胞；(C类)WT（SFNY1573）和第9天Δ表达Trs65-3xGFP的菌株（MDY12）；或(天)的第9天表达Trs130-3xGFP（MDY10）的Δ菌株在SMD培养基中培养至指数期，然后转移至SD-N培养基中45分钟。然后通过荧光显微镜分析细胞。箭头标记重叠的GFP-Ypt1和RFP-Ape1点，以及重叠的Trs85-3xGFP和RFP-Ape1点。（比例尺，2.5μm）
我们还研究了这些亚单位在第9天Δ和第11天Δ应变。Atg9或Atg11的缺失导致与RFP-Ape1共定位的Trs85或Ypt1水平相对于atg1处Δ应变，但缺失对Trs65或Trs130的低水平共定位没有显著影响(表S1). Atg11是Atg9运动所必需的，Atg9是自噬相关通路的假定膜载体(22,23)至PAS。Trs85和Ypt1在第9天Δ和第11天Δ相对于atg1处Δ菌株与Ypt1及其GEF系留Atg9膜的假设一致，Atg9是自噬隔离囊泡生物生成所需的膜。与此建议一致，我们发现Atg9的外周池与Ypt1共定位（85%±6的细胞至少有一个重叠的点状突起，n个=211个单元；图S8B类). 最后，我们在没有Trs85的情况下监测了Ypt1的定位。GFP-Ypt1与RFP-Ape1共定位从野生型菌株中的约44%下降到野生型菌株的12%trs85型Δ背景(和表S1). 总之，这些发现表明Trs85在将Ypt1导向PAS中发挥作用。
讨论
这里我们描述了TRAPP复合体的第三种形式，TRAPPIII，它包含Trs85，是Ypt1的GEF。此外，我们发现TRAPPIII和Ypt1是Cvt途径和非选择性自噬所必需的。自噬相关过程中的缺陷密码1我们分析的突变体不是阻断内质网到高尔基体交通的间接结果，因为这些表型是在分泌交通正常的条件下观察到的。同样，Trs85的丢失对分泌途径没有影响，但会破坏特异性和非特异性自噬。我们还发现Trs85和Ypt1，而不是TRAPPII特异性亚基Trs65和Trs130，定位于PAS。尽管之前的研究表明Trs85参与了这些过程(15,16)到目前为止，Trs85、TRAPP和自噬之间的关系尚不清楚。我们在此报告的研究结果表明，TRAPPIII和Ypt1在Cvt通路和自噬中发挥直接作用。此外，它们暗示Trs85将Ypt1 GEF，TRAPPIII导向吞噬细胞以促进自噬。
我们的实验表明，Ypt1对特异性和非特异性自噬都至关重要(–). 根据我们在此报告的结果和之前的发现，我们认为TRAPPIII和Ypt1是Cvt囊泡和自噬体形成所需的膜栓系事件所必需的。最近有报道称，Cvt通路和自噬也需要Ypt1效应器COG(24). COG复合体包含两个叶，A和B(25). 自噬体的形成需要A叶，而不是B叶(24). 与Cvt囊泡形成需要TRAPPIII和Ypt1的提议一致，prApe1对外源性添加的蛋白酶敏感trs85型Δ电池(15,16)Atg8在trs85型Δ和密码1突变体(15,16) (图S6). Atg9定位方面的缺陷之前在trs85型Δ电池(15). 总之，这些结果表明，在Atg9被招募到PAS之后，但在Atg8招募之前或阶段，需要TRAPPIII和Ypt1。
我们的研究结果表明，酵母细胞含有三种Ypt1的GEF：TRAPPI、TRAPPII和TRAPPIII。TRAPP复合物在ER-Golgi流量（TRAPPI）中起作用(9,11)、高尔基交通（TRAPPII）(9,12)和自噬（TRAPPIII）。所有三个复合物都共享几个亚基（Bet3、Trs23、Bet5和Trs31），这些亚基对Ypt1 GEF活动以及Trs20和Trs33至关重要。Trs65（在高等真核生物中不存在）、Trs120和Trs130对TRAPPII是特异性的，而Trs85只存在于TRAPPIII中(图S4). 我们先前假设TRAPPII特异性亚单位Trs120和Trs130将Ypt1/Rab1 GEF活性靶向COPI包衣囊泡(10,13). 这里我们显示TRAPP亚单位Trs85将Ypt1 GEF活动靶向PAS。因此，某些TRAPP亚单位充当适配器，将核心GEF成分带到细胞的不同部分(10,13). PAS中与Trs85相互作用的细胞成分是当前研究的重点。
材料和方法
应变和介质。
本研究中使用的酵母菌株列于表S2如前所述，菌株在培养基（SMD、YPD、YPL和YTO）中生长(20,26). 为了诱导自噬，细胞被转移到SD-N或用雷帕霉素处理(20).
免疫印迹和定量分析。
如前所述分析用于蛋白质印迹分析的蛋白质样品(20).
荧光显微镜。
细胞在SMD选择性培养基中培养至中期。对于饥饿实验，将细胞转移到SD-N中45分钟。使用Olympus IX71荧光显微镜（Olympus）在DeltaVision系统上观察荧光信号。这些图像由Photometrics CoolSNAP总部摄像头（Roper Scientific，Inc.）拍摄，并使用softWoRx软件（Applied Precision）进行解卷。
核苷酸交换分析。
从菌株SFNY1080和SFNY1075中纯化TRAPP，并如前所述测量GTPγS的摄取(8).
凝胶过滤分析和免疫沉淀。
如前所述，对酵母细胞进行放射性标记(9). 一等分（200×106在Superdex 200凝胶过滤柱上应用放射性标记的裂解液或10 mg清除的裂解液，并收集1 mL的馏分。分数(8,12)用抗myc抗体进行免疫沉淀，并用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。
其他分析。
如前所述进行Pho8Δ60分析(16).
