美国生理学杂志胃肠病学肝病生理学。2010年5月；298（5）：G625–G633。
锌缺乏在酒精诱导肠屏障功能障碍中的作用
,1中，2 ,2,三，4,5 ,2,4,5 ,三，4和
2,4 魏忠
1中国农业大学兽医学院，北京；
以下部门2医学和
克雷格·麦克莱恩
以下部门2医学和
三药理学和毒理学
4路易斯维尔大学医学院酒精研究中心，
5路易斯维尔VAMC，肯塔基州路易斯维尔
凯弗
以下部门2医学和
4路易斯维尔大学医学院酒精研究中心，
5路易斯维尔VAMC，肯塔基州路易斯维尔
Y.詹姆斯·康
三药理学和毒理学以及
4路易斯维尔大学医学院酒精研究中心，
周占祥
以下部门2医学和
4路易斯维尔大学医学院酒精研究中心，
1中国农业大学兽医学院，北京；
以下部门2医学和
三药理学和毒理学
4路易斯维尔大学医学院酒精研究中心，
5路易斯维尔VAMC，肯塔基州路易斯维尔
通讯作者。 转载请求和其他通信地址：Z.Zhou，路易斯维尔大学医学院医学部，505 South Hancock St.，CTR Bldg.508，Louisville，KY 40292（电子邮件：ude.ellivsiuol@10uohz0z) 2009年8月24日收到；2010年2月12日接受。
摘要
肠屏障的破坏是酒精性内毒素血症和肝炎发生的原因之一。本研究旨在确定缺锌是否与酒精对肠道屏障的有害影响有关。对小鼠进行为期4周的酒精或等热量液体饮食配对喂养，检测到肝炎与血内毒素水平升高有关。酒精暴露显著增加回肠的通透性，但不影响十二指肠或空肠的屏障功能。酒精喂养的小鼠回肠上皮紧密连接蛋白减少，尽管酒精暴露不会引起明显的组织病理学变化。酒精暴露显著降低回肠锌浓度，与活性氧的积累有关。Caco-2细胞培养表明，由于氧化应激，酒精暴露增加了细胞内游离锌。缺锌导致Caco-2单层细胞中紧密连接蛋白的分解导致上皮屏障破坏。此外，轻度缺锌会夸大酒精对上皮屏障的有害影响。总之，小肠远端的上皮屏障功能障碍在酒精诱导的肠道渗漏中起着重要作用，氧化应激导致的锌缺乏可能通过直接作用于紧密连接蛋白或通过对酒精作用的敏感性而干扰肠道屏障功能。
关键词：紧密连接、肠道通透性、内毒素血症
内毒素血症起着重要作用通过刺激促炎细胞因子的产生促进酒精性肝病的发展(11). 肠屏障的破坏被认为是酒精诱导内毒素血症的主要原因(40). 酒精中毒患者对多种渗透性标记物（如聚乙二醇、甘露醇/乳果糖或51乙二胺四乙酸铬(10,22,23,38). 在动物研究中，肠道对辣根过氧化物酶（HRP）等大分子的通透性也随着酒精诱导的血浆内毒素血症和肝脏损伤而增加(13,17,24,25,32). 我们以前的研究表明，口服脂多糖可以在酒精中毒小鼠的血浆中检测到，但在对照小鼠中检测不到(30)提供了酒精增加肠道对内毒素渗透性的直接证据。动物研究还表明，防止肠道泄漏可抑制酒精暴露诱导的内毒素血症和肝损伤，表明肠道泄漏是酒精内毒素血症和肝脏损伤发生的原因之一(17,24,30).
众所周知，锌在维持胃肠道的生理功能方面发挥着重要作用(42). 酒精性肝病中有锌缺乏的记录(32). 锌缺乏可由饮食中锌摄入量不足和应激条件下锌的动员引起。最近的研究表明，锌稳态的破坏是应激介导的细胞功能障碍和损伤的关键介质(26,27). 活性氧（ROS）、乙醛和脂质过氧化产物已被证明能从蛋白质中释放锌，导致细胞内锌的失衡。所有这些有毒分子都在酒精暴露后的肠道中被检测到(2,15,21)提示肠道锌代谢失衡的可能性。我们以前的研究表明，补充锌可以防止酒精诱导的肝损伤，锌对维持肠屏障功能至关重要(20). 然而，锌如何调节肠屏障功能的机制尚未确定。本研究旨在确定1)锌缺乏是否与酒精诱导的肠屏障功能障碍有关，2)酒精如何导致缺锌，以及三)锌缺乏如何影响肠屏障功能。
材料和方法
饮酒。
雄性C57BL/J小鼠取自Harlan（印第安纳波利斯）。所有小鼠均按照机构动物护理和使用委员会批准的实验程序进行治疗。对于慢性酒精暴露，4个月大的小鼠采用分步喂食的方式，配对喂食Lieber-DeCarli酒精或异热量麦芽糖糊精控制液体饮食4周。研究开始时，饮食中的乙醇含量（%，wt/vol）为4.8（占总热量的34%），并逐渐增加至5.4（占总热量的38%）。每日测量食物摄入量，平均每日酒精摄入量为18 g/kg体重。喂食实验结束时，小鼠禁食4 h，并用阿维汀（300 mg/kg）麻醉，采集血浆、肝脏和肠道样本进行分析。
Caco-2单层细胞培养。
来自美国型培养物收集中心（马里兰州Rockville）的Caco-2细胞在37°C、5%CO中于补充100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.1 mM非必需氨基酸、10 mM HEPES和10%FBS的DMEM中培养2环境。培养基每2天更换一次。用0.25%胰蛋白酶-EDTA部分消化后传代Caco-2细胞，并使用第19-30代。使用培养箱载玻片上生长的Caco-2细胞（LabTek、Naperville、IL）测定紧密连接蛋白，而使用六孔板上生长的Caco-2细胞进行免疫印迹分析。为了测量上皮屏障功能，将Caco-2细胞培养在24孔插入物上（孔径0.4μm；BD Biosciences，San Jose，CA）。如前所述，对于酒精中毒，向培养基中添加1、2.5、5、7.5和10%（vol/vol）的临床相关和非细胞毒性剂量的乙醇(31).N个-在酒精治疗前30分钟以2 mM添加乙酰半胱氨酸（NAC）以抑制氧化应激。为了诱发缺锌，N个,N个,N′,N′-将四（2-吡啶甲基）乙二胺（TPEN）以最终浓度2、3或4μM添加到培养基中，培养时间为24 h。在100μM元素锌中添加硫酸锌和TPEN，以确认TPEN的锌螯合作用的特异性。另外，还通过添加其他二价阳离子（包括100μM铜作为氯化铜或100μM铁作为氯化亚铁）来测试TPEN的特异性。为了确定缺锌与酒精中毒的相互作用，首先用TPEN处理Caco-2细胞24小时，然后用5%乙醇孵育5小时。
肝损伤评估。
用苏木精和伊红染色的光镜检查肝脏的组织病理学变化。使用Infinity ALT试剂（马萨诸塞州沃尔瑟姆Thermo Scientific）比色法测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性。
血液内毒素检测。
从对照组和治疗组小鼠的背腔静脉提取血样。通过在300℃下离心血液来获得血浆克在4°C下保持15分钟。血浆样品用无菌纳米纯水按1:10稀释，通过漩涡混合，并放置在75°C水浴中10分钟。样品冷却至室温10分钟，然后使用鲎试剂盒（马里兰州Lonza Walkersville）进行比色分析。将标准品和样品与LAL在37°C下孵育10分钟，然后与比色底物孵育6分钟。用25%乙酸停止反应，读取405nm处的吸光度。
肠道通透性测定。
为了体外检测肠道通透性，新鲜分离十二指肠、空肠和回肠，并将其置于改良的Krebs-Henseleit碳酸氢盐缓冲液中，该缓冲液含有8.4 mM HEPES、119 mM NaCl、4.7 mM KCl、1.2 mM MgSO4，1.2 mM千赫2人事军官4，25 mM NaHCO三，2.5 mM氯化钙2和11 mM葡萄糖（KHBB，pH 7.4）。首先用缝合线将肠段的一端结扎，然后用灌胃针将100μl FITC-右旋糖酐（分子量4000，FD-4，40 mg/ml）注入内腔，以避免粘膜损伤。然后将肠段的另一端结扎成8厘米的肠囊。在KHBB缓冲液中冲洗后，将肠囊置于2ml KHBB中，并在37°C下孵育20分钟。从内腔进入孵育缓冲液的FD-4以485 nm的激发波长和530 nm的发射波长进行荧光分光光度测定。FD-4渗透性以微克/厘米/分钟表示。
紧密连接蛋白的免疫荧光显微镜。
回肠和Caco-2细胞室玻片的冷冻切片在−20°C下用冷甲醇固定5分钟。然后将肠组织或Caco-2细胞与多克隆兔抗凝血素-1、闭塞素或闭塞小带（ZO）-1抗体（Zymed Laboratories，San Francisco，CA）在4°C下孵育过夜，然后在室温下与用于组织切片的Cy3-结合抗体或用于Caco-2细胞的FITC-结合抗体孵育30分钟。
活性氧荧光显微镜。
用二氢乙硫酸氢钠荧光显微镜检查小肠和Caco-2细胞中ROS的积累。无荧光的二氢乙硫醇被活性氧氧化，生成红色荧光产物乙硫醇，与核酸结合，使细胞核呈现明亮的荧光红色。小肠段的冷冻切片，包括十二指肠、空肠、，将回肠或Caco-2细胞室载玻片与5μM二氢乙硫磷（Molecular Probes，Eugene，or）在37°C的黑暗中孵育30分钟。在荧光显微镜下检查ROS-催化的乙硫磷红色荧光。使用SigmaScan Pro 5软件量化相对荧光强度。
肠道锌浓度。
采用原子吸收分光光度法测定十二指肠、空肠和回肠等小肠段的锌浓度。如上所述，对相对荧光强度进行量化。
锌荧光显微镜。
锌是一种蓝色荧光锌离子指示剂。将培养在培养箱载玻片上的Caco-2细胞与25μM锌基乙酯在PBS中在室温下培养30分钟。用荧光显微镜检测标记的锌离子，并用SigmaScan Pro 5软件定量相对荧光强度。
Caco-2单层屏障功能分析。
通过测量电阻和细胞旁通透性来评估Caco-2单层屏障功能。使用上皮伏特电阻计（佛罗里达州萨拉索塔市世界精密仪器公司）测量过滤生长Caco-2单层膜的跨上皮电阻（TEER）。仅减去过滤器的电阻值后，通过三次连续测量记录电阻。为了测定细胞旁通透性，在DMEM中以10 mg/ml的最终浓度将FD-4添加到Caco-2细胞的顶部隔室。培养90分钟后，收集基底外侧介质，并使用激发波长为485 nm、发射波长为530 nm的微孔板荧光阅读器测量穿透基底外侧介质的FD-4。
紧密连接蛋白的免疫印迹分析。
从海卫一可溶和不可溶部分制备了紧密连接蛋白。简单地说，在Triton-soluble缓冲液（50 mM Tris·HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，2 mM EDTA，4 mM Na）中，将回肠粘膜或细胞单层在冰上溶解30分钟三VO（旁白）4，40 mM NaF，1%Triton X-100，1 mM PMSF，1%蛋白酶抑制剂鸡尾酒），并在14000下离心克持续10分钟。上清液被视为Triton可溶性级分，并将颗粒重悬在Triton不溶性缓冲液（含1%SDS的Triton可溶性缓冲液）中并进行超声处理。14000离心后克5分钟后，收集上清液作为Triton不溶性组分。将含有30μg蛋白质的等分样品装入8-15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中。电泳后，将蛋白质转移到聚偏氟乙烯膜上。用兔抗克劳丁-1（clouding）、ZO-1（Zymed Laboratories）或GAPDH（Santa Cruz Biotechnologies，Santa Cru z，CA）的多克隆抗体探测膜。然后用HRP结合的驴抗兔IgG（GE Healthcare，Piscataway，NJ）处理膜。蛋白质带通过增强化学发光检测系统（GE Healthcare）进行可视化，并通过密度分析进行量化。
统计。
所有数据均以平均值±标准差表示。数据通过方差分析和纽曼-凯尔斯多重比较检验进行分析。各组之间的差异在P（P）< 0.05.
结果
酒精暴露诱导的肝损伤。
酒精喂养小鼠在4周酒精暴露结束时的体重（27.1±1.0 g）显著低于配对喂养小鼠（29.0±0.6 g）。酒精喂养小鼠的肝脏/体重比（4.7±0.2）显著高于配对喂养小鼠的肝脏/体重比（4.0±0.3）。酒精暴露显著升高血浆ALT活性(). 此外，酒精暴露会导致肝脏病理变化，包括脂肪变性、坏死和中性粒细胞浸润().
慢性饮酒（AF）4周的小鼠肝损伤。A类：血浆丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性。结果为平均值±SD(n个= 6–8). *显著不同(P（P）< 0.05,t吨-试验）。B类：肝脏组织病理学。光学显微镜显示，酒精喂养小鼠的肝脏中存在脂质积聚（箭头）和炎症（箭头）。苏木精和伊红染色。CV，中央静脉。比例尺=50μM。
酒精暴露导致肠屏障功能破坏。
作为肠屏障破坏的指标，测定了血浆内毒素浓度，酒精暴露显著增加了血浆内毒素水平(). 通过体外测量肠道对FD-4的通透性来确定酒精对肠屏障功能的影响。如所示酒精暴露不影响十二指肠和空肠的FD-4通透性，但显著增加回肠通透性。然后通过免疫荧光显微镜测定紧密连接蛋白、跨膜蛋白闭塞素和细胞内斑块蛋白ZO-1在回肠上皮的分布。酒精暴露导致邻近上皮细胞紧密连接处的闭塞素和ZO-1分布减少(). 免疫印迹分析进一步证实，酒精暴露降低了occludin和ZO-1的蛋白质水平(). 然而，苏木精和伊红染色的光学显微镜并未显示酒精暴露后肠道的显著病理变化（数据未显示）。
长期饮酒4周的小鼠肠道屏障功能障碍。A类：血浆内毒素。内毒素水平用鲎无血细胞裂解物法测定。B类：肠道通透性。十二指肠、空肠和回肠的肠囊孵育20分钟后，测定腔内FITC-右旋糖酐（FD-4）对孵育缓冲液的渗透。C类：回肠紧密连接蛋白的免疫荧光显微镜。箭头表示闭塞蛋白或闭塞小带（ZO）-1消失。比例尺=30μM。D类：回肠闭塞素和ZO-1的免疫印迹。通过密度测定分析对条带进行量化，并通过将对照值设置为1来计算与GAPDH的比值。结果为平均值±SD(n个=6–8英寸A类和B类,n个=3英寸D类). *显著不同(P（P）< 0.05,t吨-测试）。
酒精引起的肠道氧化应激和锌缺乏。
通过乙炔荧光显微镜测量ROS积累来评估小肠中的氧化应激()和图像量化(). 在配对喂养的小鼠中，仅在十二指肠、空肠和回肠中检测到微量的ROS，而慢性酒精暴露导致ROS在小肠中积聚，如红色荧光强度增加所示。从尾部到远端，ROS水平沿小肠逐渐升高，回肠标记最强。为了确定肠道内锌稳态失调是否与氧化应激有关，采用原子吸收分光光度法分析肠道锌浓度。酒精暴露不会影响十二指肠和空肠中锌的状态，但会显著降低回肠中的锌浓度().
长期饮酒4周的小鼠肠道活性氧（ROS）积累和锌浓度。A类：活性氧荧光显微镜。将冷冻器肠切片与二氢乙硫酸氢钠（DHE）在5μM下孵育，ROS氧化后细胞核内形成红色荧光。比例尺=40μM。B类：乙炔荧光强度的定量分析。C类：肠道锌浓度。用原子吸收光谱法测定总锌。结果为平均值±SD(n个= 6–8). *显著不同(P（P）< 0.05,t吨-试验）。
Caco-2细胞中锌动员与酒精诱导的氧化应激的关系。
进行Caco-2细胞培养，以确定酒精诱导的上皮屏障破坏中锌稳态失调和氧化应激之间的联系。通过测定TEER和FD-4来评估酒精治疗对上皮屏障功能的影响。如所示酒精处理5h后，上皮TEER显著下降，呈剂量依赖性。与这些结果一致，酒精以剂量依赖的方式显著增加了FD-4的细胞旁渗透性。二氢乙硫酸氢钠荧光显微镜检测到活性氧的积累，酒精处理产生活性氧，如细胞核中红色荧光增强所示(). 为了确定酒精是否诱导锌动员，用锌试剂检测细胞内游离锌，锌试剂结合游离锌生成蓝色荧光。如所示酒精处理显著增加了细胞质锌标记强度。为了确定锌动员与活性氧积累的联系，通过NAC预处理实现活性氧的抑制。NAC对ROS的抑制伴随着锌释放的减少。据此，NAC预处理可减轻酒精诱导的上皮屏障功能障碍().
酒精诱导Caco-2细胞上皮屏障破坏中锌动员与ROS生成的关联。A类：上皮屏障功能。用浓度为1、2.5、5、7.5或10%（vol/vol）的乙醇处理插入物上的Caco-2细胞5小时，并通过测量跨上皮电阻（TEER）和FD-4通透性评估上皮屏障功能的改变。B类：活性氧和游离锌的荧光显微镜。Caco-2细胞在培养箱载玻片上培养，并在有或无2 mM的条件下用5%乙醇（vol/vol）处理5 hN个-乙酰半胱氨酸（NAC）。分别与二氢乙锭（5μM）或锌喹（25μM）孵育后，通过荧光显微镜检测ROS和游离锌。比例尺=25μM。C类：NAC对酒精诱导的上皮屏障破坏的影响。用5%乙醇处理Caco-2细胞，并进行或不进行2 mM NAC预处理。结果为平均值±SD(n个= 8). 重大差异(P（P）<0.05，方差分析）用不同的字母表示，如Ctrl，control；E或EtOH、乙醇。
缺锌对Caco-2上皮屏障功能的影响。
为了确定锌在上皮屏障功能中的作用，通过TPEN诱导锌剥夺。通过紧密连接蛋白的免疫荧光标记，确定缺锌对上皮屏障完整性的影响。如所示TPEN在3和4μM时导致紧密连接蛋白的显著减少，包括claudin-1、clodin和ZO-1。2μM TPEN似乎没有影响紧密连接蛋白的分布(). 免疫印迹分析表明，3和4μM的TPEN显著降低了可溶性或不溶性组分中所有三种紧密连接蛋白的蛋白质水平，而2μM的TPEN仅降低了不溶性部分克劳丁-1和可溶性部分闭塞蛋白的蛋白水平(). 屏障功能分析表明，TPEN治疗以剂量依赖性方式导致上皮TEER降低和FD-4通透性增加(). NAC预处理不影响TPEN诱导的上皮屏障功能障碍(). 添加锌减弱的TPEN影响的上皮屏障功能与紧密连接蛋白的保存()而TPEN对上皮屏障的影响并没有通过添加铜或铁而逆转（数据未显示）。
缺锌对Caco-2细胞上皮屏障的影响。Caco-2细胞在插入物上培养，并用2、3和4μM或4μM的N，N，N′，N′-四（2-吡啶甲基）乙二胺（TPEN）加100μM锌处理24小时。A类：用免疫荧光显微镜检测紧密连接蛋白的分布。比例尺=25μM。B类：通过免疫印迹分析测定紧密连接蛋白的蛋白水平。免疫印迹条带通过密度分析进行量化，并通过将对照组的值设置为1来计算与GAPDH的比值。C类：通过测量TEER和FD-4通透性评估上皮屏障功能。D类：NAC对TPEN诱导的上皮屏障破坏的影响。用3μM TPEN处理Caco-2细胞，并进行或不进行2 mM NAC预处理。结果为平均值±SD(n个=4英寸B类,n个=8英寸C类和D类). 重大差异(P（P）<0.05，方差分析）用不同的字母表示，如T、TPEN。
缺锌对酒精诱导的上皮屏障功能障碍的致敏作用。将Caco-2细胞培养在插入物上，用2μM的TPEN处理24 h，然后用5%（vol/vol）乙醇处理5 h。A类：免疫荧光显微镜检测紧密连接蛋白的分布。比例尺=25μM。B类：通过免疫印迹分析测定紧密连接蛋白的蛋白水平。免疫印迹条带通过密度分析进行量化，并通过将对照组的值设置为1来计算与GAPDH的比值。C类：通过测量TEER和FD-4通透性评估上皮屏障功能。D类：NAC对TPEN或/和乙醇诱导的上皮屏障破坏的影响。用5%乙醇（vol/vol）或/和2μM TPEN处理Caco-2细胞，有或没有2 mM NAC预处理。结果为平均值±SD(n个=4英寸B类,n个=8英寸C类和D类). 重大差异(P（P）<0.05，方差分析）由不同字母a-c标识。
缺锌与酒精在诱导Caco-2上皮屏障破坏中的相互作用。
为了确定缺锌是否会与酒精相互作用导致上皮屏障破坏，Caco-2细胞首先在轻度缺锌的情况下培养，然后用酒精处理。如所示酒精处理降低了紧密连接处claudin-1、clodin和ZO-1的分布，而2μM的TPEN对紧密连接蛋白没有影响。缺锌后用酒精处理的Caco-2细胞显示紧密连接蛋白显著减少。免疫印迹分析表明，与单纯酒精相比，缺锌后酒精处理显著降低了可溶性和不溶性部分所有三种紧密连接蛋白的蛋白质水平(). TEER和FD-4通透性测量表明，2μM TPEN对Caco-2上皮屏障功能没有显著影响(). 酒精治疗导致TEER显著降低，FD-4通透性显著增加，表明上皮屏障功能受损。然而，与单用酒精处理的Caco-2细胞相比，缺锌后酒精处理的细胞显示出明显更低的TEER和更高的FD-4通透性。NAC预处理减轻TPEN和酒精诱导的上皮屏障功能障碍().
讨论
肠上皮的屏障功能由上皮细胞和细胞旁顶端连接复合体提供，包括紧密连接和粘附连接(14,35). 紧密连接是顶端连接复合体中最顶端的细胞器，主要参与细胞旁通透性的调节。上皮细胞的丢失或紧密连接的破坏都会导致肠道通透性增加。临床研究表明，急性饮酒可导致小肠近端出现明显的组织病理学变化，而慢性饮酒只会引起轻微的组织病理变化(9,12,34). 我们之前的研究(30)此外，肠道组织病理学改变，如肠绒毛顶部上皮细胞的丢失，与小鼠急性酒精中毒引起的肠屏障破坏有关(30). 本研究表明，长期饮酒会导致肠道渗漏，但不会明显影响肠道组织学。最重要的是，我们发现慢性酒精暴露后的肠道泄漏发生在回肠，而不是十二指肠或空肠。这些数据首次证明小肠下部在酒精性内毒素血症的发生中起着重要作用。
紧密连接由几个跨膜蛋白（如闭塞素和克劳丁）和细胞内分子（如ZO-1）组成(18). 细胞表面分子的相互作用可确保细胞间粘附并调节细胞旁通透性。紧密连接处蛋白质的分解将导致肠屏障的破坏，从而使内毒素和病原体等大分子从肠腔扩散到血液中。这似乎是一些胃肠道疾病（如炎症性肠病和乳糜泻）发病机制中的常见机制(28,38,36). 最近的一项研究表明，酒精中毒患者结肠活检中的ZO-1蛋白水平显著低于正常人(46). 本研究发现，在长期饮酒的小鼠回肠粘膜上皮紧密连接处，跨膜蛋白、闭塞素和细胞内斑块蛋白ZO-1的分布减少。因此，紧密连接蛋白的分解可能是慢性酒精暴露诱导肠屏障功能障碍发病机制中的一个原因。
氧化应激和酒精反应代谢物被认为是酒精诱导的肠屏障功能障碍的关键介导因素。先前的研究表明，酒精暴露会导致肠道氧化应激，预防氧化应激会抑制肠道渗漏(2,17,21,24,25). 乙醛是主要的酒精反应性代谢产物，在酒精暴露后的肠道中也被检测到(8,15). Caco-2肠细胞培养研究表明，酒精处理可从紧密连接处诱导ZO-1的渐进性破坏，并导致相邻细胞之间形成间隙(31). 酒精处理后检测Caco-2细胞中ROS和一氧化氮的生成，发现微管蛋白的氧化和硝化与上皮屏障破坏有关(三). 使用抗氧化剂进行治疗，例如我-半胱氨酸、超氧化物歧化酶和瑞巴派特、iNOS抑制剂和生长因子（如附睾生长因子或TGF-β）抑制酒精诱导的ROS积累、微管蛋白硝化和上皮屏障破坏(4–7). 这些研究结果表明，活性氧可严重介导酒精诱导的上皮屏障破坏。本研究表明，长期饮酒会导致ROS在回肠中显著积聚，但在十二指肠和空肠中没有，这与肠道通透性的测量结果密切相关。有趣的是，长期饮酒也降低了回肠中的锌含量，但十二指肠和空肠中的含量没有降低。为了确定酒精诱导的氧化应激与锌释放之间的联系，引入了Caco-2细胞培养模型。然而，要显著降低TEER（>60%），需要较高的乙醇浓度（5-10%，vol/vol）。酒精代谢酶的Western blotting分析表明，Caco-2细胞表达丰富的醛脱氢酶，但只有最低的乙醇脱氢酶（数据未显示），表明酒精代谢能力较低。Caco-2细胞培养表明，NAC对ROS的衰减导致Caco-2电池中乙醇诱导的锌动员和上皮屏障功能障碍的减弱。然而，NAC并不影响TPEN诱导的上皮屏障功能障碍。这些数据表明，氧化应激条件下的缺锌严重介导了酒精诱导的肠上皮屏障功能障碍。
锌是一种重要的微量元素，参与细胞功能的所有主要方面，包括代谢、解毒、抗氧化防御、信号转导和基因调节(44). 虽然锌是正常肝功能所必需的，但越来越多的证据表明锌在维持胃肠道上皮完整性方面发挥着重要作用(20,42,43). 口服锌补充剂已被证明可预防多种疾病条件下的肠道泄漏，如克罗恩病、实验性结肠炎、营养不良、肠道病原体挑战和甲氨蝶呤治疗(1,41,45,47,48). 电子显微镜研究表明，在实验性结肠炎中，锌补充剂可使断裂（开放）紧密连接的百分比降低50%(45). 机理研究表明，锌对肠屏障功能的保护与金属硫蛋白（MT）的诱导和氧化应激的抑制有关(37,48). 最近的一项研究表明，锌转运蛋白减少导致的锌缺乏是酒精诱导的肺泡上皮屏障功能障碍的原因(19). Caco-2细胞缺锌不仅会导致膜屏障损伤，而且会增加中性粒细胞的迁移(16). 我们之前的研究(29)研究表明，锌可以独立于MT保护急性酒精中毒诱导的肠道组织病理学变化，这表明其他锌结合蛋白可能介导锌的作用。本研究表明，缺锌会分解紧密连接蛋白，这表明锌调节上皮屏障的新机制。我们还发现，轻度缺锌对酒精诱导的上皮屏障破坏有致敏作用。这些数据表明，锌缺乏不仅可以介导而且可以使酒精对上皮屏障的影响变得敏感。由于活性氧、醛类和脂质过氧化产物已被证明能从锌蛋白中释放锌，因此锌蛋白功能障碍在酒精诱导的肠道渗漏发病机制中的意义应在未来的研究中进一步明确。
总之，本研究表明，长期饮酒会导致回肠氧化应激，从而通过动员细胞内锌而导致锌缺乏。缺锌可直接分解紧密连接蛋白，或间接使上皮细胞对酒精的作用敏感，导致上皮屏障功能障碍，继而增加肠道通透性。因此，这些结果表明，缺锌严重调节酒精性肝病中酒精诱导的肠屏障功能障碍以及由此导致的内毒素血症和肝损伤的发展。
赠款
这项研究得到了国家卫生研究院（Z.Zhou，C.J.McClain，Y.J.Kang）、膳食补充剂办公室（Z.Zhou）资助、路易斯维尔大学校内资助项目（M.Cave）和退伍军人管理局（C.McClain）的部分支持。
披露
作者没有意识到与本文中讨论的主题或材料与作者或作者的任何学术机构或雇主之间存在财务冲突。
致谢
我们感谢孙新国（Xinguo Sun）的技术援助，感谢Marion McClain对本文的审阅。魏忠（D.V.M.）由中国留学基金会国家奖学金基金资助。Y.J.Kang和C.J.McClain是路易斯维尔大学杰出的大学学者。
参考文献
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