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公共科学图书馆一号。2010; 5（5）：e9341。
2010年5月7日在线发布。 数字对象标识：10.1371/journal.pone.0009341
预防性维修识别码：项目经理2866542
PMID：20479888

识别和注释人RPE特异性基因表达的新策略

朱迪思·布伊吉,1 Jacoline B.ten Brink公司,1 Sigrid M.A.Swagemakers公司,2,三 安尼米克·J·M·H·沃克克,2 安克·H·W·埃辛,1 彼得·范德斯佩克,2和亚瑟·A·B·卑尔根1,4,5,*
托马斯·A·雷，编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

背景

鉴定和功能注释人类视网膜色素上皮（RPE）中细胞类型特异性基因的表达，RPE是与年龄相关性黄斑变性和视网膜色素变性有关的关键组织。

方法论

使用激光显微切割从选定的新鲜冷冻健康人供体眼睛中分离出RPE、感光细胞和脉络膜细胞。根据安捷伦规范，对44k微阵列进行RNA分离、扩增和杂交。使用Rosetta Resolver、David和Ingenuity软件进行生物信息学。

主要调查结果

我们之前对RPE转录组进行的22k分析表明，RPE具有高水平的蛋白质合成、强烈的能量需求、暴露于高水平的氧化应激和不同程度的炎症。我们目前使用一种补充性的新策略，旨在识别和功能注释RPE特异表达的转录本。这种策略利用了视网膜的多层细胞结构，克服了以往研究的一些局限性。在三份报告中，我们比较了RPE、感光细胞和脉络膜细胞的转录体，并推断了RPE的特异性表达。我们确定了至少114个具有RPE特异性基因表达的条目。这114个基因中有39个在RPE中也显示出高表达，与文献相比，这39个基因中85%以前被鉴定为在RPE表达。在114个RPE特异基因组中，涉及（膜）转运、视觉和眼病的基因过度表达。更根本的是，我们发现RPE特异性参与RAR激活、视黄醇代谢和GABA受体信号通路。

结论

在本研究中，我们通过识别和分析RPE中特异表达的基因，进一步规范和了解RPE转录组。

介绍

视网膜色素上皮（RPE）是一种单细胞视网膜层，在视觉功能中起着特别重要的作用。其参与了大量严重的视网膜疾病，如年龄相关性黄斑变性和视网膜色素变性，说明了这一点。

RPE具有多种功能，包括为感光细胞提供营养、从感光细胞中回收视网膜以及调节视网膜下空间的离子平衡。RPE分泌许多生长因子。因此，它参与了相邻（细胞）层、顶端侧的光感受器、基底外侧的布鲁赫膜和脉络膜的结构和细胞分化的维持（见图1)[1].

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为pone.0009341.g001.jpg
RPE周围的（单元）层概述。

连接RPE细胞的深棕色矩形表示细胞之间存在紧密连接。照片：感光器。

在胚胎发育过程中，RPE和感光细胞都是从神经垂体发育而来的。神经-垂体中的折叠导致该结构的两层面对面[1]其中一层发育为视网膜色素上皮，另一层发育成神经视网膜。神经视网膜进一步分化，感光细胞与视网膜色素上皮的微绒毛密切相互作用[1]神经嵴细胞脉络膜的发育也依赖于成熟RPE的线索[2]脉络膜血管是通过眼旁间质现有血管的新生血管形成的[2]最后，布鲁赫膜（BM）由RPE的基底膜和内皮的基底膜形成。这样，视网膜就发展成一个排列整齐的多层结构(图1).

我们最近分析了RPE转录组[3]。我们报道了从健康人类供体眼睛中特异性分离的细胞RPE中的表达基因和相关分子途径[3]RPE转录组的功能注释表明，RPE具有高水平的蛋白质合成、强烈的能量需求、暴露于高水平的氧化应激和不同程度的炎症[3]这些数据证实并扩大了我们对RPE功能特性的了解，这些知识以前曾在许多研究中得到确认[4]–[7]尽管如此，由于研究设计的原因，我们之前的研究受到邻近细胞类型不可避免的污染的限制[3],[5],[8].

在当前的研究中，我们通过使用一种新的44k微阵列策略克服了这一限制，该策略包括实验中的RPE细胞层和相邻细胞层。我们使用一个平台比较了感光细胞、RPE和脉络膜细胞的转录体。我们推断至少有114个基因在RPE中特异性表达，并描述了它们相应的途径。

结果

我们对从健康人类供体眼睛的RPE、感光细胞和脉络膜细胞中特异性分离的RNA进行了微阵列分析。最近，我们通过测量基因表达水平和鉴定RPE的功能特性来定义RPE转录组[3]目前的研究通过鉴定RPE中表达水平远高于相邻细胞层、感光细胞和脉络膜的基因，进一步规范了RPE转录组。此外，我们将我们的数据集从22 k微阵列平台扩展到44 k微阵列，从而更广泛地覆盖人类基因组[9]我们使用更先进的生物信息学来分析数据。

RPE基因表达与光受体或脉络膜的比较

在芯片上显示的33712个特征中(GSE20191标准 [10]，请参阅文本S1)在三个阵列中，1904（5.6%）个基因在RPE中的平均表达量是感光细胞（RPE>phot）的2.5倍（参见表1和文本S2). 编码信号蛋白、糖蛋白、分泌蛋白、膜蛋白、细胞黏附蛋白、细胞外基质蛋白、参与免疫反应的蛋白、Ca2+-结合和肌动蛋白结合（大卫[11]). 对这些基因的功能分析表明，基因在以下途径中过度表达：细胞粘附分子、黑色素生成和I型糖尿病。

表1

与感光细胞相比，RPE中表达最高的前30个基因[27],[30].
基因符号Genbank IDFC RPE/chor和phot
ITGB8标准 电话：04202844
C1或168 AK093468公司41
第8A1列 AL359062型37
SLC26A4型 NM_000441号37
SLC26A7型 NM_05283237
DKFZp761G0122 AL713743号37
CLIC6系列 NM_05327734
VASN公司 NM_13844033
SMOC2公司 NM_02213831
SLC16A12型 AK124901公司29
C6或105 NM_032744号28
SLC6A13型 BC020867号28
PRDM16项目 NM_02211428
LGI1号机组 NM_005097号27
可编程逻辑控制器5 NM_15266626
A_32_P114831 A_32_P11483126
KCNS3公司 NM_002252号25
最佳1 NM_00418323
IL8号机组 NM_000584号23
TMEM27型 NM_020665号23
NTN4号机组 NM_02122923
RWDD3项目 126344肯尼亚先令23
LRP8系列 NM_004631号23
SLCO1C1型 NM_017435号23
COL8A2系列 NM_00520222
MYRIP公司 NM_01546022
GPNMB基因 纳米_00251020
PLA2G7系列 纳米_00508420
KCNJ13号机组 NM_002242号19
FAM40B型 AB032996号19
FC：与六种阵列中的脉络膜和感光细胞相比，RPE的折叠变化、平均表达水平。

此外，阵列上33712个基因中的1126个（3.3%）在RPE中的表达比脉络膜（RPE>chor）中的表达平均高2.5倍（参见表2和文本S3). 在这组基因中，编码视觉、视网膜色素变性和（膜）转运相关蛋白的基因，以及具有交感功能的基因和嗅觉传导途径中的基因显著过度表达。

表2

与脉络膜相比，RPE中表达最高的前30个基因[27],[30].
基因符号Genbank IDFC RPE/chor和phot
RBP3型 NM_00290037
RPE65型 NM_000329号24
MPP4（MPP4） NM_033066号24
ELOVL4（弯头4） 纳米_02272623
GUCA1C公司 NM_00545923
PDE6G公司 NM_00260222
神经元1 NM_00250020
最佳1 NM_00418320
SLC6A13型 BC020867号19
ITGB8型 BC042028年19
RP1型 NM_00626919
GUCA1B公司 BX537393型19
PDC公司 NM_002597号19
CNGB3公司 NM_019098型18
可编程只读存储器1 NM_00601718
PRPH2型 NM_000322号18
HCN1型 AK094523公司18
DKFZp761G0122 AL713743号17
挂钩1 AK02725017
昆虫2 NM_00527216
RLBP1型 NM_000326号16
C6或105 NM_032744号16
CNGA1型 NM_000087号16
ABCA4公司 挪威_00035016
TMEM27型 NM_020665号16
RWDD3项目 126344肯尼亚先令16
OPCML公司 BX537377型15
NRL公司 NM_006177号15
C1或168 AK093468公司15
TMEM16B型 NM_020373号15
注意，RPE细胞可能存在细胞污染，通过ABCA4公司转录本，这是真正的感光细胞特异转录本[31]FC：与脉络膜和感光细胞在六种阵列中的表达水平相比，RPE的折叠变化和平均表达水平。

一种检测RPE特异性基因表达的新策略

到目前为止，所有RPE转录组研究，包括我们自己的研究[3]，旨在将RPE附近的细胞层排除在实验之外，以防止细胞污染，并尽可能实现最高的RPE组织特异性[3],[4]然而，即使通过细致的激光解剖显微镜分离RPE细胞，也会不可避免地受到相邻细胞类型的污染[5],[8]（本研究）。

然而，在当前的研究中，我们并没有将相邻的细胞层视为可能的污染物，而是将其作为比较基因表达的宝贵资源。我们的主要目的是进一步确定视网膜色素上皮中基因的表达水平，以及它们在感光细胞和脉络膜中的表达水平。通过这种方式，我们推导出RPE特异性基因表达。

RPE特异性基因表达

作为第一次分析，我们确定了所有具有平均的表达式级别至少RPE比感光细胞和脉络膜高2.5倍。这产生了一个包含458个具有RPE特定表达式的条目的列表（请参见文本S4). 功能注释显示，与肌醇代谢、视黄醇代谢、遗传疾病和眼病相关的基因过度表达（数据未显示）。

为了说明我们识别RPE特定转录本的方法的有用性，我们接下来采用了更严格的标准（即全部的六个阵列至少RPE的表达水平是感光细胞和脉络膜的2.5倍（RPE>phot&chor FC>2.5）。这产生了114个基因（参见表3). 我们根据最近发布的数据集进行推断[3]这114个基因中有39个在RPE中高度表达（参见表4).

表3

在所有六个微阵列中，114个基因的RPE表达比光感受器和脉络膜中的RPE至少高2.5倍，定义为RPE特异性表达。
基因符号Genbank ID常设费用基因符号Genbank ID常设费用基因符号Genbank ID常设费用
ITGB8标准 BC042028年31 SLC16A14型 NM_15252710 ACOT11型 NM_1471617
C1或168 AK093468公司28 WFDC1公司 纳米_02119710 CDH3型 NM_001793号6
DKFZp761G0122号 AL713743号27 SLC6A13型 NM_01661510 FRZB公司 NM_001463号6
SLC6A13型 BC020867号24 CACNB2公司 BG428517号10 LOC439949号 AY007155号6
C6或105 NM_032744号22 SLC2A12型 NM_14517610 SERPINF1系列 NM_002615号6
CLIC6系列 NM_05327722 SLC6A12型 NM_003044号10 GPAM公司 NM_020918号6
最佳1 NM_00418321 KIAA0953号 AF131834型10 聚光灯1 NM_004598号6
RPE65型 纳米_00032920 ADORA2B公司 NM_000676号10 FLJ30594型 NM_153011号6
可编程逻辑控制器5 NM_15266619 CA14号机组 NM_01211310 MUPCDH公司 NM_031264号6
TMEM27型 NM_020665号19 PNPLA3型 NM_025225号10 C1或168 125198肯尼亚先令6
RWDD3项目 126344肯尼亚先令19 RGR公司 纳米_00292110 CLDN19型 NM_1489606
LRP8系列 纳米_00463119 STRA6系列 纳米_0223699 LMO1型 NM_002315号6
LGI1号机组 NM_005097号18 C7或46 NM_1991369 GLDC公司 NM_000170号6
SLC16A12型 AK124901公司17 KIRREL2号机组 NM_1991809 A_24_P186746号 A_24_P186746号5
FAM40B型 AB032996号17 RDH5型 NM_002905号9 RDH11型 NM_0160265
2016年4月 NM_02211416 骨形态发生蛋白4 NM_001202号9 SFRP5型 NM_003015号5
肉豆蔻 NM_01546016 TMEM56型 NM_1524879 新加坡元1 NM_005627号5
骨形态发生蛋白7 NM_00171915 1892753泰铢 1892753泰铢9 吉尔吉斯斯坦共和国18 NM_000224号5
ERMN公司 AB033015号14 CNKSR3公司 NM_1735159 OPHN1号机组 NM_0025475
SLC13A3型 NM_02282914 CCNO公司 纳米_0211478 TDRD9（TDRD9） NM_153046号5
SLCO1C1型 纳米_01743514 RDH10型 72037纳米8 EZR公司 NM_0033795
轻轨自动列车 NM_004744号13 PBX4交换机 NM_025245号8 FAM40B型 BC019064号5
OPCML公司 BX537377型13 跳过 NM_1307668 C7或46 BC042034年5
RLBP1型 NM_000326号13 SLC7A10型 NM_0198498 CTSD公司 AK022293号5
TRPM3型 NM_206948号13 CXCL14系列 NM_0048878 DHCR7型 NM_001360号4
KCTD4公司 NM_19840413 A_24_P234871号 A_24_P234871号8 ITGAV公司 NM_002210号4
1934449泰铢 1934449泰铢13 COL20A1系列 NM_020882号8 GALNT11号机组 NM_022087号4
LRP8系列 NM_01752212 LHX2型 NM_0047898 1967593泰铢 1967593泰铢4
SLC39A12型 NM_15272512 C1QTNF5号机组 NM_015645号7 LOC650392号 BC036550号4
DUSP6型 NM_001946号12 SLC22A8型 NM_0042547 高性能显示器 NM_0021504
ERMN公司 BC026345号11 ROBO2公司 AK0747807 BCAT1公司 NM_005504号4
SLCO1A2型 NM_005075号11 1970019泰铢 1970019泰铢7 A_23_P122650型 A_23_P122650型4
RBP1型 NM_00289911 ADAD2（ADAD2） NM_1391747 A_32_P226525号 A_32_P226525号4
SLC16A3型 NM_004207号11 或51e2 NM_030774号7 保时捷中国4 NM_0061984
CNDP1型 NM_03264911 SLC6A20型 NM_020208号7 甲32_P112546 甲32_P1125464
SLCO1A2型 NM_134431号11 SLC16A8型 NM_013356号7 KIAA1576号机组 NM_020927号4
1839330泰铢 1839330泰铢11 204763泰铢 204763泰铢7 A_23_P73096型 A_23_P73096型4
SULF1系列 NM_01517011 A_24_P109661号 A_24_P109661号7 BASP1公司 NM_006317三
FC：与六种阵列中的脉络膜和感光细胞相比，RPE的折叠变化、平均表达水平。

表4

我们先前研究中确定的39个高表达水平的RPE特异性基因[3].
基因符号Genbank IDFC RPE/chor和phot文献中RPE的表达裁判复习Schulz
C6或105 NM_032744号22微阵列 [32]
最佳1 NM_00418321免疫组织化学染色 [33]
TMEM27型 NM_020665号19本研究，图11
LRP8系列 NM_004631号19微阵列 [32] 1
LGI1号机组 NM_005097号18审查，仅限于RPE研究 [4] 1
FAM40B型 AB032996号17cDNA克隆 [34]
ERMN公司 AB033015号14本研究，图11 1
轻轨自动列车 NM_004744号13western blot，northern blot [35]
RLBP1型 NM_000326号13荧光免疫细胞化学 [36] 1
DUSP6型 NM_001946号12est数据库 [37] 1
RBP1型 NM_00289911综述，视网膜/RPE中表达的基因 [4] 1
第16a3页 NM_004207号11免疫荧光 [38] 1
WFDC1公司 NM_021197号10免疫细胞化学，微阵列 [8],[39] 1
KIAA0953号 AF131834型10综述，视网膜/RPE中表达的基因 [4]
CA14号机组 NM_01211310免疫细胞化学 [40] 1
RGR公司 NM_002921号10微阵列 [32] 1
STRA6系列 NM_0223699免疫组织化学 [41]
RDH5型 NM_002905号9北方印迹 [20] 1
骨形态发生蛋白4 NM_001202号9RNA酶保护试验 [42] 1
CXCL14系列 NM_0048878微阵列，RT-PCR [39] 1
LHX2型 NM_0047898原位杂交 [43] 1
C1QTNF5号机组 NM_015645号7cDNA文库 [44],[45] 1
SLC6A20型 NM_020208号7本研究，图11
SLC16A8型 NM_013356号7聚合酶链反应 [46] 1
CDH3型 NM_001793号6西方印迹 [47] 1
FRZB公司 NM_001463号6综述，视网膜/RPE中表达的基因 [4] 1
SERPINF1系列 NM_002615号6氨基酸测序 [48] 1
聚光灯1 NM_004598号6本研究，图11
LMO1型 NM_002315号6本研究中，图11
RDH11型 NM_0160265牛和猴、免疫组织化学和原位杂交 [21] 1
SFRP5系列 NM_003015号5北方印迹 [49] 1
新加坡元1 NM_005627号5本研究，图11 1
吉尔吉斯斯坦共和国18 NM_000224号5CNV RPE逆转录聚合酶链反应 [50] 1
EZR公司 NM_0033795大鼠免疫荧光和免疫电镜 [51] 1
DHCR7型 NM_001360号4微阵列 [32] 1
ITGAV公司 NM_002210号4微阵列 [32] 1
GALNT11号机组 NM_022087号4综述，视网膜/RPE中表达的基因 [4] 1
保时捷中国4 NM_0061984综述，视网膜/RPE中表达的基因 [4] 1
BASP1公司 NM_006317三微阵列 [32] 1
第四栏和第五栏显示，39个基因中的33个（85%）之前在文献中的个别研究中使用几种不同的技术描述了RPE表达（RNA或蛋白质水平）。第六列显示，39个基因中的29个（74%）也存在于Schulz等人的研究中。[4]视网膜/RPE中表达的13037个基因的报告（补充表2)参考文献：文献参考，FC：折叠变化，RPE与脉络膜和感光细胞在六个阵列中的平均表达水平比较，第六列中的1个：存在。

我们接下来假设，鉴于这39个基因的高度表达，在之前的研究中很容易通过其他方法检测到。我们将当前研究中39个高表达的RPE特异性基因与包含13037个基因的数据库进行了比较，这些基因被描述为在视网膜或RPE中特异性表达，Schulz等人[4]并且能够在数据库中识别出29个我们的基因（75%）（参见表4). 对RPE中基因表达的个别研究进行了更彻底的手工搜索，结果表明，39个基因中有85%以前被鉴定为在RPE中表达(表4).

对于剩余的15%（6个基因），文献中没有可用的数据。使用半定量QPCR（s-QPCR），我们确认了这些基因的RPE表达(表4和图2). 两个ERMN(AB033015号)和SLC6A20(NM_020208号)与脉络膜或感光细胞相比，RPE中的表达更高，从而充分证实了微阵列数据。TMEM27型(NM_020665号)和LMO1(NM_002315号)RPE中的表达似乎也高于脉络膜，但在感光细胞中的表达大致相同。新加坡元1(NM_005627号)在所检测的所有三个细胞中普遍表达。SPOCK1的表达(NM_004598号)与光感受器相比，RPE中的RPE相当低，显然不能证实微阵列数据。

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通过s-QPCR确认微阵列结果。

β肌动蛋白是一种家庭用基因，用于使视网膜所有细胞之间的基因表达正常化。黑色条表示RPE表达水平，灰色条表示脉络膜表达，空条表示感光细胞表达。所有基因的RPE表达都显示在微阵列中。另请参阅文本和表4.

RPE特异基因表达的功能注释

我们使用114个RPE特异表达基因的列表，进一步对RPE特异的主要通路进行功能注释。在线数据库DAVID没有发现这组基因中的任何Kegg通路。然而，在Ingenuity软件识别的95个基因中，以下功能类别的基因有显著的过度表达：交感、膜转运、视觉、糖蛋白、转运（p<0.0001）。此外，使用Ingenuity数据库，我们确定了三种典型的途径（参见图3)：RAR激活(图4)，视黄醇代谢(图5)和GABA受体信号(图6). 我们发现了四种基因过度表达的生物功能：眼科疾病、视觉系统发育和功能、遗传性疾病和神经系统发育和功能（见图7). 最后，我们确定了四个与我们的RPE特异基因列表相关的网络（参见图8,​,9,9,​,10,10、和​和1111).

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Ingenuity软件确定的三种典型路径[25]在RPE特异基因组中。

三条横线代表已确定的标准路径，x轴代表路径。y轴显示Benjamini-Hochberg（B–H）p值的−对数。虚线代表一个阈值，在该阈值之上，一条通路中的基因数量在统计上显著多于预期。

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Ingenuity软件确定的RAR激活途径。

这是一条典型的通路，在114个RPE特异表达基因组中，包含的基因在统计上显著多于预期的偶然基因。该图显示了与过度表达基因相对应的蛋白质。彩色字段表明它们存在于114个RPE特异表达的基因中，未着色的基因由软件添加以形成路径。分子之间的实线表示分子之间的直接物理关系（例如调节和相互作用的蛋白质域）；虚线表示间接的功能关系（例如细胞系中两个基因的共同表达调控）。

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Ingenuity软件确定的视黄醇代谢途径。

这是一条典型的通路，在114个RPE特异表达基因组中，包含的基因在统计上显著多于预期的偶然基因。该图显示了与过度表达基因相对应的蛋白质。彩色符号表示它们存在于114个具有RPE特异表达的基因中，未着色的基因由软件添加以形成通路。分子之间的实线表示分子之间的直接物理关系（例如调节和相互作用的蛋白质域）；虚线表示间接的功能关系（例如细胞系中两个基因的共同表达调控）。

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Ingenuity软件识别的GABA受体信号通路。

这是一条典型的通路，在114个RPE特异表达基因组中，包含的基因在统计上显著多于预期的偶然基因。该图显示了与过度表达基因相对应的蛋白质。彩色符号表示它们存在于114个具有RPE特异表达的基因中，未着色的基因由软件添加以形成通路。分子之间的实线表示分子之间的直接物理关系（例如调节和相互作用的蛋白质结构域）；虚线表示间接的功能关系（例如细胞系中两个基因的共同表达调控）。

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Ingenuity软件确定的四种最重要的生物功能[25]在RPE特异基因组中。

四条横线代表已确定的标准路径，x轴代表路径。y轴显示Benjamini Hochberg（B–H）p值的−log。虚线代表一个阈值，在该阈值之上，一条通路中的基因数量在统计上显著多于预期。

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Ingenuity软件生成的最重要的分子网络。

网络由我们的数据集生成，具有RPE特定的表达式（114个条目；请参阅文本）。请注意，彩色符号表示出现在我们的数据集中的基因条目，而透明条目是知识数据库中的分子，插入以连接单个网络中的所有相关分子。分子之间的实线表示分子之间的直接物理关系（例如调节和相互作用的蛋白质域）；虚线表示间接的功能关系（例如细胞系中两个基因的共同表达调控）。基因名称的缩写符合Genbank中使用的标准缩写[29]Ingenuity为这个分子网络提供的主要功能是神经系统开发和功能、视觉系统开发和函数、有机体开发。此网络与中的网络重叠图2). 该网络的亮点包括：（a）MAPK/ERK途径的调节作用，这是一种非常复杂的信号转导途径，将细胞内对生长因子与细胞表面受体结合的反应耦合起来；（b） 血小板衍生生长因子（PDGF-BB），已知可诱导RPE细胞增殖、迁移和增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）的发展，间接作用于该网络中的多个分子，c）RPE视黄醇代谢存在于该分子网络的外围。

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Ingenuity软件生成的第二大重要分子网络。

网络由我们的微阵列数据集生成，具有RPE特定表达（114个条目；见正文）。有关图表上符号的说明，请参见图例图7Ingenuity为该分子网络提供的主要功能包括细胞发育、血液系统发育和功能以及结缔组织发育和功能。该网络的亮点包括：（a）GABA受体的双重存在SLC6A12型[NM_003044号]和SLC6A13型[NM_016615]; （b）胰岛素-1（INS1）蛋白和（c）孕激素的存在和相互作用。

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由Ingenuity生成的第三个重要分子网络。

网络由我们的微阵列数据集生成，具有RPE特定表达（114个条目；见正文）。有关图上符号的说明，请参见图例图7Ingenuity为这个分子网络提供的主要功能是细胞运动、神经系统发育和功能以及基因表达。请注意β-雌二醇的中枢信号传导作用；已知会影响视网膜功能和疾病。

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由Ingenuity生成的第四个重要分子网络。

网络由我们的微阵列数据集生成，具有RPE特定表达（114个条目；见正文）。有关图表上符号的说明，请参见图例图7。此网络与中的网络重叠图7Ingenuity为这个分子网络提供的主要功能是脂质代谢、分子运输和核酸代谢。该网络的亮点包括：（a）HNF4A型转录因子和（b）NFkappaβ和（c）Wnt信号通路。

39个高表达RPE特异性基因组也发现了类似的功能注释（数据未显示）。在对这组患者进行更仔细的检查后，我们还发现了八个（几乎五分之一！）已知的视网膜疾病基因(最佳1[NM_004183],C1QTNF5号机组[NM_015645号],CDH3型[NM_001793号],轻轨自动列车[NM_004744号],RDH5型[NM_002905号],RDH11型[NM_016026],RGR公司[NM_002921号],RLBP1型[NM_000326号]和STRA6系列[NM_022369]). 15个条目代表膜结合或跨膜基因。

讨论

研究设计

在本研究中，我们通过分析RPE中表达的基因及其在感光细胞和脉络膜中的表达，进一步明确了RPE转录组。我们使用在线数据库DAVID和Ingenuity软件对我们的微阵列数据进行功能分析，以便对数据进行分类，并确定RPE中特异表达的114个基因的重要功能特性。此外，我们确定了39个具有RPE特异表达和RPE高表达水平的基因，在85%的基因中，我们能够利用文献证实RPE的表达。

对于剩余的15%，进行sQPCR，在大多数情况下证实RPE富集表达。我们目前的研究设计侧重于比较基因表达，不包括两个或多个组织中高表达水平的基因。

正如其他地方广泛讨论的那样[5],[8]，对视网膜应用LDM程序不可避免地会造成一定程度的细胞污染。本研究中的一个重要问题是，如果我们能够通过比较三个相邻细胞单层的表达谱来克服细胞污染问题，换句话说，我们是否成功地识别了RPE特异性转录物？许多考虑因素是重要的：1）显然，如果我们选择更严格的比较标准（例如，表达RPE>20倍于光感受器或脉络膜，而当前标准RPE>2.5倍于光感受器或脉络膜），我们将获得更具体的RPE表达数据集。2） 在我们现有的114个RPE基因的数据集中，我们没有发现任何高表达（已知）感光转录物的明显污染，如视蛋白。3） 114个基因中的大多数通过有限数量的分子途径和网络相互作用，其功能注释或多或少可归因于RPE。这进一步证实了这些转录本的RPE特定来源。对于大多数完全未知的基因，我们的sQPCR数据证实了微阵列数据。只有一个条目（SPOCK1）显示出明显高于等效RPE的光感受器表达，并且没有证实微阵列数据。这种差异的原因尚待阐明。综合所有数据，在114个已识别的转录本中，大部分具有RPE特异性；虽然还不能排除一些轻微的污染，但比以前要好。

RPE的功能特性

RPE与仅光感受器

与光感受器相比，RPE细胞表达三种不同功能类别的基因的水平明显更高。第一种是细胞粘附分子。RPE代表外血-视网膜屏障（BRB），这组分子很可能说明了RPE牢固粘附于BM以保持屏障完整性的重要性。第二条途径是RPE中唯一存在的黑色素生成途径。事实上，在色素沉着的RPE中，色素颗粒可以防止氧化应激[12]第三个RPE途径是I型糖尿病途径。13个基因中有12个是主要组织相容性复合体（MHC）的成员。在我们之前的研究中，RPE中表达水平高度可变的基因也存在这种途径[3]MHC基因负责抗原提呈，并与健康和疾病中的RPE特异性免疫反应有关[13].

除了上述Kegg通路外，还有一些基因在许多功能类别中过度表达，与RPE的主要功能有关。有分泌蛋白、信号蛋白和钙2+-结合蛋白。众所周知，许多RPE特异性钙2+通道参与细胞内信号传导、细胞信号转导和各种因子分泌的调节[14].

其他功能类别包括与RPE的结构作用及其与BM的相互作用相关的膜蛋白、细胞粘附蛋白和细胞外基质（ECM）蛋白[1],[15].

最后，糖蛋白过度表达。糖蛋白对感光细胞外段的吞噬作用至关重要[16].

RPE与仅脉络膜

在RPE中的表达水平高于脉络膜的基因组中，嗅觉转导途径中的基因表达过高。该途径主要包含鸟苷酸环化酶和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶，它们自然存在于RPE等高活性细胞中。此外，还有大量与视觉和运输有关的基因。显然，RPE在许多信号分子的转运和感光细胞废物的转运中起着主导作用。

RPE特异表达基因

我们使用David和Ingenuity软件对114个具有RPE特异表达的基因进行了功能注释。不出所料，这两个项目都产生了视觉、视觉和神经系统发育和功能、眼科疾病和遗传病，这些基因组的比例明显过高。事实上，大多数突变导致视网膜疾病的基因都是在视网膜色素上皮或感光细胞中具有高特异性表达的基因[3].

通过使用David，我们还发现了与sym或transport相关的基因的过度表达。这很可能代表了RPE的主要功能之一，即生物分子从脉络膜向光感受器的运输，反之亦然。光感受器严重依赖血液中的营养物质、氧气、激素等。与此同时，氧化胆固醇、视觉循环中间产物和过量水分等废物通过视网膜色素上皮离开视网膜[1].

Ingenuity数据库还揭示了三种典型的途径：RAR激活、视黄醇代谢和GABA受体信号。维甲酸与维甲酸受体（RAR）的结合导致组织特异性激活或抑制下游转录[17],[18]在成熟的RPE中，这一过程对于维持分化和体内平衡非常重要[17]因此，这种途径的显著存在可以解释为RPE需要对抗局部损伤（氧化应激、脂质消化、脂褐素积累）并维持体内平衡。

视黄醇代谢途径包含RDH5型[NM_002905号],RDH10型[NM_172037号]和RDH11型[NM_016026]基因，这三个基因都参与视觉周期的RPE部分[19]众所周知，RPE将所有-反式维甲酸到11-顺式异构体。更具体地说，RDH5型[NM_002905号]和RDH11型[纳米_016026]转换11-顺式视黄醇至11-顺式视网膜，而RDH10型[72037纳米]转换11-顺式视网膜对所有人-反式视网膜的[19]–[22].

最后，GABA是大脑和视网膜中GABA受体信号通路（Grsp）的一种重要抑制性神经递质[23]该通路参与GABA从视网膜下间隙的视网膜再摄取。有趣的是，该途径中至少有一种蛋白质（SLC6A12[NM_003044号])之前在大鼠和牛蛙RPE中观察到[23].

RPE表达基因与文献的比较

之前的研究，结合到一篇综述中，声称揭示了246个基因只在RPE中表达[4]引人注目的是，在当前的研究中，我们发现246个基因中有23个（9%）在感光细胞中的表达水平高于RPE。此外，246个基因中有72个（29%）在脉络膜中的表达水平高于RPE。这表明在之前进行的研究中，RPE信号中至少存在一定程度的污染。因此，在解释这些结果时应小心。

结论

我们的研究提供了RPE特异性基因表达的详细描述，并与相邻的细胞层、感光细胞和脉络膜进行了比较。此外，我们还对RPE特异基因的功能特性进行了详细的功能分析。我们发现RPE参与RAR激活、视黄醇代谢和GABA受体信号传导。此外，对于85%我们称之为RPE-特异性且高表达水平的基因，我们可以使用文献或多或少验证我们的结果。最后，我们添加了大量在RPE中显著表达的新基因。

方法

人类供眼

这项研究是根据赫尔辛基关于使用人体材料进行研究的宣言进行的。本研究中使用的材料由阿姆斯特丹科纳班克银行提供给我们。根据荷兰法律，科尔纳银行确保没有捐赠者反对将眼睛用于科学目的。由于数据是匿名分析的，因此不需要医学伦理委员会的批准。我们的方法的详细描述可以在其他地方找到[3]简言之，我们从五名尸体捐赠者中挑选了五只眼睛。根据标准方案，在尸检后16至22小时将球体摘除，数小时后将其冷冻。捐赠者死亡时的年龄为63至78岁。我们选择年龄较大的捐赠者，以尽量减少出现尚未确诊的单基因眼病的可能性。捐献者死于心脑血管疾病或慢性阻塞性肺病。捐赠者没有已知的眼科疾病。目视检查和组织学检查，包括定期酸性Schiff（PAS）染色，均未发现视网膜病变。选择三只眼睛进行RPE与脉络膜的分析，由于组织可用性有限，其中只有一只眼睛也用于RPE与感光细胞的分析。在RPE和感光器的第二和第三次比较中，选择了另外两只眼睛。

细胞采样

在使用之前，将球形阀卡扣冷冻并储存在−80°C的温度下。16毫米的黄斑碎片2如前所述，中心凹从每个视网膜上切除[8]对每只眼睛，用周期酸希夫染色多个冰冻切片，并用显微镜检查是否有异常。黄斑区的20µm切片用于分离脉络膜、RPE细胞和感光细胞。根据制造商的方案，对用于分离感光细胞的切片进行甲酚紫染色（LCM染色试剂盒，Ambion）。用于分离RPE细胞或脉络膜的切片未进行染色。在使用激光显微切割系统（PALM，Bernried，德国）进行显微切割之前，所有切片均用乙醇脱水并风干(图12). 细胞储存在−80℃。

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激光解剖显微镜前后研究中使用的不同细胞类型的冰冻切片。

切片用于分离a）和b）RPE细胞，c）和d）脉络膜，以及e）和f）感光细胞。请注意，由于使用冰冻切片，形态学相对较差。用于分离感光细胞的切片用甲酚紫染色（参见方法节段），其他节段未染色。比例尺如图a和图b所示。

RNA的分离和扩增

分离总RNA并扩增mRNA成分[8]扩增RNA（aRNA）用纳米液滴（荷兰Isogen Life Science B.V.）定量，并在生物分析仪（荷兰阿姆斯特尔芬安捷伦科技公司）上检查质量。随后，用Cy3或Cy5荧光探针标记aRNA样品。

微阵列设计和处理

所有杂交均使用44k微阵列（荷兰阿姆斯特尔文安捷伦科技公司）。对于其中三个供体，感光细胞RNA与RPE RNA杂交。此外，对于三个供者，脉络膜RNA与RPE-RNA杂交。如前所述进行杂交、洗涤和扫描[8].

数据分析

使用特征提取软件（v8.5 Agilent）和Rosetta Resolver软件（Rosetta Inpharmatics）处理和分析扫描图像。所有数据均符合MIAME标准，原始数据已保存在基因表达综合数据库（GEO）中。对于每个基因，我们计算了RPE和感光细胞信号之间的比率，或者RPE和脉络膜信号之间的比值，具体取决于阵列。这导致RPE与光感受器的三个比率，以及每个基因的RPE与脉络膜的三个比例。只有当单个基因的三个比率都大于2.5时，我们才认为一个基因在一个组织中的基因表达（GE）明显高于另一个组织。我们选择GE至少两倍的差异（倍变（FC）>2.5）作为RPE与光感受器GE（RPE>phot）、RPE与脉络膜GE（RPE>chor）以及RPE与感光器和脉络膜GE的截止标准（RPE>phot&chor）。同样的标准适用于与RPE-GE比较的感光细胞（phot>RPE）和与RPE-GE比较的脉络膜（chor>RPE）。使用David在线软件对平均FC>2.5的所有基因组进行Kegg通路（京都基因和基因组百科全书）和功能类别的功能分析[11]使用的截止标准是使用Benjamini-Hochberg校正或Ease分数（一种改进的Fisher精确检验）的p值小于0.001[11],[24]使用Ingenuity知识数据库对我们的RPE特异基因进行了更高级的分析[25]（IPA 7.4版，2009年4月），产生生物学功能、经典途径和基因网络。我们使用Genecards网站搜索了RPE特异性基因高表达水平的RPE表达证据的文献[26]在线孟德尔人遗传（OMIM）网站[27]和Pubmed网站[28]将基因名称与“RPE”或“retina”或“视网膜色素上皮”或“表达”结合使用作为搜索标准。

微阵列结果的确认

为了证实我们的微阵列数据，使用了sQRT-PCR（而不是QPCR），因为sQRT-PCR对a）不可避免地从人类供体眼睛获得的相对较差的RNA质量和b）LDM样品的相邻细胞污染不太敏感。此外，我们的目的是找到RPE、脉络膜和光感受器中表达的近似值。

用LDM衍生的RPE、脉络膜和感光细胞样本的RNA外显子跨越引物进行sQRT-PCR，共进行三次。引物序列可根据要求提供。对6个没有关于RPE基因表达的进一步文献数据的基因进行了测试(表4). B肌动蛋白是一种家庭用基因，用于使视网膜所有细胞之间的基因表达正常化。

支持信息

文本S1

阵列上的所有功能。阵列上提供的所有33712功能。

（2.32 MB XLS）

文本S2

所有基因在RPE中的表达均高于光感受器。RPE中所有基因的表达水平是感光细胞的2.5倍（平均值）。

（0.18 MB XLS）

文本S3

所有基因在RPE中的表达均高于脉络膜。RPE中表达水平高于脉络膜2.5倍的所有基因列表（平均值）。

（0.11 MB XLS）

文本S4

所有具有RPE特异表达的基因。RPE中所有基因的表达水平是脉络膜和感光细胞的2.5倍（平均值）。

（0.05 MB XLS）

脚注

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

基金：本研究得到了与失明作斗争基金会（T-GE-0101-0172）、荷兰科学研究组织（NWO；项目948-00-013）、荷兰皇家艺术科学院（KNAW）和荷兰基因组计划（NGI）/NWO的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

工具书类

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