病原菌对多种药物的耐药性目前是一个备受关注的话题(19). 在革兰氏阴性菌中,已有一些菌株几乎没有有效的抗菌剂可供使用(10). 在许多情况下,耐药调节缺陷(RND)家族的多药外排泵在这种表型的产生中起着重要作用(8,9,27). 在RND泵中,AcrB大肠杆菌已作为原型进行了最深入的研究。AcrB几乎可以输出所有种类的抗生素(氨基糖苷类除外),以及染料、洗涤剂、杀生物剂,甚至一些溶剂(24).
为了了解这种转运蛋白的功能及其在产生耐药性中的作用,了解其动力学行为至关重要。然而,很难获得AcrB及其亲属的动力学常数,主要是因为这些泵是以跨越两个膜的三元复合物的形式存在的,在AcrB的情况下,它包括AcrB、外膜通道TolC和周质衔接蛋白AcrA(2,33,37). 因此,必须使用完整的电池来测量有意义的动力学常数,在电池中保持泵装置的三部分结构。然而,在完整的细胞中,很难测量周质中的药物浓度,而周质是药物捕获的主要场所(24). 我们最近已经能够通过使用头孢菌素作为AcrB-AcrA-TolC复合物的底物来解决这个问题(16). 将头孢菌素添加到完整的大肠杆菌细胞,它们穿过外膜屏障进入周质,其中一些分子被AcrB复合物泵出,但其他分子被普遍存在的周质β-内酰胺酶水解。我们用分光光度法跟踪水解过程,根据β-内酰胺酶的动力学常数,我们可以确定周质浓度(C类第页)药物的作用。一旦我们知道C类第页,我们可以计算药物通过外膜的流入量,因为这是一个简单的扩散过程,与渗透系数以及药物通过膜的浓度差成正比,C类o个−C类第页,其中C类o个是药物的外部浓度。然后,流出率可以通过此流入量与水解率之间的差值获得,水解率是通过实验确定的。还观察到流出曲线与C类第页通常是乙状的,显示出底物分子协同结合的明显迹象。这与最初由X射线晶体学提出的想法一致(15,29,30)然后通过生化研究证实(34,35),AcrB三聚体的每个原聚体在药物结合和挤出过程中都会经历一系列构象变化,即“功能旋转”机制,因为在这种条件下,在任何给定的时刻,都可能有一个以上的底物分子与AcrB三聚体相互作用。
在这里描述的研究中,我们将这种方法扩展到青霉素的流出。青霉素特别有趣,因为AcrB缺失菌株的MIC值表明,多药外排对某些青霉素的固有耐药性有更大的贡献,例如acrB公司缺失使氯青霉素的MIC降低256倍(12,20),与大多数头孢菌素的MIC中检测不到或几乎检测不到的变化相反(12). 为了使异恶唑青霉素迅速水解,我们引入了一个含有OXA-7酶的质粒(13). 结果确实表明,青霉素类通常是AcrB泵更好的底物,动力学参数通过理论预测接近观察到的MIC值进行验证。在野生类型中使用这些常量大肠杆菌菌株产生了意想不到的预测,强调了外膜屏障在对更亲脂青霉素的内在抗性中的重要性。
材料和方法
细菌菌株和质粒构建。
菌株HN1157(16)是应变RAM121的衍生物(14)它不产生OmpF孔蛋白和具有大通道的突变OmpC孔蛋白,并且含有AcrR阻遏基因的缺失。应变HN1159,aΔacrAB公司长野和Nikaido描述了HN1157的衍生物(16). 由于本研究中使用的大多数青霉素不会被染色体β-内酰胺酶AmpC快速水解(1,三,4),我们引入了苯唑西林酶OXA-7(13,28),在质粒上。这个氧-7从质粒pMG202(来自G.a.Jacoby的礼物)中扩增该基因(28)将扩增子分别克隆到PCR BluntII Topo载体(Invitrogen)中。从带有EcoRI的重组质粒中切除克隆序列,并将其插入低拷贝数载体pHSG576的EcoRI-位点(36),在P后面紫胶启动子,产生pHSG576oxa7。然后将其转化为HN1157和HN1159。
生长条件。
HN1157/pHSG576oxa7在改良LB肉汤(1%胰蛋白酶、0.5%酵母提取物、0.29%氯化钠、5 mM硫酸镁)中生长4)以10μg/ml的氯霉素对质粒进行维持。将一圈菌落接种到25 ml肉汤中,肉汤在30°C下摇晃培养14 h。收获时,细胞处于固定相,光密度为600 nm(OD600)约3。对于苯唑西林、氯霉素、双氯西林、氨苄西林和青霉素V,向培养基中添加0.1%葡萄糖以减少未诱导的表达氧-7来自P紫胶以获得外排泵AcrAB-TolC和OXA-7的活性之间的期望比率。
微量碘量法动力学分析。
上述细胞在室温下通过离心收集,然后用50 mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)洗涤两次,缓冲液中含有5 mM MgCl2,将其重新悬浮在10 ml相同的缓冲液中。对于流出分析,2 ml完整细胞的OD600将0.2(假设相当于75μg细胞[干重]/ml)与β-内酰胺类抗生素(苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、哌拉西林、阿洛西林、美洛西林、青霉素V和氨苄青霉素)以所需的最终浓度混合,并在室温下加入0.15 ml 10%(wt/vol),5分钟后停止反应三氯乙酸(TCA)。原始OD细胞的超声提取(30秒休息+30秒脉冲,16次)6000.025(相当于9.38μg细胞[干重]/ml)以类似的方式用于β-内酰胺酶检测,但添加TCA 2分钟后反应停止。然后立即添加1 ml淀粉碘溶液,通过微量碘量法测定水解产物(32)和OD592使用Uvikon 860分光光度计,使用10-mm光通比色皿,在30分钟后读取。为了纠正青霉素的酸催化缓慢水解,在0分钟时也将TCA添加到重复反应混合物中,OD592从与细胞或酶孵育5或2分钟的反应混合物中减去该对照物的含量,以确定OD的变化592(Δ外径592).
由于微量碘测定法不能直接定量水解产物,因此有必要获得换算系数,E类,与ΔOD相关592生成的青霉酸的摩尔量。这些数值是通过青霉素的酶水解过程来获得的(25). 的值E类(Δ外径592/青霉素酸浓度[μM]/光路长度[以厘米为单位])分别为0.13、0.11、0.09、0.16、0.12、0.10、0.11和0.12;这些数值接近Novick报告的0.128(25)用于氨苄西林。尽管这些稍有不同的值可能反映了称量误差和药物样品的不同含水量,但我们使用实验确定的值来计算每种药物。
结果中描述了动力学分析的原理。通过流出速率曲线拟合,得出了动力学常数,V(V)e(电子)相对于周质浓度,C类第页,由CurveExpert程序1.3版提供。由于这些曲线明显呈S形,因此我们使用了针对合作性修改的迈克利斯·蒙顿方程,V(V)e(电子)=
·(C类第页)小时/[(K0.5)小时+ (C类第页)小时],其中
是最大流出速率,小时是希尔系数,以及K0.5(单位:μM)是给出半最大速度的药物浓度。迈克利斯·蒙顿常数,K米(以μM为单位)也通过使用标准Michaelis-Menten方程的曲线拟合得到。
MIC的理论预测。
我们修改了先前用于预测MIC的程序,该程序仅考虑了β-内酰胺的水解(21). 我们首先获得了抑制靶点所需的最低药物浓度,或C类inh公司获得该参数的最方便方法是测定缺乏β-内酰胺酶和外排的菌株,即HN1159的MIC。什么时候?C类第页到达C类inh公司在菌株HN1157/pHSG576oxa7中,降解和流出的总和,V(V)e(电子)+V(V)小时应通过流入量精确平衡,V(V)在里面因此,我们期望P(P)·A类·(C类o个−C类inh公司) =V(V)e(电子)+V(V)小时,其中P(P)是渗透系数A类是细胞的表面积。因此,MIC或C类o个此时可以通过插入以下值来计算V(V)e(电子)和V(V)小时计算对象C类第页等于C类inh公司根据公式MIC=C类o个= [(V(V)e(电子)+V(V)小时)/(P(P)·A类)] +C类inh公司.
测定测定的MIC。
接种物在添加了10μg/ml氯霉素的改良LB肉汤中培养过夜,用于含有pHSG576及其衍生物的菌株。用改良的LB琼脂在方形培养皿中制成底层含有各种β-内酰胺抗生素的线性平板,并将细菌悬液稀释至OD660板上有0.1条条纹(34). 在30°C下隔夜培养后观察平板。
试剂。
除哌拉西林和美洛西林外,所有抗生素均来自Sigma-Aldrich。哌拉西林从莱德勒实验室部门(纽约州珠江市)获得,美洛西林从拜耳公司(德国勒沃库森市)获得。所有其他试剂均为分析级。
结果和讨论
OXA-7β-内酰胺酶。
已知OXA-7容易水解青霉素、氨苄西林、苯唑西林和氯唑西林(13). 我们引入了氧-7-含有低拷贝数质粒pHSG576oxa7大肠杆菌K-12菌株,菌株HN1157,并发现该菌株在不诱导P紫胶发起人。事实上,为了在水解速率和流出速率之间达到最佳平衡,对于某些药物来说,有必要抑制P紫胶通过向培养基中添加葡萄糖来启动(表).
表1。
基底 | %葡萄糖用于生长 | (毫摩尔/毫克/秒)一 | K米(微米)一 |
---|
双氯西林 | 0.1 | 5.9 | 34 |
氯唑西林 | 0.1 | 6.3 | 31 |
苯唑西林 | 0.1 | 9.3 | 52 |
阿洛西林 | 0 | 4.3 | 18 |
美洛西林 | 0 | 5 | 29 |
哌拉西林 | 0 | 3.5 | 34 |
青霉素V | 0.1 | 6.7 | 29 |
氨苄西林 | 0.1 | 4.1 | 21.5 |
OXA-7的另一个优点是K米数值相当高,在10μM的范围内(表),因此在C类第页使用的值(通常小于2μM),水解速率对C类第页,可以精确确定C类第页值。
宿主菌株HN1157含有染色体放大器C编码C类β-内酰胺酶的基因。因此,我们最初担心两种不同的β-内酰胺酶共存可能会产生复杂的药物水解动力学。然而,AmpC酶对异恶唑基青霉素(苯唑西林、氯唑西林和双氯西林)基本上是惰性的(1,三,4). 即使是易水解的化合物氨苄西林,其最大水解速率(V(V)最大值)由于启动子非常弱,AmpC的含量非常低(5). 它V(V)最大值0.16 nmol/mg/s(21)少于V(V)最大值OXA-7(表)并且我们从未见过必须在存在两种不同酶的情况下进行曲线拟合的情况。因此,我们忽略了宿主染色体AmpC在外排动力学研究中的作用。
青霉素流出动力学。
青霉素的外排动力学是根据长野和Nikaido描述的头孢菌素的原理确定的(16). 简而言之,青霉素的水解速率(V(V)小时)用微量碘量法测定完整细胞的含量。由于我们还使用细胞的粗声波测定了周质OXA-7酶的动力学参数,这使我们能够计算底物的周质浓度(C类第页). 药物在外膜上的扩散速率(V(V)在里面)然后使用渗透系数进行计算,P(P),通过使用完整的细胞测定,其中AcrB泵通过质子解偶联剂羰基氰化物断电而失活米-氯苯腙(CCCP)。根据菲克扩散第一定律,V(V)我n个=P(P)·A类·(C类o个−C类第页),其中A类和C类o个代表电池的表面积(取132cm2/mg【干重】[23])以及药物的外部浓度,因此V(V)小时允许我们推导P(P)根据这个方程V(V)e(电子)等于0且V(V)在里面等于V(V)小时.V型e(电子)然后计算为流入率和水解率之间的差值,即。,V(V)在里面−V(V)小时,在未消毒的细胞中。虽然青霉素与青霉素结合蛋白结合,但一旦稳定状态建立,这不会影响其水解动力学。
由于我们通过添加0.5%(wt/vol,最终浓度)TCA来停止反应,并且我们读取了最终OD592碘-淀粉混合物在室温下30min后,有必要校正青霉素的酸诱导非酶水解。这是通过在0分钟时添加TCA并读取OD来实现的59230分钟后,对混合物的校正并不显著,但在任何实验中都不超过总ΔOD的30%592由细胞或细胞提取物水解引起的。
这些实验的结果(图。到; 表)清楚地表明,每种药物都以显著的速率泵出(与酶水解的速率相比)。此外,在每种情况下,流出动力学都明显呈S形,这意味着正合作性(17). 正协同性与最初根据三聚体的不对称晶体结构提出的AcrB三聚体功能旋转机制一致(15,29,30)其中每个原单体经历一个周期性构象变化,以适应其相邻原单体的构象变化。在这样的方案中,生化遗传学研究也证实了这一点(34,35)在任何给定的时刻,三聚体可能与一个以上的底物分子相互作用,因此,正协同动力学符合这一机制。
V(V)e(电子)s(圆圈)和V(V)小时菌株HN1157/pHSGoxa7中异恶唑基青霉素s(三角形)。利率与C类第页,根据完整细胞中的水解速率确定,如文中所述。顶部,双氯西林;中间,氯青霉素;底部为苯唑西林。
V(V)e(电子)s(圆圈)和V(V)小时菌株HN1157/pHSGoxa7中青霉素V和氨苄西林的s(三角形)。利率与C类第页,根据完整细胞中的水解速率确定,如文中所述。Top,青霉素V;底部为氨苄西林。
表2。
基底 | (毫摩尔/毫克/秒) | 希尔系数 | K0.5(微米) | 渗透系数(μm/s) | 替换日志P(P)一 |
---|
双氯西林 | 0.98, 0.95, 0.94 | 3.6, 4.7, 4.3 | 0.53, 0.83, 0.82 | 0.6, 0.6, 0.6 | 3.4 |
氯唑西林 | 0.89, 0.99, 0.80 | 2.3, 2.7, 2.4 | 0.95, 1.03, 0.91 | 0.6, 0.6, 0.6 | 2.8 |
苯唑西林 | 0.94, 1.1, 0.94 | 2.6, 2.7, 2.6 | 1.04, 0.97, 1.03 | 0.6, 0.6, 0.6 | 2.1 |
阿洛西林 | 0.42, 0.41, 0.35 | 4.0, 4.0, 4.6 | 1.08, 1.06, 1.09 | 0.4, 0.4, 0.4 | 0.71 |
美洛西林 | 0.51, 0.47, 0.50 | 4.4, 4.5, 4.5 | 1.09, 1.08, 1.11 | 0.5, 0.5, 0.5 | 0.67 |
哌拉西林 | 0.39, 0.35, 0.39 | 4.1, 3.7, 4.1 | 1.06, 1.08, 1.08 | 0.4, 0.4, 0.3 | 0.45 |
青霉素V | 0.72, 0.85, 0.72 | 4.7, 4.7, 4.6 | 0.82, 0.84, 0.83 | 0.8, 0.7, 0.7 | 1.54 |
氨苄西林 | 0.38, 0.37, 0.37 | 1.9, 2.3, 2.5 | 0.88, 0.92, 1.03 | 0.8, 0.8, 0.8 | −1.03 |
观察到的Hill系数较高(表)然而,令人惊讶的是,AcrB只有三个原体。一种可能的(部分)解释可能是低估了P(P)由质子导体CCCP使AcrB泵断电的细胞中的水解速率确定。在我们之前的研究中(16),我们观察到CCCP明显也分为外膜双层,降低了其被动渗透性。因此,青霉素类通常比头孢菌素更亲脂,并且更容易渗透到外膜双层,因此,对青霉素类的测定P(P)使用CCCP可能会导致对P(P)例如,对于哌拉西林,希尔系数为3.7,通过使用P(P),如果P(P)假设为使用CCCP分析所得值的两倍。(这不会改变K0.5值,尽管
大幅增加。)
因为异恶唑基青霉素具有非常相似的结构,但它们的6个取代基涵盖了一系列显著的亲脂性(表,最后一列),我们可能有理由比较这些药物的行为。如表所示,的K0.5随着亲脂性的增加,数值显著下降,表明与泵的亲和力更高。这与晶体学阐明的结合位点的知识一致(15)以亲脂性,尤其是芳香性侧链为界(24,29). 有趣的是,在最亲脂的双氯西林中,希尔系数也增加了(表). 青霉素V和氨苄西林对可能存在类似的趋势(表)但尚不清楚结构比较是否有效,因为后者至少部分以两性离子化合物的形式存在。很难令人信服地比较尿苷青霉素组的成员(阿洛西林、美洛西林和哌拉西林),因为6个取代基的亲脂性差异不大。无论如何,亲脂性的影响与早期的结论一致,即β-内酰胺的有效外排需要亲脂性侧链,该结论是通过使用一个粗略且非常间接的MIC变化标准来获得的acrAB公司基因(20)(但请参阅“野生型细胞中的情况大肠杆菌K-12“以下)。
溶质的亲脂性强烈阻碍了通过窄的野生型OmpF和OmpC孔蛋白通道的扩散(22,23,38). 然而,在本研究中很难令人信服地显示这种影响,尽管P(P)苯唑西林的浓度略有下降,从0.634μm/s降至0.565μm/s。这种对溶质亲脂性缺乏敏感性可能是因为我们使用了这种方法来增加V(V)在里面为了提高分析的精确度,一株产生具有更大通道的突变体孔蛋白的菌株(14)不太可能受溶质性质的影响。此外,这些亲脂性分子的一部分可能会扩散到外膜的双层区域。尽管具有强酸性基团的青霉素可能被认为基本上不能渗透到双层中,但这种罕见的质子化物种显然足以在细胞质膜的双层中产生相当快速的质量扩散(7,20).
青霉素类与头孢菌素类外排的比较。
人们怀疑,青霉素类一般可能比头孢菌素类一般更好地作为AcrB泵的底物,因为AcrAB的缺失通常会导致青霉素类的MIC大幅降低(在极端情况下,氯青霉素的MIC是256倍[12,20])而头孢菌素类药物的MIC通常不会发生大的变化(12). 事实上K0.5测试青霉素的值(表)一致约为1μM甚至更低,而头孢菌素的浓度在5至近300μM之间(16),这与青霉素类药物可能与AcrB的结合位点结合更好的假设相一致,因为青霉素核明显比头孢菌素核更亲脂。就V(V)最大值流出值,青霉素的速率在0.4和1 nmol/mg/s之间(表)而头孢菌素类抗生素的耐药率在0.023(硝基头孢)和0.37(头孢曼多)之间,唯一例外的是头孢啶的耐药率为1.8 nmol/mg/s(16). 因此,这些动力学常数似乎表明青霉素确实是AcrB泵的更好底物。
在头孢菌素类药物中,只有硝基头孢没有表现出可检测到的阳性协同作用(16). 当时我们推测,缺乏合作可能与低水平K米(K0.5)此基板的值。然而,这里研究的所有青霉素都更低K0.5值和显示出很强的合作性,因此前面的解释是无效的,目前尚不清楚为什么硝基头孢表现出这种异常的行为。
另一个考虑因素是在相关值为C类第页细胞开始被药物杀死。当我们考虑周质浓度时,C类inh公司(见材料和方法),即当药物存在于中等收入国家的培养基中时,我们通过比较表中的数据可以看到(用于C类inh公司)和表(用于K0.5)前者的青霉素含量远远高于后者。因此,随着临床相关浓度的青霉素,外排系统几乎在全力工作。相比之下,头孢菌素C类inh公司AcrB泵通常低于饱和水平(16).
表3。
青霉素 | C类inh公司(微克/毫升) | 最低抑菌浓度(μg/ml)
|
---|
预测 | 仔细斟酌的 |
---|
双氯西林 | 18.4 (39)一 | 285 | 560 |
氯唑西林 | 4.9 (11) | 147 | 295 |
奥西林 | 4.8 (12) | 135 | 282 |
哌拉西林 | 0.6 (1.2) | 30 | 46 |
阿洛西林 | 0.6 (1.3) | 40 | 44 |
美洛西林 | 0.6 (1.1) | 33 | 30 |
青霉素V | 11.5 (33) | 181 | 178 |
氨苄西林 | 1.0 (2.9) | 26 | 39 |
观察到的流出参数能否正确预测MIC值?
如果获得的常数是正确的,那么根据这些常数加上OXA-7周质水解的流出量,再加上其动力学常数,应该可以精确地平衡药物流入的速率(V(V)在里面)当药物浓度在外部介质中时,穿过外膜(C类o个)达到MIC并产生周质浓度(C类第页=C类inh公司)这只会抑制细胞的生长。我们估计C类inh公司作为HN1159的MIC,其缺乏组成性AcrB外排泵以及OXA-7β-内酰胺酶(表). 然后我们计算了C类o个这将产生如下值C类第页,如材料和方法中所述。的值C类o个或MIC的理论预测值与大多数化合物的实验观察MIC值非常接近(表). 然而,异恶唑基青霉素显示出一些差异,观察到的MIC值大约是预测值的2倍。这种行为的原因尚不清楚。然而,这些化合物具有最亲脂的侧链,事实上,已知它们的分子在水溶液中聚集(31). 虽然聚集需要更高的浓度,在20到30 mM范围内,这是在阴离子羧酸基团之间的斥力最大的蒸馏水中完成的,在我们的Mg2+-含有50 mM缓冲液,这样的排斥作用将被最小化。因此,在使用的MIC范围内(近1 mM),我们不能排除正在发生聚集,从而减少了通过外膜的扩散,并使细菌更具抵抗力。
野生型细胞的情况大肠杆菌K-12。
正如我们早期研究中强调的那样(16),该分析在技术上很难达到要求的精度。因此,我们必须通过引入一些在未修改的细胞中不存在的条件来优化系统大肠杆菌K-12。(i) 为了确保药物的快速水解和快速流出,我们使用了大肠杆菌产生具有扩张通道的OmpC孔蛋白的突变体。该菌株确实对青霉素G、氨苄西林和氯霉素过敏(14); 在平面双层分析中,分离的孔蛋白显示出较高的离子电导(6). 各种青霉素的渗透系数(表)确实比先前测定的野生型K-12细胞高出很多(21). (ii)为了以合理的速度和相对较高的速度生产各种青霉素的水解K米值氧-7基因导入质粒。(iii)AcrB泵的合成得到加强(约为3倍[11])通过灭活acrR公司阻遏基因。因此,尽管流出的动力学参数报告被认为是正确的(除了V(V)e(电子)最大值数值有些夸张),其他参数,如青霉素酶活性和孔蛋白通透性,在我们有意的人工构建中被严重扭曲。因此,表中所示的MIC值与野生型细胞中发生的事情只有非常遥远的关系。
因此,需要检查泵和内源性染色体编码AmpC酶对野生型K-12菌株MIC值的潜在贡献。对于氯唑西林,我们测量了C类inh公司为4.9μg/ml或约10μM。忽略AmpC的水解作用,其在不可检测范围内(1,4),的V(V)e(电子)根据表中所示的参数计算,在该浓度下约为0.3 nmol/mg/s野生型菌株的MICs为512μg/ml(20)或256μg/ml(12). 在512μg/ml时,通过外膜的流入速率估计为0.3 nmol/mg/s,精确地平衡了流出速率,如果P(P)先前测定的青霉素值(0.2×10−5厘米/秒)(21)使用。
相反,对于氨苄青霉素acrB公司突变体为1μg/ml(本研究)放大器C突变体为0.7μg/ml(21). 然而,这些突变体仍然分别含有AmpC酶和AcrB定向外排,因此这些值不能直接作为C类inh公司。我们在此假设C类inh公司为0.7μg/ml或1μM的一半;这与突变体的MIC接近安培C acrBMazzariol等人报告的双突变(0.5μg/ml)(12). 在这种周质浓度下,V(V)e(电子)根据先前报告的参数值,AmpC酶的水解速度也约为0.05 nmol/mg/s(21). 因此,当外部浓度为2.5μg/ml时,通过外膜的扩散速率为P(P)·A类·(C类o个−C类inh公司),等于0.08 nmol/mg/s,通过使用之前确定的值P(P)(9.8 × 10−5厘米/秒)(21),并且它接近水解速率和流出速率的总和。据报道,野生型K-12菌株的MIC为2.5μg/ml(26)或2μg/ml(12),接近上述计算中使用的值。
然而,这一相当粗略的分析给了我们重要的结论。自从十多年前发现其多药外排功能以来,RND泵介导的药物外排动力学参数从未被阐明,直到我们最近对头孢菌素类药物的研究(16)以及本研究。因此,对任何药物外排效率的唯一间接测量是比较野生型菌株和泵缺失突变株的MIC。根据这一标准,异恶唑基青霉素类(如氯唑西林)似乎是AcrB泵的强底物,因为泵的基因缺失使MIC降低了256倍甚至更多(12,20). 相反,像氨苄西林这样的化合物一直被认为是泵的不良底物,因为AcrB缺失只会使MIC降低2倍。然而,外排的定量研究表明,氯青霉素和氨苄西林都是泵的良好基质K0.5值是相同的,并且在V(V)e(电子)最大值值。因此,很明显,中等收入国家的比率甚至不能作为任何特定药物外排效率的粗略指标。那么,如果氨苄西林和氯青霉素都能被AcrB很好地泵出,为什么泵的缺失只会使氯青霉素的MIC发生如此显著的变化?对上述计算结果的仔细研究表明,起作用的主要因素是以青霉素G的渗透为模型的亲脂性异恶唑基青霉素的渗透性较差,尽管另一个因素是AmpC催化的氨苄西林水解作用,而不是氯唑西林。因此,正如早些时候提出的那样(18),使RND多药外排泵如此有效的是与外膜通透性屏障的协同作用。观察结果也证实了这一点,即对于大通道突变体孔蛋白,含有pHSGoxa7的菌株的氯青霉素MIC在缺失acrAB公司基因(结果未显示)。