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蛋白激酶C催化LKB1在丝氨酸428上的磷酸化-ζ二甲双胍增强内皮细胞AMP-活化蛋白激酶激活所必需的
、医学博士、博士，1 ，博士，1 、理学学士、，2 ，博士，2和医学博士1
谢忠林
1俄克拉荷马市俄克拉荷马大学健康科学中心医学系内分泌学和糖尿病科
云州洞
1俄克拉荷马市俄克拉荷马大学健康科学中心医学系内分泌学和糖尿病科
罗兰·舒尔茨
2瑞士苏黎世ETH苏黎世细胞生物学研究所
迪伯特·诺依曼
2瑞士苏黎世ETH苏黎世细胞生物学研究所
邹明辉
1俄克拉荷马市俄克拉何马大学健康科学中心医学系内分泌与糖尿病科
1俄克拉荷马市俄克拉何马大学健康科学中心医学系内分泌与糖尿病科
2瑞士苏黎世ETH苏黎世细胞生物学研究所
通信地址：俄克拉何马大学健康科学中心医学系内分泌与糖尿病科，Ming-Hui Zou，MD，PhD，BSEB 325，941 Stanton L.Young Blvd，Oklahoma City，OK 73104。ude.cshuo@uoz-iuh-gnim公司 - 补充资料
谢补充。
GUID:503D88AD-0D66-45CD-98B4-A1049D0BD6F5
摘要
背景
二甲双胍是最常用的抗糖尿病药物之一，据报道它通过激活AMP-活化蛋白激酶（AMPK）发挥其治疗作用；然而，二甲双胍激活AMPK的机制尚不明确。本研究的目的是确定二甲双胍如何激活内皮细胞中的AMPK。
方法和结果
人脐静脉内皮细胞或牛主动脉内皮细胞暴露于二甲双胍显著增加了AMPK活性和AMPK在Thr172和LKB1在Ser428的磷酸化，这是一种AMPK激酶，与蛋白激酶C（PKC）的激活增加平行-ζ如活性增加、磷酸化（Thr410/40ζ)和PKC的核移位-ζ.PKC的药理或遗传抑制作用始终如一-ζ消融二甲双胍增强了AMPK-Thr172和LKB1-Ser428的磷酸化，表明PKC-ζ可能作为LKB1的上游激酶。此外，腺病毒过度表达LKB1激酶突变体消除了LKB1野生型过度表达，但增强了二甲双胍对牛主动脉内皮细胞AMPK的影响。此外，二甲双胍增加了牛主动脉内皮细胞中LKB1的磷酸化和核向胞浆的输出，以及AMPK与LKB1之间的联系。类似地，LKB1野生型而非LKB1 S428A突变体的过度表达（丝氨酸被丙氨酸取代）恢复了二甲双胍对LKB1缺陷HeLa-S3细胞中AMPK的作用，这表明二甲双胍-增强AMPK激活需要LKB1的Ser428磷酸化。此外，LKB1 S428A与激酶头LKB1 D194A一样，在HeLa-S3细胞中消除了二甲双胍增强的LKB1易位以及LKB1与AMPK的关联。最后，PKC的抑制-ζ废除二甲双胍增强LKB1与AMPK的共免疫沉淀α1和AMPKα2
结论
我们认为PKC-ζ在Ser428磷酸化LKB1，导致LKB1核输出并因此激活AMPK。
关键词：糖尿病、内皮、代谢、分子生物学
二甲双胍是治疗2型糖尿病最广泛使用的抗糖尿病药物之一。在英国前瞻性糖尿病研究中，与使用其他降糖试剂但血糖控制相同的患者相比，二甲双胍显著降低了肥胖2型糖尿病患者的死亡和心血管事件的发生率，1提示二甲双胍可能对糖尿病相关心血管并发症具有独特的保护作用。此外，二甲双胍可以改善糖尿病患者的血管内皮功能。2——7虽然二甲双胍已在临床上使用了几十年，但其确切的作用机制尚未建立。最近的研究8,9证明二甲双胍在体内外激活AMP-activated protein kinase（AMPK）。此外，我们10,11发现二甲双胍在体内培养的内皮细胞和主动脉中激活AMPK的临床相关浓度，并将二甲双胍的血管功能有益作用归因于AMPK激活。此外，二甲双胍激活AMPK是降低肝细胞葡萄糖生成和增加脂肪酸氧化所必需的9以及骨骼肌葡萄糖摄取增加。8
AMPK是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是细胞对低能反应的进化保守调节器。12,13当营养供应有限、ATP生成受损或细胞能量需求增加时，它被激活。13,14AMPK在许多代谢过程中起着关键作用，一旦被激活，AMPK就会磷酸化许多蛋白质，从而导致葡萄糖摄取和代谢增加以及脂肪酸氧化。此外，AMPK同时抑制肝脏脂肪生成、胆固醇合成和葡萄糖生成15并对脂肪酸衍生激素瘦素引起的脂肪酸氧化增加负责16,17和脂联素。18催化剂活化回路中Thr172的磷酸化α亚单位是显著激酶活性的先决条件，AMP/ATP比率的增加进一步刺激变构酶，导致1000倍的活化。
最近，至少有2种上游激酶，LKB1和钙/钙调蛋白依赖性激酶激酶（CaMKK）-β已被鉴定为AMPK激酶。19——24LKB1是一种50-kDa丝氨酸/苏氨酸激酶，最初被鉴定为常染色体显性遗传Peutz-Jeghers癌症综合征中基因突变的产物。25据报道在静息细胞中LKB1主要位于细胞核中，26——28和AMPK一样，LKB1与被称为STRAD和MO25的调节蛋白形成异源三聚体复合物，这是其激活和胞质定位所必需的。29LKB1已被证明在体外和完整细胞中介导AMPK的Thr172磷酸化。19,21,23
二甲双胍激活AMPK的机制仍有争议，尽管早期的研究30,31证明二甲双胍可能通过作为呼吸链复合物I的抑制剂降低细胞能量来激活AMPK。然而，最近的几项研究32,33反对这一观点，因为在这些研究中，二甲双胍激活AMPK而不影响AMP/ATP比率。有趣的是，二甲双胍在无细胞实验中既不激活AMPK，也不影响体外LKB1对AMPK的磷酸化。此外，发现在缺乏LKB1表达的HeLa-S3细胞和A549细胞中，或在LKB1中−/−包括二甲双胍在内的多种激动剂和应激不能激活小鼠胚胎成纤维细胞AMPK。19,23缺乏LKB1表达的小鼠显著抑制了AMPK活性，减缓了电刺激肌肉收缩和AMPK激活化合物5-氨基咪唑-4-甲酰胺1引起的葡萄糖转运增加-β-D-呋喃核糖核苷（AICAR）和二甲双胍。34重要的是，使用肝脏中LKB1缺失的小鼠，据报道二甲双胍需要肝脏中的LKB1来降低血糖。35尽管这些研究已经确定了LKB1在AMPK激活中的关键作用，但这些研究都没有阐明控制LKB1依赖性AMPK激活的上游信号传导。在本研究中，我们发现二甲双胍通过激活PKC激活AMPK-ζSer428的依赖性LKB1磷酸化，该位点是LKB1核输出到胞浆及其与AMPK的关联所必需的。
方法
方法的完整描述，包括PKC蛋白激酶测定等方法-ζ、AMPK和LKB1、LKB1的免疫细胞化学染色以及亚细胞组分的制备都可以在在线数据补充.
细胞培养和治疗
人脐静脉内皮细胞（HUVEC）在补充有低血清生长补充剂的培养基200中培养。使用前将牛主动脉内皮细胞（BAEC）保存在含有2%血清和生长因子的内皮基础培养基中。在它们汇合后，在实验前隔夜去除BAEC血清。HeLa-S3和A549细胞在添加10%血清的F-12K培养基中生长。所有培养基均添加青霉素（100 U/mL）和链霉素（100μg/mL）。腺病毒感染或蛋白激酶抑制剂预处理后，用1mmol/L二甲双胍处理细胞1小时。
质粒转染与腺病毒感染
如前所述，对LKB1进行定点突变。36根据供应商提供的说明，通过DNA测序确认突变，并使用Qiagen EndoFree质粒maxi试剂盒（目录号12362）大规模提取质粒DNA，并使用Invitrogen的Lipofectamine 2000试剂盒（项目号11668-019）转染HeLa-S3。转染后24小时，用二甲双胍（1 mmol/L）或载体处理细胞1小时。以LacZ表达载体和未经处理的细胞作为对照。
BAEC或HUVEC感染了表达野生型PKC的腺病毒-ζ（PKC-ζ-WT）或显性阴性突变PKC-ζ（PKC-ζ-DN）。使用表达绿色荧光蛋白（ad-GFP）的复制缺陷腺病毒载体作为对照。AMPK-DN腺病毒载体由AMPK构建-α2携带突变，将赖氨酸45转化为精氨酸（K45R），如前所述。10,11细胞在无血清培养基中以100倍的感染率感染腺病毒过夜。然后，在实验之前，将细胞清洗并在无血清的新鲜培养基中培养18至24小时。在这些条件下，GFP表达决定的感染效率通常大于75%。
统计分析
数值表示为平均值±SE。所有数据均采用单因素方差分析，然后进行Bonferroni事后分析，但时间进程中获得的数据除外，这些数据均采用重复测量方差分析。A类P（P）<0.05的值被认为具有统计学意义。
作者可以完全访问数据，并对数据的完整性承担全部责任。所有作者均已阅读并同意原稿。
结果
二甲双胍诱导AMPK和乙酰辅酶A羧化酶磷酸化
因为AMPK激活需要Thr172在α1和α2个亚基，37,38通过使用特定抗体监测Thr172的AMPK及其最具特征的下游激酶乙酰辅酶A羧化酶（ACC）在Ser79的磷酸化，在Western blots中测定AMPK活性。AMPK活性测定为32P掺入SAMS（HMRSAMSGLHLVKRR）肽中。汇合的HUVEC和BAEC用二甲双胍（1 mmol/L）处理1小时。如所示二甲双胍分别显著增加HUVEC和BAEC中Ser79的AMPK-Tr172和ACC的检测。因为二甲双胍在BAEC和HUVEC中激活AMPK的效力相似，所以我们在BAEC中进行了大多数实验。
PKC的抑制-ζ减弱二甲双胍增强的AMPK活性。汇合的BAEC或HUVEC，无论是否感染腺病毒，均与PKC预孵育-ζ-暴露于二甲双胍前，PS 30分钟。处理后，对细胞进行裂解和提取。如方法中所述，磷酸化AMPK-Tr172和ACC-Ser79均通过使用特定抗体在蛋白质印迹中检测到。A、 二甲双胍（Met）激活BAEC和HUVEC中的AMPK。该印迹是从6个单独实验中获得的6个印迹的代表。Con表示控制。B和C，选择性抑制PKC-ζ二甲双胍减弱增强AMPK活性（n=6）。♣P（P）<0.05（对照组[Con]与二甲双胍治疗组），†P（P）<0.05（二甲双胍vs二甲双胍加PKC-ζ-PS）。D、 PKC公司-ζ-PS剂量依赖性地抑制BAEC中二甲双胍增强的AMPK活性（n=5）。♣P（P）<0.05（对照组vs二甲双胍），†P（P）<0.05（二甲双胍vs二甲双胍加PKC-ζ-PS）。E和F，PKC的遗传抑制-ζ带PKC-ζ-DN，而不是编码GFP的腺病毒-rus，减弱了二甲双胍增强的BAEC中AMPK-Tr172和ACC-Ser79的磷酸化。该斑点代表了5个单独实验中的5个斑点（n=5）。♣P（P）<0.05（与对照组相比），†P（P）<0.05（二甲双胍治疗组与二甲双胍加腺病毒组）。G、 AMPK活性按方法（n=4）所述进行测定。♣P（P）<0.05（与对照组相比），†P（P）<0.05（二甲双胍治疗组与二甲双胍加腺病毒组）。
PKC的抑制-ζ减弱二甲双胍增强的AMPK-Thr172磷酸化
我们之前已经证明PKC的抑制作用-ζ衰减ONOO−-增强BAEC中AMPK的活化。36建立PKC-ζ作为二甲双胍诱导AMPK激活的介质，我们首先确定PKC是否-ζ–特异性假底物肽（PKC-ζ-PS），一种选择性抑制PKC的合成肽-ζ在不影响其他PKC亚型的情况下，改变二甲双胍对AMPK-Thr172和ACC-Ser79磷酸化的影响。如所示、PKC-ζ-PS显著消融二甲双胍增强AMPK-Thr172的磷酸化（n=5；P（P）<0.01) ()和ACC-Ser79(). PKC的抑制作用-ζ-通过抑制AMPK活性也证实了PS。如所示、PKC-ζ-PS剂量依赖性抑制二甲双胍增强AMPK活性()，由SAMS肽分析。
PKC的其他证据-ζ依赖性AMPK激活是通过PKC的基因抑制获得的-ζ。如所示GFP、PKC的腺病毒过度表达-ζ-DN或PKC-ζ-WT没有改变BAEC中AMPK的基础水平。然而，PKC的过度表达-ζ-DN（而非GFP）消除了二甲双胍对AMPK和ACC的影响，而PKC过度表达-ζ-WT显著增强二甲双胍增强AMPK-Thr172和ACC-Ser79的磷酸化()和AMPK活性().
激活PKC-ζ二甲双胍
接下来我们确定二甲双胍是否激活PKC-ζ在BAEC。PKC的磷酸化-ζThr410/403通过上游激酶如磷脂酰肌醇3-激酶（PI-3激酶）/PDK-1轴和PKC移位-ζ从胞浆到胞质膜被认为是PKC激活的关键步骤-ζ因此，PKC-ζ用特异性抗体监测Western blots中总细胞裂解物的磷酸化。如所示，二甲双胍增加PKC-ζ不改变PKC的Thr410/403磷酸化-ζ表达式。PKC的抑制-ζ带PKC-ζ-PS可消除二甲双胍诱导的PKC-ζ磷酸化()，表明PKC的特异性抑制-ζ-PS。
二甲双胍增加PKC-ζ磷酸化与PKC转位-ζ从胞浆到膜。汇合BAEC暴露于二甲双胍（1 mmol/L，1小时），PKC移位-ζ和PKC-ζ磷酸化按方法所述进行测定。A、 二甲双胍（Met）增加PKC的磷酸化-ζ在BAEC。该印迹是从3个独立实验中获得的3个印迹的代表。Con表示控制。B、 PKC公司-ζ按照方法（n=4）所述测定活性。♣P（P）<0.05（与对照组相比[Con]），†P（P）<0.05（二甲双胍治疗组与二甲双胍加腺病毒组）#P（P）<0.05（PKC-ζ-WT与二甲双胍加WT腺病毒）。C和D，二甲双胍增加PKC的易位-ζ到膜（n=5）。♣P（P）<0.05（对照组与二甲双胍治疗组）。E和F，二甲双胍增加PKC的易位-ζ从细胞溶质进入细胞核。该印迹是来自3个单独实验的3个印迹的代表（n=5）。ŞP（P）<0.05（对照组与二甲双胍治疗组）。G、 亚细胞组分纯度分析。按照方法中所述制备亚细胞级分。用特异性抗体通过Western blot检测标记酶。
接下来我们检测了PKC-ζ活动，使用32P并入PKC-ζ–特定肽。如预期，PKC过度表达-ζ-DN，但不是GFP，减弱PKC-ζ活性，而PKC过度表达-ζ-WT增加PKC-ζBAEC活动(). 与增加的PKC一致-ζThr410/403处的磷酸化()二甲双胍显著增加PKC-ζ感染GFP的BAEC或BAEC中的活性。PKC过度表达-ζ-DN废除二甲双胍增强PKC-ζ激活，而PKC-ζ-WT增加PKC-ζ活动(). 这些结果表明二甲双胍激活PKC-ζ.
PKC的易位-ζ被认为是PKC的关键步骤-ζ激活。BAEC暴露于二甲双胍显著增加PKC的存在-ζ膜组分中PKC的含量降低-ζ在细胞溶质中(). 同时，二甲双胍也增加了PKC的易位-ζ从细胞溶质进入细胞核(). 这些亚细胞组分的纯度通过使用针对特定蛋白标记酶的抗体进行确认39,40分别为胞浆（乳酸脱氢酶）、质膜（碱性磷酸酶）或细胞核（组蛋白H2AX）。核组蛋白H2AX仅在核组分中检测到，而在细胞溶质或膜组分中未检测到(). 乳酸脱氢酶仅在胞质部分检测到，而碱性磷酸酶仅在膜部分检测到(). 因此，二甲双胍导致PKC的细胞重新分布-ζ从细胞质到细胞核和膜。
蛋白激酶A和p90核糖体S6激酶在二甲双胍增强的AMPK激活中不需要
由于蛋白激酶A（PKA）和p90核糖体S6激酶（RSK）都被报道在Ser428磷酸化LKB1，因此我们接下来确定PKA或RSK是否参与二甲双胍增强的AMPK-Tr172或LKB1-Ser428的磷酸化。如所示，给药H89（10μmol/L），选择性PKA抑制剂或SL0101（10μ选择性RSK抑制剂mol/L）没有改变二甲双胍增强的AMPK-Tr172或LKB1-Ser428磷酸化(). 与PKC增加相比-ζ磷酸化，二甲双胍既不影响Thr197的PKA催化亚基（PKAc）磷酸化，也不影响Thr356/Ser360的RSK3磷酸化()提示二甲双胍对PKA或RSK无影响。进一步证据来自联合免疫沉淀实验。如所示，LKB1与PKC共免疫沉淀ζ此外，二甲双胍显著增加了LKB1与PKC的联合免疫沉淀-ζ()对PKC敏感-ζ抑制()，表明PKC-ζPKC协会需要开展活动-ζ使用LKB1。事实上，PKC的改变-ζPKC过表达引起的活性-ζ-DN或PKC-ζ-WT没有改变PKAc或RSK的磷酸化()表明PKC的作用-ζ在BAEC中独立于PKA或RSK。总之，这些结果表明二甲双胍增强LKB1和AMPK的磷酸化是PKC-ζ依赖但独立于PKA或RSK。
PKA和RSK均不参与二甲双胍增强BAEC中AMPK的激活。A和B，汇合BAEC用蛋白激酶抑制剂预处理30分钟，然后用二甲双胍（1 mmol/L）处理1小时，裂解细胞，Western blot检测AMPK和LKB1的磷酸化。该斑点是来自3个不同实验的斑点的代表。♣P（P）与相应对照组（Con）相比<0.05。C、 用二甲双胍（Met）（1 mmol/L）处理BAEC 1小时，制备细胞裂解物，PKC磷酸化-ζ使用特异性抗体通过Western blot检测PKAc和RSK3。该印迹是从3个单独实验中获得的3个印迹的代表。D、 LKB1免疫沉淀，PKC-ζWestern blotting检测到PKAc和RSK3。该斑点代表了3个不同实验的斑点。E、 用PKC转染融合的BAEC-ζ-DN和PKC-ζ-WT腺病毒治疗48小时，二甲双胍治疗1小时。裂解细胞并通过蛋白质印迹进行分析。该印迹是从3个单独实验中获得的3个印迹的代表。
二甲双胍增强的AMPK激活需要LKB1
至少2种上游激酶，包括LKB1和CaMKK-β已被鉴定为AMPK激酶。19——24接下来我们确定二甲双胍是否需要LKB1激活BAEC中的AMPK。如所示，激酶头LKB1突变体LKB1-D194A的过度表达消除了二甲双胍增强的BAEC中AMPK-Thr172和ACC-Ser79的磷酸化。相反，LKB1-WT的过度表达增强了二甲双胍对AMPK和ACC磷酸化的影响。由于GFP的过度表达并没有改变二甲双胍的作用，这些结果表明，LKB1是二甲双胍-增强内皮细胞AMPK活化所必需的。
PKC公司-ζ丝氨酸428处LKB1的依赖性LKB1磷酸化。A和B，二甲双胍激活的AMPK在BAEC中依赖LKB1。激酶头LKB1突变体的腺病毒过度表达阻断二甲双胍诱导的AMPK激活，而LKB1 WT过度表达增强了LKB1在BAEC中的作用。该印迹是来自5个独立实验的5个印迹的代表。C和D，二甲双胍增强的丝氨酸428的LKB1磷酸化是PKC-ζ依赖。该印迹是来自5个独立实验的5个印迹的代表（n=5）。♣P（P）<0.05（对照组[Con]vs二甲双胍），†P（P）<0.05（二甲双胍vs二甲双胍加PKC-ζ腺病毒）。E、 LKB1活性按照方法（n＝4）中所述进行测量。F和G，PKC的时间进程-ζ、LKB1和AMPK磷酸化。用二甲双胍（1 mmol/L）处理BAEC，PKC磷酸化-ζWestern blot分析在指定时间检测LKB1和AMPK。该斑点是来自3个单独实验的3个斑点的代表*♣†P（P）与相应对照组相比，<0.05。
二甲双胍增强的LKB1-Ser428磷酸化是PKC-ζ受抚养人
我们之前已经证明了ONOO−通过PKC增强Ser428处LKB1的磷酸化-ζ.36接下来，我们确定二甲双胍是否改变了Ser428的LKB1磷酸化。如所示二甲双胍显著增加了Ser428处LKB1的磷酸化。蛋白激酶C过度表达-ζ-DN，其消融二甲双胍增强AMPK激活()，废除了二甲双胍增强的LKB1-Ser428磷酸化(). 相反，GFP或PKC的过度表达-ζ-WT没有抑制二甲双胍增强的LKB1-Ser428磷酸化(). 然而，PKC过度表达导致PKC活性的改变-ζ-DN或PKC-ζ-WT未改变LKB1活性(). 此外，与我们之前的结果一致，34,36,41,42二甲双胍不会改变感染PKC的细胞中LKB1的活性-ζ-DN或PKC-ζ-重量(). 因此，AMPK-Tr172磷酸化的变化不能归因于LKB1激酶活性的改变。
二甲双胍增强PKC-ζ磷酸化发生在LKB1和AMPK磷酸化之前
接下来我们确定了二甲双胍增强PKC磷酸化的时间进程-ζ、LKB1和AMPK。如所示二甲双胍显著增加PKC-ζ1分钟内磷酸化。二甲双胍治疗后约10分钟，LKB1-Ser428的磷酸化显著升高，而AMPK-Tr172磷酸化在30分钟时显著增加，在60分钟时达到峰值(). 这些数据表明，二甲双胍首先快速激活PKC（Thr410/403），然后激活LKB1（Ser428），最后激活AMPK（Thr172）。
二甲双胍触发LKB1从细胞核向细胞质的转运
前期工作27,43——45表明LKB1主要定位于细胞核，而AMPK主要定位于细胞质。LKB1必须从细胞核输出到AMPK所在的细胞质中。我们首先使用免疫组织化学染色来检测二甲双胍是否改变了LKB1在HUVEC中的亚细胞定位，因为所有市售的抗LKB1抗体都不能用于BAEC。正如预期的那样，LKB1主要存在于非刺激性HUVEC的细胞核中(). 在二甲双胍处理的HUVEC中，LKB1主要在胞浆中检测到。亚细胞组分中LKB1的Western blot分析进一步证实了二甲双胍增强LKB1核输出。如所示二甲双胍显著增加了细胞液中LKB1的蛋白量，而HUVEC细胞核中LKB1的蛋白量显著减少(). 同样，LKB1主要位于BAEC的核组分中。暴露于二甲双胍的BAEC降低了核部分中LKB1的数量，而增加了胞浆中LKB1的数量（数据未显示）。有趣的是，二甲双胍处理的BAEC细胞液和细胞核中与LKB1-Ser428磷酸化相关的信号均显著增加，而二甲双胍的处理后细胞核LKB1蛋白含量降低()对应于相对较高的LKB1-Ser428信号(). 这些数据表明，LKB1磷酸化可能发生在细胞核中，导致LKB1从细胞核位置易位到细胞质位置。
二甲双胍增加了LKB1从细胞核到HUVEC胞浆的转运。A、 二甲双胍引起的HUVEC中LKB1从细胞核向胞浆移位的免疫细胞化学染色。B和C，二甲双胍（Met）也会增加胞浆中LKB1的数量，而降低HUVEC细胞核中LKB1。该印迹是从5个独立实验中获得的5个印迹的代表。Con表示控制。D和E，二甲双胍增加细胞核和细胞质中LKB1的丝氨酸428磷酸化。该印迹是从3个独立实验中获得的3个印迹的代表。
用丙氨酸突变LKB1丝氨酸428防止二甲双胍增强的LKB1移位
接下来我们确定二甲双胍是如何增加LKB1易位的。利用定点突变技术，将LKB1的Ser428突变为丙氨酸（LKB1-S428A，功能丧失）。此外，对LKB1活性至关重要的LKB1的Asp194也被丙氨酸取代，从而产生了激酶缺失的LKB1-D194A突变体。将这些质粒转染到LKB1缺陷的A549细胞中。转染后，用小鼠抗His Tag抗体检测LKB1的亚细胞分布。正如预期的那样，转染Lac-Z的A549与抗His Tag抗体没有反应（数据未显示）。与HUVEC中的LKB1一样，LKB1主要存在于转染LKB1 WT、S428A突变体或D194A突变体的A549细胞核中(). 二甲双胍显著增加了转染LKB1-WT的A549细胞液中的LKB1染色，但在转染LKB 1-D194A或LKB 1-S428A突变体的A549中没有(). 亚细胞组分中LKB1的Western blot分析证实，LKB1-WT或LKB1突变体均为核蛋白，二甲双胍显著增加了转染LKB1-WT的A549细胞中的细胞溶质LKB1数量，但未增加LKB1突变(). 这些结果表明，二甲双胍增强核输出需要LKB1的Ser428磷酸化和LKB1活性。
二甲双胍增强LKB1易位和AMPK活化需要LKB1-Ser428的磷酸化。A、 二甲双胍（Met）免疫细胞化学染色增强A549细胞LKB1易位。按照方法中的描述，用指定的质粒转染细胞。使用小鼠抗His Tag抗体检测LKB1。由于转染Lac-Z的A549细胞与抗体没有反应，因此省略了Lac-Z图像。Con表示控制。B、 A549细胞LKB1的Western blot检测。该印迹是来自5个独立实验的5个印迹的代表（n=5）。♣P（P）<0.05（WT vs WT加二甲双胍），†P（P）<0.05（WT加二甲双胍vs WT或S428A加二甲双双胍）。
Ser428突变为丙氨酸消除二甲双胍增强的AMPK激活
由于LKB1-Ser428突变改变了其亚细胞定位，我们接下来确定LKB1的Ser428突变是否也改变了二甲双胍增强的AMPK激活。如所示，二甲双胍在用LacZ或LKB1的D194A突变体转染的HeLa-S3或HeLa-S3中均未激活AMPK，证实了LKB1在二甲双胍增强AMPK激活中的重要作用。相反，转染LKB1-WT显著增加转染WT LKB1的HeLa-S3细胞中AMPK和ACC的磷酸化(). 有趣的是，LKB1-Ser428点突变为丙氨酸，就像激酶活性突变D194A一样，消除了二甲双胍增强的AMPK磷酸化。类似地，LKB1-S428A和LKB1-D194A突变体的过表达消融了过氧亚硝酸盐（ONOO−, 100μmol/L）-增强了AMPK的磷酸化，而Ser428突变为天冬氨酸（LKB1-S428D），模拟了Ser428磷酸化，与LKB1-WT一样，AMPK磷酸化增加().
二甲双胍增强的AMPK激活和LKB1与AMPK的共免疫沉淀需要LKB1的Ser428磷酸化。A和B，二甲双胍在HeLa-S3过度表达LKB1-WT而非LKB1-Ser428A突变体中激活AMPK。HeLa-S3细胞转染LKB1-WT或激酶缺失型LKB1突变体或LKB1-Ser428A突变体后，暴露于二甲双胍（1 mmol/L，1小时）。使用特异性抗体在Western blots中监测AMPK激活。该印迹是来自5个独立实验的5个印迹的代表。C、 ONOO需要LKB1的Ser428磷酸化−-增强AMPK激活。在转染LKB1-WT或LKB1-Ser428A（Ser428突变为丙氨酸，功能丧失）或LKB1-Ser428D（Ser428被天冬氨酸取代，磷酸化模拟）后，HeLa-S3细胞暴露于ONOO−(100μ摩尔/升）。使用特异性抗体通过Western blotting监测AMPK激活。该印迹是来自5个独立实验的5个印迹的代表。D、 LKB1 WT或LKB1-Ser431A突变体中的LKB1活性。E、 二甲双胍增加LKB1和AMPK的结合。从BAEC中免疫沉淀LKB1，在Western blot中检测到AMPK。PKC的抑制-ζ减毒二甲双胍增强LKB1与AMPK的相关性。该印迹是来自5个独立实验的5个印迹的代表。F、 LKB1的Ser428突变为丙氨酸（S428A）消除了二甲双胍增强的LKB1与AMPK的共免疫沉淀。二甲双胍增加了LKB1与LKB1 WT的共免疫沉淀，但不增加LKB1突变体的共免疫沉积。该斑点是来自3个单独实验的3个斑点的代表。
接下来，我们用Ser428（小鼠中的Ser431）检测突变LKB1的活性，与WT LKB1相比，使用人工肽底物改变为丙氨酸。如所示与LKB1 WT相比，LKB1-Ser431A突变体的LKB1活性降低了10%。
接下来，我们确定LKB1-Ser428磷酸化是否增加了LKB1活性。小鼠LKB1-WT或LKB1-S431A（相当于人类428）突变体与MO25共表达α和STRADα部分纯化的LKB1 WT或LKB1-S431A复合物与重组PKC共培养-ζ.PKC-ζ使用LKB1tide或p53检测依赖性LKB1磷酸化和LKB1活性。PKC公司-ζ增加32磷在LKB1 WT中的掺入与LKB1活性增加10%平行，但对LKB1-S431A突变体的影响较小。仅LKB1，而非STRADα或MO25α，被PKC磷酸化-ζ由确定32P放射自显影凝胶当PKC-ζ与LKB1-MO25孵育α-斯特拉德α体外复合物（数据未显示）。因为LKB1 S431A突变体表达了10%的LKB1活性降低，而PKC-ζ导致LKB1活性增加10%，这些结果表明Ser428/431的LKB1磷酸化可能使LKB1的活性增加10%。然而，如此微小的LKB1活性增加仅能部分解释二甲双胍治疗后AMPK活性强烈升高的原因，因此强调了LKB1核质重分布的重要性，这有望增加细胞液中AMPK的活化。
Ser428突变为丙氨酸消除二甲双胍增强的LKB1与AMPK的关联
我们之前已经展示了ONOO−通过增加LKB1和AMPK的关联来激活AMPK。36此外，我们发现PKC-ζ联合免疫沉淀LKB1和二甲双胍增加LKB1与PKC的相关性-ζ我们接下来确定PKC是否对LKB1-Ser428进行磷酸化-ζ有助于二甲双胍增强AMPK与LKB1的相关性，因此LKB1是否从BAEC中免疫沉淀并在Western blot中用AMPK染色。如所示二甲双胍显著增加了LKB1与AMPK的联合免疫沉淀α1或AMPKα2.重要的是，PKC的抑制-ζ钝化二甲双胍增强LKB1与AMPK的相关性()，表明PKC-ζ增强LKB1与AMPK的关联。
接下来，我们研究了LKB1-Ser428突变为丙氨酸是否改变了HeLa-S3细胞中AMPK和LKB1的相互作用。二甲双胍在用LKB1 WT转染的HeLa-S3细胞中增加AMPK和LKB1的结合，但在用LacZ或LKB1突变体转染的HeLa-S3细胞中不增加()这意味着二甲双胍增强的AMPK激活需要LKB1-Ser428磷酸化。
讨论
在本研究中，我们通过非典型PKC确定了LKB1-Ser428磷酸化-ζ在二甲双胍增强AMPK激活中起重要作用。LKB1-Ser428磷酸化是LKB1核输出到胞浆所必需的，在胞浆中，LKB1与STRAD和MO25形成活性复合物，随后发生AMPK磷酸化。由于各种刺激增加了Ser428处LKB1的磷酸化，因此很容易推测LKB1-Ser428磷酸化可能是AMPK激活所需的常见途径。
LKB1的定位取决于其激酶活性、进入细胞核以及在细胞质内的滞留。27,29据报道，LKB1的细胞质定位对其正常功能至关重要。27,29一些残基，包括LKB1的Ser31、Thr336、Thr366和Ser428，已被鉴定为磷酸化位点，尽管它们的生理功能基本未知。在本研究中，我们提供了证据表明，二甲双胍通过在Ser428磷酸化LKB1诱导AMPK激活，导致LKB1从细胞核转移到胞浆，并增加LKB1与AMPK的关联。主要发现如下：二甲双胍增加了Ser428的LKB1磷酸化，诱导LKB1从细胞核向细胞质移位，并增强了LKB1与AMPK的共免疫沉淀。Ser428突变为丙氨酸可阻止LKB1从细胞核转移到细胞质，并消除二甲双胍增强的LKB1与AMPK的结合，从而消除AMPK激活。LKB1-S428A突变不影响LKB1的正常核定位，但阻止了二甲双胍处理后LKB1向细胞质的移位，这表明Ser428的磷酸化可能是LKB1从细胞核向细胞质移位的必要条件。因此，位于LKB1 C末端的Ser428磷酸化可能在调节AMPK激活中发挥关键作用。Forcet等人46证明C末端突变损害LKB1介导的AMPK激活和下游信号，但不影响LKB1自身激酶活性或消除LKB1诱导的生长停滞。我们的数据表明，LKB1的Ser428突变为丙氨酸，损害了其从细胞核输出的能力，以及二甲双胍治疗后与AMPK的相关性()，这表明Ser428的磷酸化可能有助于其与AMPK的结合，并且该位点突变为丙氨酸会解除这一过程，从而导致酶底物识别降低。这些结果与之前的报告相反，Ser431突变为丙氨酸以消除磷酸化，或突变为谷氨酸以模拟磷酸化，均未显著影响LKB1在体外的细胞定位或催化活性。47差异的原因尚不清楚，可能与物种差异（人类与小鼠）或细胞类型有关。在体内，LKB1与两种蛋白质STRAD和MO25形成异源三聚体复合物。29,48STRAD是一种LKB1专用适配器和基板；当与LKB1的激酶结构域结合时，STRAD增强LKB1活性>100倍，并将LKB1锚定在胞浆中。MO25稳定了STRAD与LKB1的结合，并与STRAD合作将LKB1定位在细胞的细胞质中。49此外，LKB1还可以通过与细胞溶质蛋白LIP1（LKB1相互作用蛋白-1）的相互作用定位在细胞的细胞质中。50据报道，在肌肉特异性LKB1基因敲除小鼠中，AICAR、二甲双胍或肌肉收缩并没有增加AMPKα2活性，表明LKB1是AMPK的主要上游激酶。34然而，这3种处理未能增加LKB1活性。41在我们的研究中，我们发现二甲双胍增加了AMPK的磷酸化和活性。虽然二甲双胍没有在很大程度上改变LKB1活性，但显著增强了Ser428的LKB1磷酸化；Ser428突变为丙氨酸阻止了LKB1从细胞核向细胞质的移位，并消除了二甲双胍增强的AMPK与LKB1的结合，从而消除了AMPK的激活。这些结果表明，Ser428的LKB1磷酸化通过改变其细胞位置或使其与调节蛋白或蛋白底物相互作用，在AMPK激活中起着关键作用。此外，LKB1的活性形式可能与Ser428磷酸化一样重要，因为LKB1 D194突变为丙氨酸阻止了酶的移位。因为LKB1 S431A突变体表达了10%的LKB1活性降低，而PKC-ζ导致LKB1活性增加10%，二甲双胍增强AMPK活性可能是通过核质再分配，而不是通过LKB1-Ser428磷酸化导致LKB1-活性增加。此外，LKB1易位是否需要其他位点尚待确定。
我们之前已经报告过10,11,51,52二甲双胍或ONOO激活PI-3激酶−可能通过增加LKB1与AMPK的结合来增强AMPK活性。事实上，药物抑制或显性阴性突变体对c-Src或PI-3激酶活性的抑制消除了二甲双胍或ONOO−-增强内皮细胞AMPK激活。10,11,53,54在本研究中，我们通过证明PKC不仅证实而且扩展了这些观察结果-ζ是PI-3激酶AGC家族的成员，在二甲双胍诱导的AMPK激活中起关键作用。事实上，一些AMPK激动剂，如AICAR和二硝基苯酚，可以增加PKC-ζ游离趾长伸肌和L6肌管的活性。55在2型糖尿病患者中，二甲双胍增加PKC-ζAMPK活性增加。56我们还证明了PKC-ζ在体外检测和培养细胞（包括内皮细胞、周细胞、脂肪细胞和培养的血管平滑肌细胞）中磷酸化Ser428的LKB1。36此外，PKC的抑制-ζ通过其他刺激减弱AMPK的激活（Z.X.，未发表的数据，2008年）。由于其他激酶，包括cAMP依赖性PKA和p90 RSK，被报道在Ser428磷酸化LKB1，LKB1的Ser428磷酸化可能是由c-Src/PI-3激酶轴以外的信号通路触发的AMPK激活的常见途径().
二甲双胍增强AMPK激活需要LKB1核输出。在静息状态下，LKB1主要位于细胞核中，而LKB1的活性需要连接蛋白MO25和STRAD以及AMPK-α1（内皮细胞中AMPK催化单位的主要亚型）位于胞浆中。二甲双胍（或ONOO−)激活PI-3激酶，导致PDK-1/2磷酸化。PDK-1/2磷酸化PKC-ζ导致后者移位到细胞核和细胞质膜。在细胞核中，激活了PKC-ζ在丝氨酸428和可能的其他位点磷酸化LKB1。磷酸化的LKB1通过一种未知机制从细胞核输出到胞浆。LKB1随后与先前存在的适配器蛋白（STRAD和MO25）结合，后者在Thr172处招募和磷酸化AMPK。AMPK也可能被其他刺激物激活，这些刺激物要么激活PKC-ζ或增加LKB1-Ser428磷酸化（PKA或RSK90）。总之，我们的结果表明PI-3激酶-PDK1/2-PKC-ζ该通路在二甲双胍增强AMPK激活中起着关键作用。
总之，我们提供证据证明PKC-ζ在调节AMPK活性中起关键作用。我们的数据表明，二甲双胍诱导的AMPK激活需要LKB1，并证明LKB1的Ser428磷酸化可能影响LKB1在细胞中的位置及其与AMPK的相互作用。我们认为PKC-ζ可以通过增加LKB1磷酸化来调节AMPK活性，从而导致LKB1核输出，进而通过LKB1实现AMPK Thr172磷酸化。此外，LKB1的Ser428磷酸化可能是信号通路（包括PI-3激酶/PKC）触发的AMPK激活的常见途径-ζ轴、PKA和RSK。
临床展望
二甲双胍是治疗II型糖尿病最常用的药物之一。与传统使用的降血糖试剂（如磺脲类或胰岛素）不同，二甲双胍可改善心血管功能并降低糖尿病患者的心血管风险。我们和其他人的早期研究发现，临床相关浓度的二甲双胍激活了AMP-活化蛋白激酶（AMPK）；这些研究将二甲双胍对血管功能的有益作用归因于AMPK的激活。本研究旨在阐明二甲双胍激活AMPK的机制。培养的内皮细胞暴露于二甲双胍后，Thr172处的AMPK和Ser428处的LKB1磷酸化显著增加，这是一种AMPK激酶，与蛋白激酶C（PKC）活化增加平行-ζPKC活性、磷酸化和核移位的增加证明了这一点-ζ.PKC的药理或遗传抑制作用始终如一-ζ消融二甲双胍增强了Thr172的AMPK和Ser428的LKB1的磷酸化。我们的数据表明PKC对LKB1的Ser428磷酸化-ζ二甲双胍触发的AMPK激活需要。
致谢
资金来源
这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款（HL079584、HL080499、HL074399）、美国糖尿病协会研究奖、青少年糖尿病研究基金会研究奖、俄克拉荷马科技进步中心拨款以及Paul H。多丽丝·伊顿·特拉维斯（Doris Eaton Travis）是俄克拉荷马大学健康科学中心内分泌科的主席（全部由邹博士担任）。部分工作还得到了美国国立卫生研究院1P20RR024215-01（谢博士和邹博士）和美国心脏协会科学家发展基金（谢博士）的支持。Helmut Horten基金会（给Neumann博士）和欧盟FP6合同LSHM-CT-2004-005272（EXGENESIS）进一步支持了这项工作。
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