MiR-15a and MiR-16 control Bmi-1 expression in ovarian cancer

Resham Bhattacharya; Milena Nicoloso; Rochelle Arvizo; Enfeng Wang; Angelica Cortez; Simona Rossi; George A Calin; Priyabrata Mukherjee

doi:10.1158/0008-5472.CAN-09-2552

癌症研究。作者手稿；PMC 2010年12月1日提供。

以最终编辑形式发布为：

癌症研究，2009年12月1日；69(23): 9090–9095.

2009年11月10日在线发布。 doi（操作界面）：10.1158/0008-5472.CAN-09-2552

预防性维修识别码：项目经理2859686

NIHMSID公司：美国国立卫生研究院193965

PMID：19903841

MiR-15a和MiR-16控制卵巢癌中Bmi-1的表达

Resham Bhattacharya公司,^1,^* 米莲娜·尼科洛索,² 罗谢尔·阿尔维佐,¹ 王恩峰,¹ 安吉利卡·科尔特斯,² 西蒙娜·罗西,² 乔治·A·卡林,²和普里雅布拉塔·穆克吉^1,⁴

作者信息版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料: 1
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摘要

Bmi-1的癌基因激活存在于包括卵巢癌在内的多种上皮性恶性肿瘤中，但Bmi-1过度表达的具体机制尚未确定。因此，认识到Bmi-1在癌症中的巨大病理意义，我们想研究微RNA畸变是否在卵巢癌中Bmi-1的调节中发挥作用。在本报告中，我们发现两种小RNA，miR-15a和miR-16，在卵巢细胞系和初级卵巢组织中表达不足。我们证明，这些miRNAs直接靶向Bmi-1 3’UTR，并与卵巢癌患者和细胞系中的Bmi-1蛋白水平显著相关。此外，Bmi-1蛋白水平因miR-15a或miR-16表达而下调，导致卵巢癌细胞增殖和克隆生长显著降低。这些发现表明，通过恢复卵巢癌和其他涉及Bmi-1上调的癌症中miR-15a和miR-16的表达，可以制定治疗策略。

关键词：微RNA、卵巢癌、Bmi-1、克隆生长、增殖

介绍

卵巢癌的特点是对细胞毒性化疗的初始反应，随后经常出现复发和疾病进展，这是癌症控制的主要科学和临床障碍(1). 卵巢癌早期症状很少，因此大多数患者被诊断为晚期疾病，5年生存率仅为20%至25%(2,三). 在这种情况下，需要开发新的治疗策略来对抗卵巢癌。

Bmi-1（B淋巴瘤小鼠Moloney白血病病毒插入区）在调节正常干细胞和祖细胞的增殖活性中起着关键作用(4). 它对神经的自我更新也是不可或缺的(5)和造血干细胞(6). 据报道，Bmi-1在人类非小细胞肺癌中过度表达(7)，乳腺癌(8)，前列腺癌(9)最近在卵巢癌(10). 卵巢癌组织表达高水平的Bmi-1，并且表达与疾病的组织学分级和临床分期相关。Bmi-1的过度表达也会导致淋巴细胞的肿瘤转化(11,12).这表明Bmi-1激活在上皮性恶性肿瘤中具有致癌作用。

微RNA（miRNAs）是21–23个核苷酸调控RNA，通过靶向信使RNA并触发翻译抑制或RNA降解来控制基因表达。哺乳动物的miRNAs有潜力调节至少20-30%的人类基因(13). 新的证据表明，microRNA的调节改变与许多癌症的发病机制有关(14). 许多研究报告了不同癌症类型中差异调节的miRNAs(13,15——21)包括卵巢癌(18,22,23). 总的来说，这些研究表明，一些人类microRNA在人类癌症中持续被解除调控，表明这些基因在肿瘤发生中起作用。某些microRNA的特异性过表达或过表达与特定肿瘤类型相关(24). 因此，认识到Bmi-1在癌症中的巨大病理意义，我们想研究microRNAs是否在卵巢癌Bmi-1的调节中发挥任何作用。

在本报告中，我们发现两种小RNA，miR-15a和miR-16，在卵巢细胞系和初级卵巢组织中表达不足。我们证明，这些miRNAs直接靶向3'UTR，并与卵巢癌患者和细胞系中的Bmi-1蛋白水平显著相关。此外，Bmi-1蛋白水平下调是对miR-15a或miR-16表达的反应，并导致卵巢癌细胞增殖和克隆生长显著降低。这些发现表明，通过恢复卵巢癌和其他涉及Bmi-1上调的癌症中miR-15a和miR-16的表达，可以制定治疗策略。

材料和方法

试剂

[^三H] 胸苷来自Amersham Biosciences。PLCγ-1抗体来自Santa Cruz Biotech。公司，CA和Bmi-1抗体来自美国CA的Zymed。

卵巢癌患者样本的处理

卵巢癌研究梅奥诊所生物标本资源提供了38例卵巢癌冷冻-OCT患者样本。然后将其加工成五个10微米的切片，并悬浮在500µl TRIzol试剂（Invitrogen）中。然后使用制造商的方案（Invitrogen）分离RNA和总蛋白。

细胞培养

根据供应商的建议，OVCAR-5细胞从ATCC购买，并在含有10%FBS和1%抗生素（青霉素/链霉素）的DMEM中生长。建立OV-167、OV-202和OSE细胞系，并在分别添加10%和20%FBS和1%抗生素的MEM中生长(25). CP-70和A2780细胞在添加10%FBS和1%抗生素的RPMI中生长。

微RNA转染

卵巢细胞OVCAR-5、OV-167、CP-70、A2780或OV-202在转染前在各自的培养基中培养一天。使用低聚体胺将50nM阴性对照1前体miR或miR-15a或miR-16转染细胞。48小时后。对细胞进行westernblot、增殖或克隆生长分析。对于Bmi-1拯救实验，使用Lipofectamine Plus（Invitrogen）用50 nM微小RNA和1µg Bmi-1构建体转染卵巢癌细胞。48小时后。将细胞提起并置于24孔板中进行增殖试验。

西部印记

采集的卵巢癌细胞，无论是经处理的还是未经处理的，均在PBS中清洗，并在冰镇放射免疫沉淀（RIPA）缓冲液中用新添加的0.01%蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Sigma）溶解，然后在冰上培养30分钟。通过在4°C下以13000 rpm离心10分钟，丢弃细胞碎片，并在SDS-页面上运行上清液（30-50µg蛋白质）(25).

细胞增殖试验

卵巢细胞（2×10⁴)接种于24孔培养皿中培养48小时。随后1µCi[^三H] 加入胸苷；4h后，用冷冻PBS清洗细胞，用100%冷甲醇固定，并收集用于测量三氯乙酸可吸收放射性。每次实验至少重复三次，一式三份，并按照前面所述进行分析(25).

克隆形成分析

在microRNA转染后进行克隆形成分析，如下所示：；OV-167和CP-70细胞分别以每毫升200个细胞的速度被置于60mm的平板中。接种后7-10天内，用0.1%结晶紫对细胞进行染色后，对菌落进行计数(25).

向量构造

预测了miR-15a的两个不同的相互作用位点，即Bmi-1 3'UTR上的位置3002–3023和3108–3129(NM_005180.5号). 第二个位点3108–3129也被预测为miR-16相互作用的位点。通过使用QuickChange试剂盒（Stratagene）从Siwthgear Genomics获得的Bmi-1 3'UTR荧光素酶报告子结构中删除8 bp预测的miR相互作用位点，制备了两种不同的结构。突变体#1的miR-15a位点被删除，并使用以下引物构建：（5'-3'）gcttgtttttatagtataaatcattactttatatatcttctctttttaaaaatatag和（3'-5'）ctatattaaaagaagcagaatatgtaattaatgactataagcacaaagc。突变体#2具有使用以下引物删除的miR-15a/16的共同位点：（5'-3'）gacctaaattgactagtccattgtaattctatattagatgtaatgaaatttc和（3'-5'）gaaattcattactatatatatatagaattacaatgggactacaaatttagtcc。

荧光素酶报告分析

5000个卵巢癌细胞被放置在96个板中。24小时后。如上所述，用50nM microRNA（最终浓度）和野生型Bmi-1 3'UTR-荧光素酶构建物或mutrant#1或突变体#2（100 ng/孔最终浓度）转染细胞。48小时。转染后，使用SteadyGlo分析系统（Promega）测量荧光素酶活性。荧光素酶活性的计算如下：miR-15a或miR-16模拟物的光输出/阴性对照1前体miR的光输出=靶3'UTR上miR-15a或miR-十六的活性。

RNA提取、逆转录和实时PCR

使用TRIzol试剂（Invitrogen）从转染细胞中分离出总RNA。为了量化转染和/或内源性成熟microRNA水平，使用了TaqMan®microRNA分析（Applied Biosystems）。首先使用TaqMan®microRNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems）使用microRNA特异性引物逆转录RNA，然后使用TaqMan®Universal PCR Master Mix，No AmpErase®UNG（AppliedBiosystams）进行实时PCR。比较级C_吨该方法用于计算与RNU6B表达相比的microRNA相对丰度（相对于U6的折叠差异）(26).

统计分析

所有值均表示为平均值±SD。采用双侧Student t检验确定统计学显著性，P＜0.05（*）的值被认为是显著的。

结果

Bmi-1在卵巢癌中过度表达

最近的实验观察表明，人类非小细胞肺癌中Bmi-1的表达增加(7)，乳腺癌(8)，前列腺癌(9)卵巢癌占80.9%(10)提示Bmi-1在上皮恶性肿瘤进展中的致癌作用。根据我们之前的观察(25)我们证实，与非恶性卵巢表面上皮细胞（OSE）相比，Bmi-1在一组卵巢癌细胞系中的表达更高(图1A). 同时，通过Western blot检测38例高级别浆液性卵巢癌样本中Bmi-1的表达。根据Bmi-1的相对表达（相对于β-actin），卵巢癌样本分为高表达和低表达Bmi-1组(图1B的补充). 通过NIH图像密度计测定每个患者的β-肌动蛋白和Bmi-1的带强度。如果Bmi-1:beta-actin比值大于0.7，则认为该比值较高，如果小于0.7则认为该值较低(图1B). 在38个样本中，10个样本Bmi-1低表达，28个样本Bmi-1高表达，这表明Bmi-1在卵巢癌的发病机制中发挥着重要作用。

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图1

Bmi-1在卵巢癌细胞系和患者样本中的表达。（A）不同卵巢癌细胞的细胞裂解物在SDS-Page凝胶上运行，并使用Bmi-1抗体进行Western blot。β肌动蛋白被用作负荷控制。（B）使用TRIzol方法从38例冰冻OCT患者样本中收集蛋白质，并使用Bmi-1抗体进行western blot。β肌动蛋白被用作负荷控制。在OV9中，由NIH图像密度测定法测定的Bmi-1的带强度/β-肌动蛋白的带强度=1。在OV10中，Bmi-1的带强度/β-肌动蛋白的带强度=0.41。这里显示了一个具有代表性的图像。计算所有38个样本的这类比率，Bmi-1:β-肌动蛋白比率>0.7被认为是高的，如果小于0.7则被认为是低表达。

推测的microRNA与Bmi-1相互作用的预测

使用动物miRNA靶点的MiRGen预测集成数据库发现可能靶向Bmi-1的microRNA(27) (†)根据广泛使用的目标预测程序组合。卵巢癌相关论文(18,23,28)人工分析以提取卵巢癌样本中下调的miRNAs。通过只选择能够靶向Bmi-1且在卵巢癌中同时丢失的miRNAs，我们确定miR-15a和miR-16为Bmi-1的潜在靶点。

卵巢癌中MiR-15a和MiR-16水平与Bmi-1表达相关

知道Bmi-1过度表达后，我们接下来试图确定卵巢癌样本中miR-15a和miR-16的表达水平。首先，我们通过RT-PCR测定了6个卵巢细胞系中miR-15a和miR-16的表达水平。与对照OSE细胞相比，每个卵巢癌细胞系的MiR-15a和MiR-16相对水平（关于RNU6B，见方法）都较低(图2A).

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图2

卵巢癌细胞株和患者样本中miR-15a和miR-16的表达及其与Bmi-1水平的相关性。（A）使用TRIzol方法从卵巢癌细胞系中收集总RNA，并进行RT-PCR。比较级C_吨方法用于计算miR-15a或miR-16相对于RNU6B表达的相对丰度。微RNA相对于OSE细胞的相对折叠差异被表示出来。P<0.05（*）被认为是显著的。（B）计算miR-15a和miR-16的平均相对折叠差异，并与患者样本中Bmi-1高表达组和低表达组进行比较。在高表达和低表达Bmi-1的样品之间观察到的微小RNA表达的差异具有统计学意义（miR-15a和miR-16分别为p=0.04和p=0.02）。

随后，我们评估了38例卵巢癌患者样本中miR-15a和miR-16的表达水平(图2B的补充)，并将该数据与之前从这些相同样本中获得的Bmi-1表达水平相关联(图1B). 我们观察到，以高Bmi-1蛋白水平为特征的卵巢癌样本的miR-15a和miR-16水平均较低，而低Bmi-1表达的样本的miR-15a和miR-16水平较高。在Bmi-1高表达和低表达样本之间观察到的microRNA表达差异具有统计学意义（miR-15a和miR-16分别为p=0.04和p=0.02）(图2B). 这些数据表明，miR-15a和miR-16水平与Bmi-1表达之间存在明显的负相关。

Bmi-1是miR-15a和miR-16的直接靶点

与阴性对照1前体microRNA相比，将miR-15a和miR-16转染到卵巢细胞系中导致Bmi-1的蛋白质水平显著降低，这是通过蛋白质印迹测定的(图3). 同样，与对照组相比，miR-15a和miR-16转染细胞中的Bmi-1 3'UTR（OV-202和CP-70）荧光素酶活性也显著降低(图4). 单个miR-16位点的突变挽救了荧光素酶的活性，从而证实了miR-16与Bmi-1 mRNA的3'UTR直接相互作用。然而，两个miR-15a位点的突变独立地挽救了荧光素酶的部分活性(图4). 因此存在两种可能性，一种是双突变体可以完全解救荧光素酶活性的抑制，另一种可能是Bmi-1的3'UTR中可能存在miR-15a的其他相互作用位点。因此，在确定miR-15a和miR-16靶向Bmi-1的3'UTR并下调Bmi-1蛋白水平后，我们接下来想确定这些微RNA对卵巢癌细胞增殖和克隆生长的影响。

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图3

microRNA表达对卵巢癌细胞系中Bmi-1蛋白水平的影响。用寡病毒胺将阴性对照1前体miR（SC）、miR-15a或miR-16转染卵巢癌细胞株。48小时后。收集细胞裂解物并在SDS-电泳上用Bmi-1和PLCγ-1抗体进行western印迹。

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图4

miR-15a和miR-16靶向Bmi-1 3'UTR。使用Lipofectamine Plus试剂，用携带荧光素酶报告基因的野生型Bmi-1 3'UTR构建物或在预测的miR-15a或miR-16相互作用位点带有缺失的两个突变体以及阴性对照1前体miR、miR-15a或miR-十六转染卵巢癌细胞系。48小时后。使用SteadyGLO（Promega）测定荧光素酶活性。P<0.05（*）被认为是显著的。

MiR-15a和MiR-16控制卵巢细胞系的增殖和克隆生长

根据我们和其他人之前的观察，Bmi-1在卵巢癌细胞系以及原发组织中过度表达。众所周知，Bmi-1还可以调节许多不同类型细胞的增殖和克隆能力。因此，我们假设卵巢癌细胞中miR-15a或miR-16的恢复通过Bmi-1下调可能影响细胞增殖。为此，在卵巢癌细胞系中过度表达miR-15a或miR-16后，我们进行了增殖和克隆生长分析。用阴性对照1前体miRNA或miR-15a或miR-16转染细胞48小时[^三H] -将miRNA转染细胞镀入24孔板48小时后进行胸苷掺入试验。在测试的三种细胞系中，与对照相比，在miR-15a或miR-16转染的细胞中观察到OV-167、OV-202和CP-70的增殖显著降低(图5A). 克隆生长试验也获得了类似的结果(图5B). 为了进一步证实microRNA诱导的增殖抑制是由于Bmi-1通过其3'UTR下调所致，我们过度表达了microRNA和Bmi-1构建物，但没有一些3'UTRs，因此对microRNA的抑制没有反应。正如预期的那样，Bmi-1结构的过度表达挽救了miR-15a和miR-16转染OV-202细胞增殖表型的降低(图5B). OV-167和CP-70也获得了类似的结果（数据未显示）。这些结果证明，在卵巢癌中，miR-15a和miR-16确实通过下调Bmi-1来调节增殖和克隆生长。

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图5

microRNA表达对卵巢癌细胞株增殖和克隆生长的影响。（A） miR-15a或miR-16的过度表达会显著抑制卵巢癌细胞系的克隆生长。（B） miR-15a或miR-16的过度表达会显著抑制卵巢癌细胞株的增殖。miR-15a或miR-16的过度表达以及对microRNA无反应的Bmi-1构建物可以缓解OV-202细胞的增殖抑制。

MiR-15a和MiR-16也靶向卵巢癌细胞系中的Bcl-2

在之前的一项研究中，miR-15a和miR-16被报道抑制B细胞慢性淋巴细胞白血病中的抗凋亡基因Bcl-2(29). 因此，为了确定miR-15a或miR-16的恢复作用是否是通过下调Bmi-1或Bcl-2在卵巢癌细胞中的表达，我们首先通过Western blot检测内源性Bcl-2的表达。在一组卵巢癌细胞系中，除OV-202细胞系外，Bcl-2的表达很低(图6A). 随后，我们还证实了miR-15a或miR-16恢复后OV-202细胞中Bcl-2水平的下调(图6B). Bcl-2是一种已知的凋亡抑制剂，其对卵巢细胞增殖和克隆生长的影响尚不清楚。此外，通过对miR-15a或miR-16无反应的构建物拯救Bmi-1表达可恢复OV-202细胞的增殖(图5B). 因此，Bcl-2下调对增殖的影响（如果有的话）是最小的。

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图6

Bcl-2在卵巢癌细胞系中的表达。（A）不同卵巢癌细胞的细胞裂解物在SDS-Page凝胶上运行，并使用Bcl-2抗体进行Western blot。β肌动蛋白被用作负荷控制。（B） OV-202细胞转染对照组miR-15a或miR-16，使用寡聚体胺。48小时后。收集细胞裂解物并在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上用Bcl-2和β-肌动蛋白抗体进行蛋白质印迹。

讨论

最近，MiRNAs被描述为人类癌症的重要参与者，并被提出作为治疗靶点的作用。miRNAs在卵巢癌中的表达被显著解除，这有力地表明miRNA参与了该疾病的发生和发展(30). 在这项研究中，我们确定转录抑制因子Bmi-1是卵巢癌中miR-15a和miR-16的靶点。

这个B细胞特异性莫洛氏鼠白血病病毒插入位点-1该基因在多种人类肿瘤中广泛表达，包括淋巴瘤、非小细胞肺癌、B细胞非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、结直肠癌和神经母细胞瘤，并已被证明是骨髓增生异常综合征和许多癌症（包括鼻咽癌和胃癌）的有用预后标志物。根据之前的一篇报道，在80.9%的卵巢癌患者中Bmi-1高表达，我们的western blot研究显示，约74%的患者样本中Bmi-1高表达，约26%的患者标本中Bmi-1-低表达，因此表明Bmi-1在卵巢癌中起着重要作用(10).

在最近的一项研究中，Bmi-1被miR-128靶向胶质瘤细胞，并显示其调节自我更新(31). 然而，我们发现OSE和其他卵巢癌细胞株之间miR-128的水平没有显著差异，但A2780的miR-128水平较高(图2A的补充). 这些结果表明，miR-128，至少在卵巢癌中，在调节Bmi-1中不起重要作用。第一项记录肿瘤中miRNA表达异常的研究确定了miR-15a和miR-16，它们位于B细胞慢性淋巴细胞白血病的一个频繁缺失区域(32). 与正常垂体组织相比，垂体腺瘤中MiR-15a和MiR-16的表达水平也较低(33). 我们发现miR-15a和miR-16在卵巢癌细胞系和患者样本中下调。此外，在卵巢癌细胞系和患者样本中，Bmi-1表达与miR-15a和miR-16水平之间存在强烈的负相关。根据至少四项不同的研究报告，卵巢肿瘤中miR-15a和miR-16显著下调，这与基因组拷贝数丢失或表观遗传沉默有关，或是由于microRNA加工机制受损，如Dicer表达减少(23,30,34,35). 然而，这种下调的意义尚不明确。我们的数据表明，miR-15a或miR-16的表达对卵巢癌细胞的增殖和克隆生长具有抑制作用，这表明miR-15a或miR-16-的下调可能通过调节Bmi-1蛋白水平促进卵巢肿瘤的生长。

我们提出的相关问题是，miR-15a或miR-16诱导卵巢癌细胞增殖和克隆生长减少的靶点是什么？包括miR-15a或miR-16在内的微小RNA可以影响数百个信使核糖核酸，这使得识别生物学相关靶点变得困难。然而，我们能够证明miR-16与Bmi-1的3'UTR特异性相互作用并调节其表达水平。此外，两个miR-15a位点的突变仅部分挽救了荧光素酶活性。因此，有两种可能性可以解释这种结果；i）双突变体可以完全解除荧光素酶活性的抑制，或ii）Bmi-1的3'UTR中存在miR-15a的其他相互作用位点。

在卵巢癌中，Bmi-1表达的调节因子可能是增殖、克隆生长、自我更新甚至化疗耐药的关键决定因素(36). 生理上，miR-15a和miR-16通过作用于Bcl-2等多个靶点发挥作用(29). 然而，在卵巢癌中，miR-15a和miR-16持续下调Bmi-1并影响增殖和克隆生长，因此表明其作为治疗药物的潜力。

补充材料

01

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致谢

我们要感谢K.Kalli和D.Mukhopadhyay的鼓励和支持。

财政支持：这项工作得到了NIH拨款的支持：CA136494、CA135011、HL 70567以及布鲁斯和玛莎·阿特沃特的慷慨捐赠。

脚注

^�http://www.diana.pcbi.upenn.edu/miRGen.html

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