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开发生物。作者手稿;PMC 2011年5月1日提供。
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NIHMSID公司:NIHMS155412
PMID:19932206

成肌细胞融合:当需要更多才能形成一个时

摘要

在许多组织的形态和功能的发生中,细胞-细胞融合是一个关键且高度调控的事件。一种特殊类型的细胞融合,即成肌细胞融合,是塑造肌肉形成和修复的关键细胞过程。尽管它对人类健康很重要,但这一过程背后的机制仍不清楚。这篇综述的目的是强调与成肌细胞融合有关的最新文献,并重点比较几种模型系统,特别是苍蝇、斑马鱼和老鼠的这些研究。技术分析和成像技术的进步使新融合基因的鉴定成为可能,并推动了这些系统中先前鉴定的基因的进一步表征。在成肌细胞融合的关键细胞步骤中,迁移、识别、粘附、膜排列以及膜孔的形成和分解是关键的。重要的是,引人注目的新证据表明,在这些物种中,直系基因控制着其中几个步骤。综上所述,三个模型系统之间的比较揭示了一个曾经难以捉摸的过程,提供了令人兴奋的新见解,以及一个有用的基因和机制框架。

细胞-细胞融合是一种重要且高度协调的事件,发生在多种生物发育过程中的多种环境中。这种强大的形态发生过程形成和塑造发育中的组织和器官,并促进组织内环境稳定。虽然许多细胞类型在生物体的一生中经历融合,但体内的大多数细胞仍然是单核的,这表明融合受到严格的调控,必须适当地限制在细胞类型的一个子集内。因此,最近研究表明,异常细胞融合在致癌和肿瘤进展中起作用(Chen等人,2007年;Duelli和Lazebnik,2007年;Oren-Suissa和Podbilewicz,2007年;Podbilewicz,2006年).

此外,细胞-细胞融合作为一种机制,允许发育中的细胞和组织采用其单核前身所不可能的特性或执行其功能。例如,在受精过程中,精子和卵子(两个单倍体细胞)的融合需要产生一个二倍体细胞或合子。在人类胎盘发育过程中,滋养层融合是植入和维持发育中胚胎所必需的。此外,骨骼和肌肉的发育和修复依赖于融合;对于前者,巨噬细胞融合形成破骨细胞,破骨细胞具有再吸收钙化组织的能力,而对于后者,单个成肌细胞融合形成大的合胞体,能够产生产生力所需的各种肌群。最近的数据还表明,干细胞可以进行融合,从而导致体细胞的遗传重编程(Chen等人,2007年;Chen和Olson,2005年;Oren-Suissa和Podbilewicz,2007年;Podbilewicz,2006年;Sapir等人,2008年). 发生融合的组织的多样性突显了这一过程对正常发育的重要性,但细胞-细胞融合的潜在细胞机制和亚细胞行为仍不清楚。

在几种细胞-细胞融合系统中进行的观察,即肌肉、秀丽线虫和sperm-egg,表明融合过程中存在一组常见的细胞行为。这始于两个将融合的细胞的识别和粘附。一旦细胞粘附,两个细胞的膜就会对齐,使脂质双层非常接近。一种被提议的融合原,一种膜融合效应蛋白,被输送到融合位点,导致融合细胞之间形成孔隙。一个或多个孔隙的形成和膨胀取决于所分析的系统(Doberstein等人,1997年;莫勒等人,1998年). 然而,数据表明,膜泡化可能是孔扩张的中间产物,将这些膜循环到细胞的其他区域。一旦达到细胞质的连续性,细胞内容物,包括细胞核,就会混合在形成的单个细胞中(Chen,2008年). 虽然我们让读者参考最近几篇关于融合的综述(Chen等人,2007年;Duelli和Lazebnik,2007年;Oren Suissa和Podbilewicz,2007年;Podbilewicz,2006年;Sapir等人,2008年;Shemer和Podbilewicz,2003年),我们在这篇综述中的目标是讨论骨骼肌发育背景下的细胞间融合。

从头部到脚,各种骨骼肌控制着各种大小生物体的运动。骨骼肌通常由多核肌纤维束组成,可以通过形态特征进行区分,例如大小、形状、方向、神经支配和附着部位。这些独特的特性允许相当多的肌肉多样性产生肌肉,以产生各种运动和功能。尽管关于如何实现特定肌肉形状和方向的数据不断涌现,但在理解肌肉纤维大小的生成方面取得了重大进展,这依赖于所有骨骼肌共同的分化成肌细胞的早期迭代融合。对这一过程的了解与治疗因肌肉营养不良、癌症恶病质、衰老或萎缩等疾病导致的特定肌肉群的消瘦特别相关。

目前,三种模型生物被用于研究成肌细胞融合:果蝇黑腹果蝇斑马鱼,达尼奥雷里奥以及鼠标,小家鼠(图1). 因为我们迄今为止的大部分知识都来自于果蝇属首先,我们简要描述了幼虫体壁肌肉发育的显著特征,为成肌细胞融合研究提供了背景。在此介绍之后,我们根据融合迁移、粘附、粘附/融合部位的肌动蛋白调节、该部位的囊泡运输、膜破裂和下一次融合的融合机制重置所需的保守细胞行为,讨论了最近确定的肌肉融合基因的数据(图2). 然后我们转向斑马鱼和小鼠,简要描述这些系统中的肌肉发育,并比较这些模型中融合的细胞生物学和分子控制的已知情况。因此,在进行跨物种比较时,我们的目的是更清楚地了解与成肌细胞融合有关的总体数据以及驱动这一过程的分子机制和细胞内事件。

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各种模型系统中的肌纤维是由单核肌肉前体融合形成的

(A-D公司)使用核DsRed转基因(红色)可视化细胞核(一个),DAPI(蓝色)(B类,C类)或苏木精(紫色)(D类). (一个)a的四个半段果蝇属用抗原肌球蛋白(green)抗体对胚胎进行免疫组织化学分析。(B类)野生型斑马鱼胚胎的合胞体快速抽搐肌纤维被标记为抗快速肌球蛋白轻链抗体(红色)。骨骼肌GFP表达(绿色)突出显示了两种快速肌纤维肌动蛋白gfp转基因。(C类)C2C12成肌细胞是一种卫星细胞衍生的小鼠成肌细胞培养细胞系,用抗肌球蛋白重链(绿色)抗体进行免疫组织化学分析。比例尺代表40μm。(D类)用苏木精和伊红染色的成年小鼠腿部主要肌肉腓肠肌的横截面。注意,细胞核位于外围,与其他面板不同,肌纤维的多核性质在本节中不明显。

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成肌细胞融合期间发生的细胞和亚细胞行为

成肌细胞融合过程中发生了几个细胞步骤;每个步骤都与定义的一系列亚细胞事件相一致。(一个)细胞首先向融合伙伴迁移,同时肌动蛋白聚合(红线)和跨膜引诱物的表达(小矩形)引导迁移细胞。(B类)然后细胞接触并粘附,导致细胞类型特异性跨膜蛋白的定位。(C类)这导致肌动蛋白(红色椭圆形)的积累,并在融合部位形成FuRMAS(紫色环)。随后,一些统称为“融合机制”的融合蛋白定位于融合位点,可能是通过囊泡运输。灰色框所勾勒的区域在中进行了更详细的检查图3. (D类)随后是膜破裂和囊泡膜和融合机械部件的去除。(E类)最后,细胞必须通过表达适当水平的跨膜引诱剂来重置以进行下一轮融合。这个过程将反复重复,直到达到最终的肌肉或纤维尺寸。

果蝇肌发生

果蝇属胚胎,每个腹部半段有30种不同的体肌纤维的重复模式(贝特,1990年) (图1A). 尽管它们有相似之处,例如收缩蛋白和神经递质受体的共同表达,但每一肌肉纤维都可以通过其大小、形状、方向、细胞核数量、神经支配和肌腱附着部位来区分(Baylies等人,1998年;Frasch,1999年). 肌肉发生过程中这些肌肉特异性属性的获得取决于两类成肌细胞的先前规格:来自每个中胚层半段的创始细胞(FC)和融合活性成肌细胞(FCM)。每一块肌肉都由一个FC预先配置,该FC通过与周围的FCM融合来播种肌肉形成。

成肌细胞是多种多样的成肌细胞。每个FC都有一个独特的特性,其特征是转录因子的表达,如Krüppel、Slouch、Even-skipped、Apterous和Nautilus(Baylies等人,1998年;贝克特,2006年;卡梅纳,2006年;Frasch,1999年). 每个FC中表达的转录调控因子的特定组合决定了最终肌肉的独特形态。这在参与融合的基因发生突变的胚胎中得到了证明:肌纤维蛋白表达分化标记物,如肌球蛋白重链(MHC),并向其附着部位延伸,但未能融合,导致单核肌纤维蛋白试图采用其正常的肌肉形态。与FCs相比,FCM被认为是一种更均匀、更幼稚的成肌细胞群体,其表达转录因子Lameduck(Lmd)(Duan等人,2001年;Furlong等人,2001年;Ruiz-Gomez等人,2002年). 在与FC或生长中的肌管融合后,新融合的FCM的细胞核失去Lmd的表达,并表达融合到的FC的转录调控因子(Baylies等人,1998年;贝克特和贝利斯,2006年;Knirr等人,1999年).

然而,最近的证据表明,FCM的多样性比最初认识到的要大得多,这可能会影响融合过程(贝克特和贝利斯,2007年;Estrada等人,2006年;Richardson等人,2008a). 例如果蝇属体细胞中胚层显示,当融合发生时,FC和FCM在发育阶段的特殊组织会影响融合过程(贝克特和贝利斯,2007年). FC位于体细胞中胚层的最外层。FCM包括几个单元层;大多数外部FCM接触FC或上皮组织,而更多内部FCM主要接触其他FCM(贝克特和贝利斯,2007年). 在融合的初始阶段,双核肌肉前体最初在外部检测到,而FCM排列没有任何明显的改变(贝克特和贝利斯,2007年). 这表明FCs与最近的FCM融合,即位于体细胞中胚层最外层的FCM;不直接接触FC的内部FCM可能稍后熔断。随着融合的进行,更多位于内部的FCM采用迁移形态,可能是为了通过体细胞中胚层定位并与外层的FC融合(贝克特和贝利斯,2007年). 因此,FCM在半段内的位置可能会影响其行为。有趣的是,到第14阶段,融合也不会出现预期的FCM减少(贝克特和贝利斯,2007年),这表明先前被推测为有丝分裂后的FCM可能正在经历细胞分裂。事实上,一小部分FCM亚群在第12-13阶段出现分裂(贝克特和贝利斯,2007年). FCM之间的分子多样性得到了数据的支持,数据表明Hbs是一种FCM特异基因,在融合期间在FCM的一个子集中表达(Artero等人,2001年). 经验证的遗传和基因组荟萃分析也表明了FCM之间的分子多样性。在这种情况下,FCM特异性基因的表达,如Sns和D-WIP,在特定时间点在FCM亚群中表现出不同(Estrada等人,2006年). 对FCM多样性的这一新理解为确定可能导致这些细胞行为的FCM亚群中的差异遗传需求提供了令人兴奋的可能性。因此,肌肉形成需要FC和FCM,而这些特定成肌细胞群的身份和排列可能会影响融合过程。

成肌细胞融合果蝇属胚胎发生在胚胎发生后期的5.5小时内(阶段12-15;产卵后7.5-13小时[AEL])。每块肌肉的大小取决于融合事件的数量,单个肌肉的融合事件数量从2到24不等(贝特,1990年). 虽然单个肌肉的最终大小有一些变化,但已经确定了几个肌肉中细胞核的特征平均数(贝克特和贝利斯,2007年;Menon等人,2005年). 此外,燃料电池并非所有燃料电池都同时开始熔断;它们规范的时间可能会影响它们开始融合的时间。同样,虽然每个肌肉停止融合的确切时间尚不清楚,但所有融合都在第15阶段结束时完成(贝克特和贝利斯,2007年). 对单个肌肉融合轮廓的分析表明,融合发生在两个时间阶段。在融合的前3个小时内(阶段12-13),发生了9-27%的融合事件,而剩下的73-91%的融合事件发生在过程的最后2.5个小时(阶段14-15)。进一步的研究表明,在这些发展的后期阶段,聚变事件发生的频率会增加(贝克特和贝利斯,2007年;Richardson等人,2008a).

蛹发育过程中还有第二个肌发生期,肌纤维在这段时间内聚集,以促进成虫更复杂的行为(Roy和VijayRaghavan,1999年). 在此期间,胚胎中保留的成体肌肉前体将分裂产生成肌细胞池,然后与现有的幼虫肌肉纤维融合并形成新生纤维。虽然这为检测成肌细胞融合提供了另一个系统,但本综述将仅关注胚胎肌发生期间的融合事件,这是最具特征的果蝇属模型。

除了其经过充分研究的规格化过程、定义的成肌细胞群和独特的细胞组织外,果蝇属为研究成肌细胞融合提供了一些技术优势。实际上,成像技术的进步,如TEM和延时显微镜(Doberstein等人,1997年;Richardson等人,2007年),增强了我们定义融合步骤的能力。此外,基因筛选和突变分析的简便性已经发现了大量的基因(表1,图3)需要进行适当的融合。我们讨论了最近根据融合所需的不同细胞行为确定的基因(图2).

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成肌细胞融合所需基因的当前工作模型果蝇属

已更新的简化模型反映了最近确定的融合基因,并说明了蛋白质对斑马鱼和小鼠成肌细胞融合范式的保护。请注意,细胞核为白色,肌管为灰色,FCM为蓝色。肌动蛋白焦点和FuRMAS分别被描绘成红色椭圆形和紫色环。矩形代表在多个系统中成肌细胞融合中具有保守作用的蛋白质。卵子代表脊椎动物中已知同源的蛋白质,迄今为止,这些蛋白质在融合中没有作用。钻石代表脊椎动物中没有已知同源物的蛋白质。实心箭头表示特征明确的生物化学相互作用,虚线箭头表示遗传和/或建议的生物化学交互作用,白色箭头表示在其他背景下对同源蛋白质的研究中建议的交互作用。虽然这种描述表明每个跨膜蛋白都有特定的相互作用伙伴,但有证据表明,情况可能并非如此,因为Duf和Hbs之间的相互作用已被证明可以介导细胞粘附在体外此外,读者需要注意的是,尽管Mbc介导的Rac活化和Rac→SCAR复合物→Arp2/3途径存在强大的生物化学作用,但还没有证据表明Mbc与依赖Arp2/3的肌动蛋白聚合之间存在完整的通路。

表1

显示在成肌细胞融合中发挥作用的基因产物的部分列表
果蝇属蛋白质脊椎动物蛋白质中的建议功能果蝇属和细胞/亚细胞行为测试的模型Actin焦点类b条参考文献
奈夫林成肌细胞粘附;图2Bd、 米,zc(c)1Kestila等人,1998年;Bour等人,2000年;Sohn等人,2009年
血红蛋白奈夫林成肌细胞粘附;图2Bd、 米,zc(c)未知Kestila等人,1998年;Artero等人,2001年;Dworak等人,2001年 Sohn等人,2009年
杜夫(基尔)Kirrel家族成肌细胞粘附/吸引;图2A、Bd、 z(z)1Ruiz-Gomez等人,2000年;Strunkelnberg等人,2001年;Srinivas等人,2007年
Rst(不规则)Kirrel家族成肌细胞粘附/吸引;图2A、Bd日1Strunkelnberg等人,2001年
罗尔斯(蚂蚁)Tanc1号机组适配器,信号;回收d日1Menon和Chia 2001年;Chen和Olson 2001;Rau等人,2001年;Menon等人,2005年
机架1、机架2、材料Rac1、Rac2、Rac3、RhoG细胞骨架、SCAR/WAVE复合物调控;图2Cd日d日z(z)e(电子),米e(电子)Luo等人,1994年;Hakeda-Suzuki等人,2002年;Chen等人,2003年;Srinivas等人,2007年;Vasyutina等人,2009年
Kette(下摆)小睡1细胞骨架、SCAR/WAVE复合物调控;图2Cd、 米Richardson等人,2007年
SCAR公司WAVE(波浪)细胞骨架,Arp2/3活化;图2Cd日Richardson等人,2007年
WASp公司WASp公司细胞骨架,Arp2/3激活;图2Cd日2Schafer等人,2007年; 未发表的意见
第2/3节第2/3节细胞骨架,肌动蛋白聚合;图2Cd日未知Richardson等人,2007年
Mbc公司码头1/码头5细胞骨架,Rac活化;图2Cd、 z,米Rushton等人,1995年;埃里克森等人,1997年;Moore等人,2007年;Pajcini等人,2008年;Laurin等人,2008年Galletta等人,1999年;
Crk公司Crk/类似Crk信号适配器图2Cd日(f),z未知Balagopalan等人,2006年;Kim等人,2007年;Moore等人,2007年
吹气无已知同源物未知d日Doberstein等人,1997年;Schroter等人,2004年
Sltr/D-WIP(Vrp1)WIP(在制品)细胞骨架,WASP调节;图2Cd日2马萨瓦等人,2007年;Kim等人,2007年
孤独(Siz)IQSec1/Brag2/GEP100细胞骨架,Arf6/Rac调节;图2Cd、 米2Chen等人,2003年;Richardson等人,2007年
唱歌(Caveolin-3)囊泡融合;图2Cd、 米未知Galbiati等人,1999年; Volonte等人,2003年;Estrada等人,2007年;
日期:果蝇属; z: 斑马鱼;m: 小鼠;
b条来自的肌动蛋白焦点类Richardson等人(2007年):1,无/减少病灶数量;2、正常大小病灶数量增多;3、病灶扩大;
c(c)突变导致肌肉缺损,而非融合缺损;
d日融合缺陷所需的Rac1、Rac2突变;
e(电子)融合缺陷需要Rac1的突变;
(f)推断;
Caveolin-3可能是单打酒吧的功能性直系杆(Estrada等人,2007年:Peckham 2008);然而,这还没有进行功能测试。

迁移

一些证据支持迁移到成肌细胞融合的重要性。例如,在原始和永生哺乳动物培养系统中都观察到并记录了融合前成肌细胞的迁移(霍斯利和巴夫拉,2004年). 考虑到从苍蝇到小鼠融合的基本细胞过程得到了保护,迁移也被认为是果蝇属肌肉发生。

记录FC和FCM安排的数据(贝克特和贝利斯,2007年)以及固定材料中FCM的胞形变化(Bour等人,2000年)为FCM的迁移行为提供了初步支持。然而,延时分析(Richardson等人,2007年)明确记录FCM向FC/肌管的移动体内用肌动蛋白-绿色荧光蛋白报告子标记,FCM表现出动态的细胞形状变化,从圆形形态转变为泪滴状形态。此外,FCM将其丝状体定向延伸至发育FC/肌管(Richardson等人,2007年). 这些观察结果与之前的数据一致,这些数据表明,哑铃状/Kirre(Duf)和Roughest/Inrec(Rst),即FC-特异性免疫球蛋白(Ig)结构域包含的单程跨膜蛋白,都是FCM的引诱剂(Ruiz-Gomez等人,2000年;Strunkelnberg等人,2001年) (表1) (图3). 这些蛋白的异位表达足以改变FCM的迁移路径,并将其导向引诱剂的来源,尽管细胞未能融合。据信,FCM识别这些引诱剂、迁移并随后粘附到FCs/肌管的能力是由FCM特异性Ig结构域跨膜蛋白、Sticks and Stones(Sns)和Hibris(Hbs)介导的(Artero等人,2001年;Bour等人,2000年;Dworak等人,2001年) (表1) (图3).

延时显微镜揭示的动态细胞行为表明,细胞骨架重排对细胞的正常迁移至关重要果蝇属与此相一致,最近的研究表明Kette是SCAR/WAVE调节复合体的保守成员,在成肌细胞迁移中起作用(Gildor等人,2009年). 已知SCAR/WAVE可调节4月2/3日(Ibarra等人,2005年;史密斯和李,2004;Vartiainen和Machesky,2004年),肌动蛋白成核的有效激活剂,从而连接迁移和细胞骨架(图3). 最初,SCAR分布在整个细胞质中;然而,当细胞采用泪滴状迁移形状时,SCAR变得不对称定位,并在跛足中富集(Gildor等人,2009年). 此本地化在中丢失基特突变体和许多细胞保持圆形和无融合,这意味着SCAR/WAVE定位参与调控形态和迁移行为的变化(Gildor等人,2009年). 小GTPase Rac也被证明可以调节SCAR/WAVE。Rac三重突变体(rac1、rac2、mtl)显示出严重的融合缺陷和更圆形的细胞形态,这表明这些FCM不能迁移(Gildor等人,2009年;Hakeda-Suzuki等人,2002年;Luo等人,1994年;Richardson等人,2007年).

然而,迁移中对Kette和SCAR的要求可能比最初想象的更复杂。Kette在成肌细胞迁移中的作用也使用上述异位迁移分析进行了研究。当他们接触到体外表达的Duf时,基特突变的FCM能够迁移到引诱剂的来源,数量与野生型相当(B.Richardson,未发表)(图4). 这些数据表明基特突变的FCM能够迁移。然而,迁移的各个方面,如迁移速度,可能会在这种突变背景下受到影响,因此分期的差异可能会显示不同的结果。要解决这些相互冲突的数据,需要实时成像来确定迁移需要如何使用科特。

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基特突变的FCM可以迁移到体外表达的哑铃状(Duf),它起到FCM引诱剂的作用体内

(一个)野生型(B类)基特突变体(C类)无翼(Wg)-GAL4>UAS-Duf和(D类)Wg-GAL4>UAS-Duf;基特胚胎。肌纤维和肌纤维蛋白呈绿色;实验胚胎中引诱剂Duf的来源Wg表皮细胞呈红色。野生型(一个)和基特突变体(B类)胚胎,腹外胚层中没有成肌细胞。然而,当野生型胚胎中Duf的表达由Wg GAL4驱动时(C类),FCM从外胚层迁移到腹外胚层。当Duf表示为基特突变胚胎(D类),FCM能够向引诱剂来源迁移。比例尺代表20μm。

识别和粘附

除了迁移所需外,Duf、Rst、Sns和Hbs在成肌细胞的识别和粘附中发挥作用(Artero等人,2001年;Bour等人,2000年;Dworak等人,2001年;Ruiz-Gomez等人,2000年;Strunkelnberg等人,2001年)这表明,尽管迁移、识别和粘附通常被认为是成肌细胞融合过程中功能不同的步骤,但它们实际上在这个层次上是机械和遗传联系在一起的(表1). 在FC中Duf和Rst功能冗余,只有通过两种蛋白的缺失才能严重破坏融合(Strunkelnberg等人,2001年). 在这种情况下,成肌细胞无法正确识别并相互粘附,导致融合受阻。Duf和Rst都附着在Sns上,与Hbs一起,已被证明在FCM中调节识别和粘附(Bour等人,2000年;Dworak等人,2001年;Galletta等人,2004年). 这些蛋白质被假设通过其多个细胞外Ig结构域相互作用,但这种相互作用的确切机制尚不清楚。

最近的数据表明,血红蛋白作为成肌细胞融合的正向调节因子,与Sns具有部分冗余功能(Shelton等人,2009年). 社交网络突变体,一些残余成肌细胞融合发生(每肌肉1-2个),只有通过Sns和Hbs的丢失,成肌细胞的融合才能完全被阻断。其他遗传学研究支持血红蛋白的这种积极作用(Menon等人,2005年;Shelton等人,2009年). 因此,这两个基因似乎都介导识别和粘附,很像FC中的Duf和Rst。虽然这种细胞类型特异性调控看起来很简单,但却有点复杂。Rst最初表示为FC和一些FCM;然而,尚未证明Rst在FCM中具有功能性作用,并且在没有Sn和Hb的情况下无法指导融合(Shelton等人,2009年;Strunkelnberg等人,2001年). 此外,Hbs仅在FCM中短暂表达,在大多数融合事件完成之前,体细胞中胚层中的大多数表达在第14阶段下降(Artero等人,2001年).

成肌细胞识别和随后的黏附导致Duf和Sns组织成环状结构,即FuRMAS(融合限制性肌原黏附结构)(Kesper等人,2007年;Onel和Renkawitz-Pohl,2009年) (图3). 这种结构被认为是一个信号中心,触发从细胞膜到细胞内蛋白质的信号级联,从而导致融合机制向该位点募集(Kesper等人,2007年;Kim等人,2007年;Onel和Renkawitz-Pohl,2009年;Richardson等人,2007年). 通过序列缺失和Sns细胞域定点突变进行的广泛分析揭示了指导成肌细胞融合的冗余功能域。这项研究表明,只有当多个域同时被删除时,Sns才会变得不起作用。此外,去除所有已知磷酸化的酪氨酸残基并不会完全损害锡的功能(Kocherlakota等人,2008年)这表明与适配器蛋白的复杂相互作用尚不清楚。与不同衔接蛋白的相互作用可以解释这些跨膜蛋白如何在成肌细胞融合中发挥多重作用。

粘附/融合部位的肌动蛋白调节

一种特殊的肌动蛋白结构,称为“焦点”,已通过固定和延时成像方法在融合部位确定(Kesper等人,2007年;Kim等人,2007年;Richardson等人,2007年) (图2,,3).). 这种F-肌动蛋白结构的形成取决于上述粘附蛋白;如果没有粘连,肌动蛋白焦点就不会形成。目前的数据也表明肌动蛋白病灶的溶解直接先于融合事件。事实上,当使用实时成像进行分析时,在没有病灶形成和溶解的情况下从未观察到融合(Richardson等人,2007年). 对野生型胚胎肌动蛋白焦点大小和持续时间的精确测量表明,平均焦点大小为1.9μm(0.7-4.5μm),平均焦点持续时间为11.9分钟(5.7-29.5分钟)(Richardson等人,2007年). 融合部位的第二个结构FuRMAS包围着肌动蛋白焦点,据推测限制了融合部位的大小;与此一致,据报道,固定样品中FuRMAS的尺寸范围为1-5μm(Kesper等人,2007年;Onel和Renkawitz-Pohl,2009年). 所报告的大小范围是否反映了FuRMAS和/或肌动蛋白焦点的生长,或成肌细胞之间该结构大小的固有自然变化,尚未确定。为了解决这个问题,需要实时成像FuRMAS的动态,而不是固定样本。

除了为融合地点提供物理标记外(图2,,3),)肌动蛋白焦点也被证明是分类融合突变体的有用工具(Richardson等人,2007年). 由于突变体表型之间的相似性,先前对基本融合基因的研究受到阻碍,突变体表型由未融合成肌细胞和具有一个或几个细胞核的小肌肉组成。由于这些表型之间的相似性,通常对融合过程中蛋白质的作用缺乏机制性的认识。然而,对融合突变体中肌动蛋白焦点的分析发现了突变体之间有趣的差异,并根据其大小和数量将其分为三类(Richardson等人,2007年;Richardson等人,2008b) (表1). 有趣的是,这三类突变体也根据它们在融合过程中影响的过程进行分组。在第一类融合突变体中,包括成肌细胞识别和粘附所需的跨膜蛋白和已知的Duf调节因子(Sns、Rst、Duf、Rols),焦点数量大大减少,表明粘附对肌动蛋白焦点的形成至关重要。第二类突变体,目前仅包含三个已知基因(D-WIP、Loner、WASp)(Gildor等人,2009年;Richardson等人,2007年;Richardson等人,2008b),包含正常大小的病灶,这意味着这些基因可能在融合过程中发挥病灶依赖性作用。最后,第三类包含大多数影响肌动蛋白细胞骨架调节的已知融合基因,导致病灶扩大(Rac、Kette、Scar、Mbc、Blow、Sing),表明这些基因是焦点调节所必需的(Richardson等人,2007年). 融合前病灶形成和溶解的要求以及融合突变体之间焦点行为的差异强调了肌动蛋白在融合位点的重要性。因此,最近的大量研究致力于了解融合位点肌动蛋白焦点调节的分子机制(表1,图3).

目前,两大类促核因子(NPF):SCAR/WAVE(Berger等人,2008年;Richardson等人,2007年)和WASp(Gildor等人,2009年;Kim等人,2007年;马萨瓦等人,2007年;Schafer等人,2007年)已证明在融合过程中调节Arp2/3果蝇属(图3). Kette是SCAR/WAVE调节复合体的保守成员,通过稳定SCAR调节成肌细胞融合,正调控Arp2/3导致肌动蛋白分支。在野生型胚胎中,SCAR通常局限于表现为迁移的FCM的lamellepodial延伸,也局限于粘附性FCM的融合位点。如前所述,基特不粘附于FC的突变体成肌细胞不能将SCAR正确定位于跛足扩展。然而,基特粘附的突变体成肌细胞无法将SCAR定位到融合部位,并表现出扩大的病灶(Gildor等人,2009年;Richardson等人,2007年). 在融合的不同步骤中,这些不同的定位模式表明Kette在迁移和融合中发挥着功能作用,在这两个过程之间提供了另一种分子联系。疤痕母体合子突变胚胎也有扩大的病灶,这表明该途径是肌动蛋白重组所必需的,参与肌动蛋白病灶的溶解(Richardson等人,2007年).

Kette/SCAR复合物的上游调控因子,包括成肌细胞城(Mbc)和Rac,也被证明在成肌细胞融合中起作用。此外,生物化学证据表明,Mbc和ELMO作为一种非典型的二方全球环境基金直接调节Rac1体内; Mbc和ELMO的过度表达体内证明了一种遗传相互作用,它诱导了下游事件,导致成肌细胞融合中断。果蝇属眼睛提示Mbc和ELMO之间的相互作用导致Rac活性增加(Geisbrecht等人,2008年). 激活后,Rac反过来激活Kette/SCAR复合物(Miki和Takenawa,2003年;Nolan等人,1998年;史密斯和李,2004). 虽然Mbc介导的Rac活化和Arp2/3通过Rac和SCAR复合体的顺序活化而活化存在强大的生物化学作用,但在成肌细胞融合期间,尚没有生物化学证据表明Mbc与Arp2/3依赖的肌动蛋白聚合之间存在完整的通路。还需要额外的实验来确定由Rac和SCAR介导的Mbc活性是否导致成肌细胞融合中Arp2/3依赖的肌动蛋白分支体内.

第二条肌动蛋白调节途径果蝇属由NPF的WASp家族介导(Gildor等人,2009年;Kim等人,2007年;马萨瓦等人,2007年;Schafer等人,2007年). 在这种情况下,果蝇属WASp相互作用蛋白(D-WIP)/孤立蛋白(Sltr)被招募到融合位点,并通过WBD(WASp结合域)与WASp交互作用。WASp刺激Arp2/3,导致肌动蛋白分支。D-WIP/Sltr或WASp的缺失会导致严重的熔合缺陷(Kim等人,2007年;马萨瓦等人,2007年). 生化证据也表明D-WIP/Sltr能够与Sns适配器蛋白Crk相互作用(Kim等人,2007年)提供了跨膜受体与肌动蛋白聚合的潜在直接联系。有趣的是,两者都是D-WIP/sltr公司黄蜂突变体都有正常大小的肌动蛋白病灶,而分析黄蜂,基特双突变胚胎显示病灶扩大(Gildor等人,2009年)表明这两个NPF家族在成肌细胞融合过程中依次作用,SCAR途径的作用早于D-WIP/WASp途径(Gildor等人,2009年;Onel和Renkawitz-Pohl,2009年).

融合部位的囊泡贩运

囊泡在成肌细胞融合中的重要性首先是通过透射电镜(TEM)在超微结构水平上检测成肌细胞的融合(Doberstein等人,1997年). 使用这种方法,根据不同发育阶段的流行程度,确定了几个结构并将其排序为融合时间轴。在FC/FCM接触后,在推测的融合部位发现了成对的电子致密囊泡或“融合前复合物”。这些含有未知物质的小泡沿着融合成肌细胞的对置膜排列。随后,出现了电子致密斑块,这些斑块被认为是由融合前复合物的内容物形成的(图2). 这些囊泡在融合过程中的突出表明了在这一过程中运输的重要作用,与肌动蛋白焦点的分析一样,对可用融合突变体的TEM分析揭示了这些步骤中的不同阻断,为几个融合基因的机制提供了重要的见解。

最近关于D-WIP/Sltr的研究支持肌动蛋白在调节囊泡转运中的作用(表1,图3). EM分析D-WIP/sltr公司突变胚胎揭示了囊泡靶向的潜在缺陷,因为不仅在融合部位,而且在相邻的融合活性细胞之间观察到了电子致密的囊泡,这在野生型胚胎中是没有的(Kim等人,2007年). 这与肌动蛋白在融合部位的失调同时发生,表明肌动蛋白可能在囊泡转运过程中提供位置提示。然而,这些小泡是如何靶向融合部位的,肌动蛋白在这一过程中的作用仍存在争议。此外,已经证明囊泡在D-WIP/sltr公司突变体持续存在,没有观察到斑块,表明囊泡与质膜融合的能力存在缺陷(Kim等人,2007年).

肌动蛋白细胞骨架调节和运输之间联系的第二个例子是细胞内衔接蛋白Rolling pebbles/Antisocial(Rols/Ants)(Chen和Olson,2001年;梅农和恰,2001年;Rau等人,2001年) (表1,图3). Rols最初存在于成肌细胞融合中体内试验。角色突变胚胎有严重的融合缺陷,每个FC只有一到两次融合。角色突变胚胎,大小正常,但病灶数量减少(Richardson等人,2007年)这表明罗尔斯在调节细胞间接触方面发挥了作用。与此一致,Rols对Duf再循环到细胞膜以促进后续融合至关重要(Menon等人,2005年). 在粘附时,Rols以Duf依赖的方式从细胞质转移到融合位点,在那里它被证明与Duf与细胞骨架的成分和调节因子物理连接(Chen和Olson,2001年;梅农和恰,2001年)包括D-Titin和Mbc,一种鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF),能够调节小GTPase、Rac(埃里克森等人,1997年;Kiyokawa等人,1998年;Nolan等人,1998年). 因此,Rols通过调节特定跨膜蛋白Duf的定位,在膜和肌动蛋白细胞骨架之间起到连接作用。

单条(sing)最初在基因筛查中发现,似乎在成肌细胞融合期间的囊泡运输中也起作用果蝇属(Estrada等人,2007年) (表1).唱歌编码一个多程跨膜MARVEL域蛋白,在融合期间存在于FC和FCM中。脊椎动物中的MARVEL结构域蛋白已被证明参与紧密连接形成和囊泡运输(Sanchez-Pulido等人,2002年). 始终,TEM分析突变体显示融合前复合物数量增加,其中包含更多的囊泡,这意味着Sing参与了融合前复合物之外的融合进程(Estrada等人,2007年). 囊泡不能正确靶向或与膜融合,这表明Sing可能是成肌细胞融合所需囊泡的功能成分。需要进一步研究以确定Sing在融合过程中的确切分子机制。

Loner/Schizo,一种鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF),位于融合位点附近,但不位于融合位点,也被建议考虑Rac定位(Richardson等人,2007年) (表1,图3). FC/肌管和FCM中均存在Loner(Richardson等人,2007年)并被证明与Duf的细胞内结构域相互作用(Chen等人,2003年). 尽管Loner可以调节另一种小的GTP酶Arf6,在体外(Chen等人,2003年),其目标体内仍不清楚,因为arf6型空蝇是可行的,肌肉发生不受干扰(Dyer等人,2007年).孤独的人突变体也有正常大小的病灶;然而,病灶未能解决,导致强烈的融合缺陷,并表明Loner参与了其他重要的融合过程(Richardson等人,2007年)其性质目前尚不清楚。考虑到Loner对Arf6的作用能力,人们很容易推测其可能参与Arf依赖性过程,如贩运和肌动蛋白细胞骨架重组(D’Souza-Schory和Chavrier,2006年).

融合和复位部位的膜破裂

在中使用TEM分析果蝇属,在融合处可以观察到小的融合孔(Berger等人,2008年;Doberstein等人,1997年;Kim等人,2007年). 这些膜孔扩张,从原位去除发泡膜(图2)导致细胞膜破裂,细胞质连续,最终在生长的肌管中增加另一个细胞核。

在其他融合系统中工作,如表皮和外阴秀丽线虫已鉴定出分别负责膜孔形成和/或扩张的“融合子”,即EFF-1和AFF-1蛋白质(Sapir等人,2007年). 迄今为止,透射电子显微镜(TEM)数据果蝇属胚胎肌肉表明,多个毛孔形成、扩大和合并(Doberstein等人,1997年),而在秀丽线虫皮下组织表明形成了一个单一的孔隙,随后会扩张(莫勒等人,1998年).

迄今为止,研究未能在任何系统中识别成肌细胞融合原。然而,最近的数据果蝇属提示肌动蛋白可能在融合部位提供一种力生成机制(Berger等人,2008年;Gildor等人,2009年). 为了研究这一点,几个小组对融合位点的肌动蛋白调节融合基因进行了超微结构分析,以确定膜是否保持完整。在一些突变体中,包括吹,唱、和铠特,膜保持连续,表明这些蛋白质是融合位点早期事件所必需的(Doberstein等人,1997年;Estrada等人,2007年;Schroter等人,2004年).

相反,对Arp2/3复合物的组成成分之一Arp3的一个突变等位基因的分析表明,融合位点的排列膜上形成了融合孔(Berger等人,2008年). 这表明Arp2/3-介导的肌动蛋白聚合可能需要扩大融合孔才能完成融合。一些使用EM分析D-WIP/Sltr作用的研究表明,肌动蛋白在融合孔扩张中具有潜在作用,尽管结果仍有一些争议。一项研究报告称D-WIP/sltr公司突变体发展到融合的最后阶段,在融合部位对齐的细胞之间有融合孔(马萨瓦等人,2007年). 这得到了细胞质泄漏实验的支持,该实验测试了在FC/肌管中翻译的GFP是否可以在粘附的FCM中检测到。D-WIP/sltr公司检测到突变体泄漏,支持这样的结论,即存在形成但无法膨胀以完成融合的融合孔。这一结果进一步表明,在融合孔形成中,可能需要D-WIP/Sltr-WASp介导的Arp2/3激活肌动蛋白聚合。然而,一项相互矛盾的研究报告称,在融合部位发现了一个完整的膜D-WIP/sltr公司突变体(Kim等人,2007年)这得到了他们自己的细胞质泄漏检测的支持。这些结果是用不同的突变等位基因获得的D-WIP/sltr公司并使用不同的EM固定方法。究竟是不同的遗传背景、不同的固定方式还是不同的等位基因导致了这些差异尚待解决。

随后,FCM的细胞核并入FC/肌管的细胞体中,并将经历核身份转换,关闭FCM特异性身份基因Lmd的表达,并采用其融合伙伴的转录谱(Baylies等人,1998年;贝克特和贝利斯,2006年). 成肌细胞融合的一个未被充分重视但极其重要的方面是观察到肌肉细胞多次重复这些步骤,这在其他几种融合系统中是不存在的。进行连续融合事件的要求表明,发育中的肌管必须有一种细胞机制,通过这种机制,肌管能够完成一次融合并重置自身以进行下一次融合事件。尽管目前对融合的这一有趣方面知之甚少,但在未来的研究中,这仍是一个令人兴奋的领域。

果蝇成肌细胞融合模型

目前,有两种流行的模型果蝇属成肌细胞融合。第一个模型提出融合分为两个不同的步骤,每个步骤不仅需要特定的基因产物子集,还需要不同的亚细胞事件。这个两步模型提出,融合的第一步产生双核或三核前体细胞,而融合的第二步包括产生最终肌肉尺寸所需的剩余融合。对该模型的支持主要来自突变分析和TEM。为了更全面地讨论这个模型,我们让读者参考几篇评论(Onel和Renkawitz-Pohl,2009年;Richardson等人,2008a).

第二个模型被称为两阶段模型,它提出迄今为止确定的所有基因和亚细胞事件都是所有融合所必需的。该模型基于所有融合突变体都能够偶尔融合的观察。此外,在通常每个FC有两到三次融合的融合突变体中,也有未进行融合的FC,这表明一些融合突变体进行多轮融合的能力可能是由于母体贡献的基因产物,而不是特定的逐步要求。该模型还表明,早期融合和晚期融合的主要区别在于融合发生的频率。这是基于两个时间阶段发生融合的观察结果:第一阶段(12-13阶段)罕见且有限的融合,第二阶段(14-15阶段)更频繁的融合。增强融合与更多内部定位的FCM的动员和迁移一致,这可能提供了在两个阶段之间过渡的机制。最近,有人试图合并这两种模式;然而,需要更多的遗传和功能数据(Onel和Renkawitz-Pohl,2009年).

从苍蝇到鱼类再到老鼠的保守范式?

中的实验果蝇属已经产生了成肌细胞融合所需的事件和分子的基本结构。最近在脊椎动物系统中的工作已经开始测试果蝇属脊椎动物的范式,这将在下文中讨论。这项工作揭示了参与这一过程的基因的巨大保守性;然而,这些基因在融合过程中的确切功能是否保守尚待研究。此外,还发现了一些新基因果蝇属成肌细胞融合是脊椎动物成肌细胞融合术研究的结果。关于最近结果的讨论果蝇属,我们将脊椎动物模型斑马鱼和小鼠的最新研究结果按照上述基于过程的格式进行组织。

脊椎动物肌肉发生

鼠标

在哺乳动物胚胎中,骨骼肌来自体节内的中胚层前体细胞。索螨是一种短暂的、分节的中胚层块,在胚胎发生期间成对发育在神经管和脊索的两侧。体节的背侧区域,即皮肤肌节,进一步分为皮肤节和肌节(基督,1995年;Stockdale等人,2000年). 肌节的细胞从周围的脊索、神经管和背侧外胚层接收指令信号,成为肌源性前体,最终产生骨骼肌(Chen等人,2005年;基督,1995年;Dietrich等人,1998年;Geetha-Loganathan P.等人,2008年;Ikeya和Takada,1998年;McDermott等人,2005年;Pourquié等人,1996年;Stockdale等人,2000年;Tajbakhsh等人,1998年;Tajbakhsh S.和M.,2000年). 本规范要求上调MyoD公司我的5肌原调节因子家族(MRF)的基本螺旋-环-螺旋(bHLH)转录激活子,与配对域和同源盒转录因子Pax3和Pax7一起在复杂的转录调控网络中运作(白金汉宫和Relaix,2007年;Pownall等人,2002年). 由于本综述侧重于肌发生、融合的后一个方面,因此我们在此不详细讨论规范。

一旦它们退出细胞周期并开始表达肌肉特异性转录因子的骨干,成肌细胞就可以相互融合,生成合胞体肌纤维。哺乳动物胚胎中成熟肌纤维的发育发生在两个时间上不同的时期:初级肌发生期,其中产生初始肌纤维;次级肌发生期则形成附加纤维。肌肉生长也发生在出生后。这一过程也通过成肌细胞融合成肌纤维来完成,并由成肌细胞的一个子集(称为卫星细胞)介导,卫星细胞与形成成人肌肉的祖细胞来源相同。与参与初级和次级肌发生的成肌细胞不同,卫星细胞无法分化,并作为静止细胞与发育中的肌纤维表面保持联系,并排列在成熟肌纤维的基底层。(Gros等人,2005年;Relaix等人,2005年).

体外数据表明,肌肉发育的每个阶段可以进一步划分为融合的两个阶段。在第一阶段,单个成肌细胞相互融合,生成含有少量细胞核的新生肌管。融合的第二阶段是新生肌纤维的进一步成熟,在此期间,肌纤维的大小增加,并开始表达收缩蛋白。这种尺寸的增加是额外分化成肌细胞并入新生肌管的直接结果(图1C、D). 虽然这些相看起来很相似,但不同的分子已经被证明可以调节融合的两个相在体外(霍斯利和巴夫拉,2004年) (表2). 例如,膜蛋白β1-整合素(Schwander等人,2003年)、VLA-4、VCAM(Rosen等人,1992年)和小窝蛋白-3(Galbiati等人,1999年)已证明在成肌细胞彼此融合中发挥作用;而NFATC2途径(霍斯利等人,2001年)由钙和钙调蛋白以及分泌细胞因子IL-4激活(霍斯利和巴夫拉,2004年)是成肌细胞与新生肌管融合的关键。

表2

最近确定的与融合有关的哺乳动物基因产物的部分列表
哺乳动物基因产物拟议职能本地化参考文献
微囊蛋白-3成肌细胞-成肌细胞融合Galbiati等人,1999年; Volonte等人,2003年
内特林-3肌源性分化;肌管形成Kang等人,2004年
新生素(Netrin受体)肌源性分化;肌管形成Kang等人,2004年
麦弗林成肌细胞-肌管融合;内吞再循环;接触部位的膜融合Doherty等人,2005年;Doherty等人,2008年
甘露糖受体成肌细胞迁移/吸引Jansen和Pavlath,2006年
三重奏细胞骨架,Rac1,RhoA/G激活细胞质Charrasse等人,2007年
DGK-ζ细胞骨架,肌动蛋白重组阿布拉莫维奇和吉,2007年
前列环素成肌细胞迁移的调节/促进融合保密Bondesen等人,2007年
CD164型成肌细胞迁移Bae等人,2008年
EHD2型细胞内循环,与肌钙蛋白的相互作用细胞质,膜Doherty等人,2008年
Cdc42公司细胞骨架,WASp激活泛素的Vasyutina等人,2009年
摩洛哥23成肌细胞迁移和粘附;再生Griffin等人,2009年

卫星细胞除了在出生后的肌肉生长中发挥作用外,在受损骨骼肌的再生和修复中也具有众所周知的功能。为了应对自然原因(即体力劳动、直接创伤)或骨骼肌缺陷的固有遗传倾向(即营养不良)导致的肌肉损伤,卫星细胞被激活(坎皮恩,1984年;Grounds等人,2002年;霍克和加里,2001年). 随后,这些细胞增殖,其中一些细胞退出细胞周期,分化并与受伤的肌纤维融合以修复损伤。卫星细胞也可以相互融合,生成新生的肌纤维;事实上,再生过程很大程度上是基于这种融合(霍斯利和巴夫拉,2004年;摩根和鹧鸪,2003;《工资与骗子》,2005年).

有趣的是,激活的卫星细胞与受损肌管融合的基因似乎与发育过程中参与成肌细胞融合的基因重叠(表2). 例如,M-和N-cadherin的表达在肌肉发育中起作用在体外体内(Donalies等人,1991年;George-Weinstein等人,1997年;Hollnagel等人,2002年;Radie等人,1997年),也在活化的卫星细胞中上调(Irintchev等人,1994年;摩尔和沃尔什,1993年)提示钙粘蛋白在肌肉修复中的作用。然而,在发育过程中,有不同的机制在修复过程中发挥作用,而这些机制对于成肌细胞融合是缺失的或不必要的。这方面的证据来自于对两个过程的研究分析结蛋白(Smythe等人,2001年)和伊尔-4(Horsley等人,2003年)突变小鼠。在这两种情况下,突变小鼠都能正常形成肌肉;然而,修复过程受到影响(霍斯利等人,2003年;Li等人,1997年;Smythe等人,2001年). 综上所述,这表明了解肌肉发育过程中融合的机制可以为卫星细胞生物学和修复提供信息,但这些过程之间存在差异。

斑马鱼

与小鼠相比,斑马鱼的体节和成熟肌节的细胞组成相对简单。皮肤肌节缺失;然而,有人认为存在类似于皮肌节的结构,即一层被称为外部细胞的扁平细胞(Hammond等人,2007年;Hollway等人,2007年;Stellabotte和Devoto,2007年). 这些细胞表达一组与小鼠相似的基因(Devoto等人,2006年)并参与肌肉的生长(Hollway等人,2007年;Stellabotte和Devoto,2007年)这意味着斑马鱼的外部细胞类似于羊膜肌刀。此外,一些证据表明斑马鱼中存在卫星细胞群,包括鉴定了表达Pax7的外部细胞群,Pax7是一种常用于鉴定卫星细胞的标记,可以促进肌节的生长(Devoto等人,2006年;Hammond等人,2007年;Hollway等人,2007年;Stellabotte和Devoto,2007年).

受精后24小时,斑马鱼肌节中可以观察到分化的肌纤维的典型模式(图1B)它由两种不同类型的肌肉纤维组成,即慢收缩和快收缩。这些类似于在高等脊椎动物中发现的慢收缩和快收缩肌肉纤维,但在一些无脊椎动物中不存在,例如果蝇属胚胎。这些不同的纤维起源于前中胚层的两个离散谱系。肌肉祖细胞对慢收缩肌纤维群或快收缩肌纤维的贡献取决于它们相对于中线的内侧位置。例如,位于内侧的肌肉祖细胞,称为近轴细胞,需要神经管和脊索发出刺猬信号(Baxendale等人,2004年;Blagden等人,1997年;Devoto等人,1996年;Du等人,1997年;Lewis等人,1999年;Roy等人,2001年). 随着体细胞发生的开始,表达肌球蛋白重链(MyHC)慢亚型和快亚型组合的慢肌肉前体被并入体节。随后,它们径向迁移经过位于更横向的肌体细胞,最终出现在肌节表面,在那里它们完成分化为缓慢抽搐的肌肉纤维。(Baxendale等人,2004年;Blagden等人,1997年;Bryson-Richardson等人,2005年;Devoto等人,1996年;Du等人,1997年;Roy等人,2001年;Xu等人,2000年). 相比之下,位于更侧面的体肌前体细胞分化为密集的快速抽搐肌肉,这些肌肉构成了肌节的大部分(Blagden等人,1997年;Devoto等人,1996年;Du等人,1997年;Roy等人,2001年) (图1).

最初认为所有斑马鱼体节成肌细胞成熟为单细胞肌纤维。这一概念后来通过更复杂的谱系追踪研究以及慢速和快速肌肉特异性标记基因表达模式的详细表征得到了修正(Roy等人,2001年). 现在人们认识到,虽然慢开关型的肌肉纤维分化为单核肌肉,但快收缩肌肉由合胞体纤维组成,这是骨骼肌的典型特征。此外,观察到用不同标记的供体细胞和宿主细胞构建的斑马鱼胚胎很容易形成嵌合体快速抽搐肌肉,这清楚地确立了快速抽动肌肉的合胞性质(Roy等人,2001年). 最近,使用实时成像技术对快速抽搐肌纤维形态发生进行分析,并对细胞形状变化进行精确量化,发现在融合形成合胞体之前,快速成肌细胞的尺寸动态增加(斯诺等人,2008). 这些发现为脊椎动物成肌细胞融合的系统分析提供了可能性体内到目前为止,只有通过果蝇属胚胎。

尽管在指定融合基质的开发计划中存在差异果蝇属斑马鱼和小鼠,导致融合的细胞步骤是保守的(图2). 根据这些相似之处,这里果蝇属,我们以基于过程的形式组织了对最近确定的基因的讨论。

迁移

成肌细胞位于体节中(基督,1995年;Stockdale等人,2000年); 然而,肌肉遍及胚胎和成人身体,通常位于离体节相当远的部位。因此,成肌细胞的迁移必然是分散肌肉前体的重要机制。在小鼠中,有两个迁移期对成肌细胞融合至关重要。首先,前体细胞从肌发生部位(即体节)迁移到未来肌肉组织的部位,例如在(Vasyutina和Birchmeier,2006年)). 这种最初的迁移一直是大多数研究的重点。在迁移的第二阶段,成肌细胞迁移以寻找融合伙伴。直到最近,这种第二次迁移对融合的重要性才被强调为一种重要机制,使成肌细胞足够接近,从而能够融合(Bae等人,2008年;Bondesen等人,2007年;Jansen和Pavlath,2006年;Mylona等人,2006年) (表2).

肌动蛋白细胞骨架在小鼠成肌细胞的迁移中起着重要作用。用latrunculin A或细胞松弛素D治疗分化的哺乳动物成肌细胞,这两种蛋白分别通过与肌动蛋白单体或肌动蛋白分支结合来干扰F-actin重塑(Coué等人,1987年;Dhawan和Helfman,2004年;Nowak等人,2009年),对成肌细胞迁移产生不利影响在体外(Constantin等人,1995年;桑格和霍尔茨,1972年)与成肌细胞迁移中肌动蛋白细胞骨架的要求一致。

果蝇属,Rac三突变体FCM保持圆形,这表明这些成肌细胞不能迁移(Gildor等人,2009年;Hakeda-Suzuki等人,2002年;Richardson等人,2007年). 有趣的是,小鼠中Rac1的活性似乎并不需要将一组肌肉前体迁移到肢芽。同样,迁移的第一阶段似乎不需要Cdc42体内(Vasyutina等人,2009年). 它们的需求尚未在融合的第二阶段进行测试,这使得第一个迁移期需要其他蛋白质的可能性成为可能。此外,Rho GTPase可能能够补偿另一个的损失,这解释了为什么前体能够在单个突变体中迁移。

最近,气味受体MOR23在调节成肌细胞迁移中的作用已被证明在体外体内(Griffin等人,2009年) (表2), (图6). 气味受体(OR)是G蛋白偶联受体(GPCR)家族的成员,是检测小气味分子的化学传感器(Young和Trask,2002年). 虽然大多数在增殖过程中高度表达,但在成肌细胞融合过程中有许多or表达,并可能控制这一过程中的重叠或离散步骤(Griffin等人,2009年). 与迁移作用一致,MOR23的表达在迁移发生期间上调,而使用siRNA敲低MOR23表达可减少原代肌肉细胞培养中的迁移。此外,原代培养中的MOR23 siRNA表现出融合缺陷,而MOR23的过度表达增加了培养中的肌管数量,增强了迁移对整个融合过程的重要性。有趣的是,MOR23还调节小鼠精子的趋化性和运动性在体外(福田等人,2004年). 因此,MOR23在多种细胞类型的迁移中起着保守的作用,一般来说,ORs可能在先前认为的多种组织中发挥更广泛的作用,开辟了迄今为止在任何肌肉系统中都没有描述过的令人兴奋的迁移新机制。

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描述每个模型系统中已分析的基因子集的维恩图

果蝇、小鼠和斑马鱼的模型系统显示为蓝色、红色和黄色部分重叠的成肌细胞。迄今为止所分析的基因子集被列在每个成肌细胞中。模型生物体特有的基因位于合适成肌细胞的非重叠、单色区域。在多个模型中研究的基因定位在适当的重叠区域。在多个系统中分析的基因在表3.

识别和粘附

果蝇属两种不同类型的成肌细胞,即成肌细胞和成肌细胞必须相互识别,并通过在其表面表达不同的跨膜蛋白来实现(Artero等人,2001年;Bour等人,2000年;Dworak等人,2001年;Ruiz-Gomez等人,2000年;Strunkelnberg等人,2001年). 而识别和粘附所需的基因产物果蝇属即Duf、Rst、Sns和Hbs,随着最近斑马鱼和小鼠系统中两项引人注目的发现的发表,脊椎动物成肌细胞融合中的类似过程和蛋白质才刚刚开始出现。这些研究为这两种生物的融合范式增加了额外的基因,并阐明了保守的同源基因的存在果蝇属跨膜Ig结构域蛋白(表1).

斑马鱼

斑马鱼基因组编码果蝇Duf/Kirre/Rst/Irre锡/汞Ig结构域蛋白家族(Kramer-Zucker等人,2005年;Sohn等人,2009年;Srinivas等人,2007年) (表1). 尽管有许多Kirrel公司(K(K)雷尔-艾克)斑马鱼基因组中只存在基因科雷尔在体节内特异性表达,仅限于肌肉前体,最终形成快速抽搐的肌肉纤维(Srinivas等人,2007年).

在胚胎快速抽搐成肌细胞中,Kirrel定位于细胞膜,随着融合的进行,其表达迅速下调。对Kirrel被击倒的斑马鱼胚胎(Kirrel变体)的分析表明,其活性对于快速抽搐成肌细胞的融合至关重要(Srinivas等人,2007年). 与…惊人的相似果蝇属缺乏Duf/Kirre和Rst/Irre功能的胚胎(Strunkelnberg等人,2001年)Kirrel变体在快速抽搐前体融合中表现出明显的阻滞;而不是野生型胚胎所特有的合胞体快速抽搐纤维阵列(图5A),Kirrel变体在肌节内显示出未融合的成肌细胞的优势(图5C). 这些肌肉随后分化为单核快速抽搐肌肉(Srinivas等人,2007年),让人联想到果蝇属(Ruiz-Gomez等人,2000年;Strunkelnberg等人,2001年) (表3).

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脊椎动物成肌细胞融合需要Rac1和Kirrel/Nephrin的活性

(A-C公司)对照胚胎中的斑马鱼快速抽搐合胞体(一个),表达组成型活性Rac1(caRac1)的胚胎(B类)和a克雷尔变形斑马鱼胚胎(C类)用抗肌球蛋白重链(红色)和血凝素抗体标记Rac1(绿色)进行免疫组织化学分析(B类). (一个)野生型斑马鱼胚胎的快速抽搐肌肉纤维含有多个细胞核。(B类)表达caRac1的斑马鱼胚胎中的快速抽搐合胞体过度融合,包含的细胞核比野生型合胞体多。(C类)在克雷尔变形体中存在大量未融合的快速抽搐前驱体。(D-E公司)对照组近端前肢肌纤维的纵切面(D类)和条件Rac1突变体(E类)用抗结蛋白(绿色)和MyoD(红色)抗体对E13.5小鼠进行免疫组织化学分析。比例尺代表50μm。(E类)条件Rac1突变小鼠(E)的肌纤维又短又细,表明融合受损体内与对照组相比,肌纤维形成长的多核纤维(D类). (F-G公司)从对照组分离的成肌细胞(F类)和尼泊金空(G公司)新生小鼠用抗结蛋白(red)抗体进行免疫组织化学分析。(F类)分化4天后,对照心肌细胞形成大的多核细胞在体外. (G公司)肌细胞来自尼泊金空小鼠分化,但在同一时间段内不能融合。用DAPI(蓝色)可视化细胞核(A-C公司,F类,G公司)或MyoD(D类,E类).

表3

至少在两种模式生物中分析的基因融合表型的比较

密钥:保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms155412ig1.jpg无/减少熔合保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms155412ig2.jpg正常融合保存图片、插图等的外部文件。对象名称为nihms155412ig3.jpg过度融合

1条件Rac1和Cdc42突变小鼠(Rac1飞行/飞行; 磅x1cre公司和Cdc42飞行/飞行; Lbc1型cre公司);
2成分活性(ca)Rac1(Drac1V12型)和Cdc42(cdc42V12型)等位基因;单星号和双星号分别表示使用shRNA或吗啉酸敲除蛋白质产生的表型。参考文献见正文。

目前,尚不清楚斑马鱼Kirrel是否通过与其他Kirrel或Nephrin(Sns正交)家族成员的异型相互作用发挥作用,或者同型结合是否足以进行融合。为了支持后一种情况,Nephrin不在斑马鱼体节中表达,而是定位于前肾,相当于斑马鱼的肾脏(Kramer-Zucker等人,2005年). 然而,尽管如此,最近的一篇文章提出了Nephrin在斑马鱼肌肉发育中的作用。肌间隔尼泊金变形体组织较少且较短,这一表型与肌肉缺陷一致(Sohn等人,2009年). 这种大小差异是否归因于融合缺陷尚不清楚,但研究结果为斑马鱼肌肉发育的其他方面提供了这些蛋白质之间相互作用的可能性。此外,对下面讨论的其他蛋白质的分析表明,小鼠成肌细胞的黏附并不像在果蝇属因此,斑马鱼中是否有其他蛋白质介导这一过程尚待观察。

鼠标

早期在体外研究表明,钙粘附素介导小鼠成肌细胞之间的识别和粘附过程(Donalies等人,1991年;George-Weinstein等人,1997年); 然而,由于M-和N-钙粘蛋白不是必需的,因此必须涉及额外的基因体内(Hollnagel等人,2002年;Radie等人,1997年). 其他数据表明整合素家族成员和其他跨膜蛋白在成肌细胞粘附和排列中起着重要作用(Galbiati等人,1999年;霍斯利和巴夫拉,2004年;Rosen等人,1992年;Schwander等人,2003年) (表2). 综上所述,现有数据表明,一个蛋白家族并不仅仅负责小鼠成肌细胞之间的识别和粘附,这可能反映了与之相比,小鼠成肌层融合背后的额外复杂性果蝇属.

小鼠基因组还编码Duf/Kirre/Rst和Sns/Hbs的同源蛋白(Sellin等人,2003年;Sun等人,2003年;上野等人,2003年). 迄今为止,小鼠Kirrel和Nephrin蛋白已被很好地描述为狭缝双隔膜的组成部分,狭缝双膜片是一种特殊的细胞-细胞粘附复合物,构成肾脏的过滤屏障(Pätäri-Sampo等人,2006年;Trygvason,2001年)或在胰岛β细胞中表达(Sun等人,2003年). 然而,最近的一项研究表明,Nephrin,一种Sns同源基因,可能在哺乳动物成肌细胞融合中发挥保守作用。Nephrin在发育中的小鼠骨骼肌和正在融合的人类胎儿肌肉细胞中表达,在两种人类肌营养不良小鼠模型中上调。分离的原代成肌细胞的分析奈夫林无效小鼠建立融合障碍在体外(图5F、G) (表3)表明Nephrin在脊椎动物骨骼肌融合中发挥作用。有趣的是,细胞混合实验表明,在融合过程中对Nephrin的需求是不对称的;成肌细胞需要肾素,但肌管不需要(Sohn等人,2009年). 因此,Nephrin可能扮演类似于果蝇属Sns,仅在FCM表面上表示(Bour等人,2000年).

与斑马鱼一样,哺乳动物Nephrin与之相互作用的蛋白质尚未确定。在狭缝双隔膜中,Nephrin被证明与自身相互作用(Gerke等人,2003年;Khoshnoodi等人,2003年;Pätäri-Sampo等人,2006年)以及Neph1和Neph2(果蝇属Duf/Kirre)(Barletta等人,2003年;Gerke等人,2003年;Pätäri-Sampo等人,2006年). Duf直方图在成肌细胞融合中是否起任何作用尚未被检测。考虑到斑马鱼Kirrel在快速抽搐成肌细胞融合中是保守的(Srinivas等人,2007年),很可能是这样。然而,尼泊尔1缺陷小鼠没有显示肌肉表型(Donovil等人,2001年)表明Neph1和Neph2可能在成肌细胞识别中发挥冗余功能。此外,各种跨膜蛋白,如甘露糖受体、CDO和BOC已被证明可以调节小鼠的融合在体外(Cole等人,2004年;Jansen和Pavlath,2006年;Kang等人,2002年;Wegorzewska等人,2003年) (表2); 因此,Nephrin与非Sns/Rst或Duf/Kirre同源的跨膜蛋白结合以促进小鼠成肌细胞融合的可能性仍然存在。

最近,在确定斑马鱼和小鼠中负责成肌细胞识别的基因方面取得了巨大进展。探索Kirrel和Nephrin家族蛋白在两种脊椎动物系统中成肌细胞融合中的作用和关系将非常重要。如果我们要全面了解个体细胞行为的机制,这些机制有助于成肌细胞的整体融合,并继续在脊椎动物和成肌细胞之间进行比较,就需要进行这项研究果蝇属成肌细胞融合。综上所述,这项研究表明,曾经难以捉摸的Sns/Rst和Duf/Kirre等效物已经在脊椎动物模型中被识别,这为探索许多有趣的问题开辟了可能性,并首次证明了果蝇属脊椎动物中的识别蛋白。

肌动蛋白在融合位点的调节

如前几篇综述和上文所述果蝇属指出肌动蛋白细胞骨架及其在细胞活动中的许多调节因子的精心协调是成功融合成肌细胞的基础(Berger等人,2008年;Kesper等人,2007年;马萨瓦等人,2007年;Richardson等人,2007年;Schafer等人,2007年). 例如,肌动蛋白焦点的分析,它标志着果蝇属,表明肌动蛋白细胞骨架的许多调节因子,包括Rac、Mbc和Kette都定位于这种结构,并可能在其调节中发挥作用(Richardson等人,2007年). 因此,毫不奇怪,最近的研究侧重于测试先前确定的肌动蛋白调节因子是否存在于果蝇属在脊椎动物成肌细胞融合过程中是保守的。斑马鱼或小鼠中还没有发现等效的肌动蛋白焦点结构;然而果蝇属蛋白质存在于两个系统中(图6), (表1)而且,在许多情况下,它们在融合中的作用最近也得到了解决。因此,为了清晰和连续性,我们对其进行了相应的讨论。

斑马鱼

Rac1和Rac2对成肌细胞融合的要求在果蝇属(Hakeda-Suzuki等人,2002年;Luo等人,1994年). 最近的研究表明,Rac1在斑马鱼快速抽搐前体融合中也发挥着保守的作用。种族1变形胚胎,快速抽搐成肌细胞之间的融合严重受损(Srinivas等人,2007年). 然而,与组成活性Rac突变体相比果蝇属成肌细胞融合受损(Luo等人,1994年)斑马鱼肌节中的组成性Rac1(caRac1)活性触发快速收缩成肌细胞的无限制融合,导致异常大的合胞体(图5B), (表3). 除了这种过度融合缺陷外,caRac1胚胎中的快速抽搐肌纤维也似乎偏离了快速抽动肌纤维的正常模式(图5A). 野生型胚胎中快速抽搐的肌纤维排列成多层,在肌节的宽度上具有典型的模式,而表达caRac1的胚胎的大肌肉合胞体是随机定向的,在肌段上是非系统性延伸的(图5A、B). 野生型肌节内快速纤维的有序排列表明,快速成肌细胞之间的融合不是随机的,而是一个空间调节过程。因此,调节Rac1活性对于确保斑马鱼快速抽搐成肌细胞融合的适当数量和方向性至关重要(Srinivas等人,2007年).

然而,这种过度融合表型的细胞基础尚不清楚。例如,目前尚不清楚表达caRac1的成肌细胞是否可以与相邻的野生型成肌细胞融合以进行不受控制的融合,或者表达caRac 1的成肌肉细胞是否完全彼此进行不受限制的融合以生成大的合胞体。对表达组成活性Rac1的成肌细胞融合动力学的时程分析可能有助于澄清这些问题。

果蝇属Mbc是Rac1的非经典全球环境基金,在成肌细胞融合中的重要性已得到证实(埃里克森等人,1997年;Nolan等人,1998年;Rushton等人,1995年). 斑马鱼基因组编码Mbc、Dock1和Dock5两个密切相关的同源序列(Moore等人,2007年). 如中所示果蝇股份有限公司突变胚胎(埃里克森等人,1997年;Nolan等人,1998年;Rushton等人,1995年),快速收缩成肌细胞的融合在码头1码头5变形胚胎,表明Dock1和Dock5在斑马鱼成肌细胞融合中功能保守(表3). 此外,Dock1和Dock5对斑马鱼肌节中成肌细胞融合的贡献相同(Moore等人,2007年).

哺乳动物Dock1最初是通过与衔接蛋白Crk的物理相互作用在屏幕上识别出来的(长谷川等人,1996年). Dock家族蛋白在多种信号环境中与Crk相关(Galletta等人,2004年;长谷川等人,1996年;Kiyokawa等人,1998年). 这种物理相互作用,以及Dock1和Dock5在斑马鱼融合范式中的作用,表明Crk在成肌细胞融合中的作用。为了探讨斑马鱼直系同源基因是否在成肌细胞融合中发挥作用,将针对Crk和Crk样(Crkl)的吗啉醇注射到斑马鱼胚胎中,导致合胞体快速抽搐肌管的形成受到严重阻碍(Moore等人,2007年)表明Crk和Crkl在斑马鱼快速抽搐成肌细胞融合中均起作用。

目前尚不清楚这种影响是否需要他们与Dock1和Dock5直接交互。有一些迹象表明果蝇属Crk可能通过独立于其与Mbc的物理联系的机制在调节成肌细胞融合中发挥作用(Balagopalan等人,2006年); 因此,不能排除Crk和类Crk在斑马鱼快速抽搐成肌细胞融合中发挥Dock独立作用的可能性。

鼠标

哺乳动物的证据在体外模型还支持肌动蛋白细胞骨架在哺乳动物成肌细胞融合中的作用。例如,延时成像和各种其他实验技术已经阐明了分化成肌细胞基于肌动蛋白的行为在体外(Kawamura等人,2004年;Nowak等人,2009年;Ohtake等人,2006年;Steffen等人,2006年;Steffen等人,2004年). 此外,已经开发了测量肌动蛋白细胞骨架在成肌细胞融合过程中不同作用的分析,从而为剖析哺乳动物成肌细胞的融合细胞生物学提供了重要框架(Nowak等人,2009年),当考虑到许多肌动蛋白调节因子和肌动蛋白基过程参与成肌细胞融合时,这一点尤为重要。

直到最近,还没有实验证明哺乳动物融合范式中对Rac的需求。其中一个原因是体内小鼠小GTPase对早期发育事件的重要性分析。rac1(机架1)缺陷小鼠胚胎在E9.5之前死亡(Sugihara等人,1998年),排除了成肌细胞融合的分析。因此,一项关于哺乳动物成肌细胞融合中Rac功能的早期研究是在在体外培养模型,并使用Rac特异性抑制剂而非遗传扰动(Charrasse等人,2007年). 然而,最近使用了一个条件Rac1基因敲除小鼠模型来分析Rac1敲除对迁移的前轴肌肉前体的影响。对条件Rac1突变体的分析显示,四肢中有短而细的肌纤维,表明融合受损体内(图5D、E)并确立了Rac对哺乳动物融合过程的保守性(Vasyutina等人,2009年) (表1). 有趣的是,与斑马鱼一样,仅Rac1基因消融就足以揭示小鼠的融合缺陷(Srinivas等人,2007年;Vasyutina等人,2009年),而Rac1和Rac2的突变是获得融合缺陷所必需的果蝇属(Hakeda-Suzuki等人,2002年) (表3). 从条件敲除小鼠分离的原代成肌细胞能够适当地招募粘附的早期标记物α-和β-连环蛋白,而成肌细胞-成肌细胞粘附部位聚合肌动蛋白、管状蛋白和Arp2/3的积累减少(Vasyutina等人,2009年). 考虑到Rac在激活Arp2/3以驱动肌动蛋白聚合中的作用,这并不奇怪(Miki和Takenawa,2003年;史密斯和李,2004).

果蝇属,Rac三重突变体中的肌动蛋白焦点扩大。这被认为是指Rac参与了果蝇属(Richardson等人,2007年). 相反,小鼠成肌细胞接触部位的肌动蛋白减少(Vasyutina等人,2009年). 这种差异是否表明Rac蛋白在果蝇属与小鼠或反映了一个事实,即尚未在小鼠中确定融合/肌动蛋白焦点的位置,需要进一步评估。

GTPases Rho家族的第二个成员Cdc42在基于肌动蛋白的丝状伪足中起着非常典型的作用(Heasman和Ridley,2008年)最近还被认为与哺乳动物成肌细胞融合有关(Vasyutina等人,2009年). 与Rac1一样,Cdc42是小鼠早期胚胎发生所必需的(Chen等人,2000年). 果蝇属,组成活性Cdc42不影响成肌细胞融合,但对肌管形态有影响:肌管呈纺锤状而非管状(Luo等人,1994年). 然而,小鼠Cdc42的条件突变(以与上述Rac1条件小鼠相同的方式实现)会干扰成肌细胞融合体内证明哺乳动物融合过程的要求不太可能与果蝇属在所有情况下(表3). 如中所示种族1突变成肌细胞,Cdc42公司突变体成肌细胞能够适当地招募α-和β-连环蛋白,但不能招募vinculin和聚合肌动蛋白。然而,相比之下,成肌细胞-成肌细胞接触部位Arp2/3的积累没有改变(Vasyutina等人,2009年)表明Cdc42和Rac1在成肌细胞融合中发挥非冗余作用。

尽管Cdc42在斑马鱼中的作用尚未被描述,但很有意思的是推测Cdc42对斑马鱼快速抽搐成肌细胞的融合起到什么作用(如果有的话)。Cdc42可能在成肌细胞融合中发挥脊椎动物或哺乳动物的特异性作用,这可能暗示其在成肌细胞融合中的功能。斑马鱼作为一种非羊膜脊椎动物,在解决这一问题上具有独特的地位,为脊椎动物模型的组合使用提供了切实可行的条件。

最近的数据也表明Mbc-Dock1和Dock5的小鼠同源物参与成肌细胞融合体内在体外(Laurin等人,2008年;Pajcini等人,2008年). 哺乳动物Dock1在成肌细胞融合中的作用分析体内揭示了Dock1在开发中的重要作用。码头1无效胚胎表现出原发性肌生成缺陷的特征,表明成肌细胞融合受损导致肌肉内容物显著和普遍减少(Laurin等人,2008年). 综上所述,这些数据表明果蝇属在高等脊椎动物中也有保守作用(Laurin等人,2008年;Pajcini等人,2008年). 相反,分析码头5突变小鼠揭示了该蛋白在胚胎发生过程中的非必需作用;然而,Dock5在成肌细胞融合中似乎具有功能冗余作用体内(Laurin等人,2008年).

除了Mbc的哺乳动物同源物在小鼠成肌细胞融合中的作用外,另一个GEF,Trio,也在哺乳动物成肌细胞的融合中发挥作用(Charrasse等人,2007年;O'Brien等人,2000年). 有趣的是,果蝇属三联体在成肌细胞融合中不起作用体内(Hakeda-Suzuki等人,2002年) (表3). 小鼠中Trio的击倒,可作为Rac1和RhoA/G的双重GEF(Bellanger等人,1998年;Blangy等人,2000年;Debant等人,1996年;Seipel等人,1999年),导致融合受阻在体外(Charrasse等人,2007年)继发性骨骼肌形成缺陷体内(O'Brien等人,2000年). 因此,Dock1/5和Trio虽然都是Rho GTPase的GEF,但在小鼠成肌细胞融合中发挥不同的作用体内(Laurin等人,2008年;O'Brien等人,2000年),强调了成肌细胞融合过程中许多GTPase的时空调控的重要性。在融合过程中,每个GTPase及其相关的GEF管理的具体方面尚未完全了解。由于一个全球环境基金可能在功能上,至少在某种程度上,相互替代,这一点变得更加复杂。例如,在鼠标中,Dock1和Dock5似乎扮演功能冗余的角色体内(Laurin等人,2008年). 与斑马鱼成肌细胞融合中对Dock1和Dock5的要求相比,这是不同的,因为在融合过程中对这两种蛋白质的要求相同(Moore等人,2007年) (表3). 更好地理解每对调控的细胞内行为,以及确定额外的调节器、效应器和每一GTPase的细胞输出,将是理解融合机制的重要步骤。

果蝇属以肌动蛋白焦点标记的融合位点的识别(Richardson等人,2007年)促成了大量数据的发现,产生了研究融合突变体的新方法,并大大改变了该领域的面貌。因此,确定脊椎动物中一直缺乏的融合位点是小鼠和斑马鱼向前迈进的重要一步。一个突变体Nap1的分析,Nap1是Kette的哺乳动物同源物,也是WAVE肌动蛋白重建复合体的成员(雷克曼和安德森,2006年;Weiner等人,2006年) (表1),表示存在等效结构(Nowak等人,2009年). 成肌细胞融合需要Nap1在体外并在成肌细胞接触部位的肌动蛋白细胞骨架重塑中发挥作用(表3). 借助肌动蛋白细胞骨架动力学的一个间接标记观察肌动蛋白的细胞骨架重塑:PLC-δ1的pleckstrin同源性(PH)域与GFP融合(Tall等人,2000年). PLC-δ1的PH域特异性地与磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP)结合2)与肌动蛋白细胞骨架重塑位点高度相关(Coppolino等人,2002年;Insall和Weiner,2001年;Nowak等人,2009年;Rozelle等人,2000年;Tall等人,2000年). 与野生型成肌细胞中PH|GFP报告子的行为相反,融合Nap1击倒成肌细胞的实时成像显示,PH}GFP报道子在成肌细胞之间的接触部位持续存在(Nowak等人,2009年). 这类似于肌动蛋白焦点在基特突变体果蝇属(Richardson等人,2007年),提示在哺乳动物和果蝇属(表1)以及将Nap1功能置于膜重塑步骤(Nowak等人,2009年).

肌动蛋白焦点的识别尚未在任何脊椎动物模型中明确证明;虽然肌动蛋白已经在提议的融合位点被发现(Duan和Gallagher,2009年). 最近的研究表明,PIP的短暂积累2可能是小鼠肌动蛋白焦点的间接标记。此外,已知位于肌动蛋白焦点的蛋白质的定位果蝇属到该站点,例如Dock1(Nowak等人,2009年),进一步证明了这一点。然而,PHGFP积累是否代表与肌动蛋白焦点相同的结构仍有待推测。然而,这位记者对成肌细胞融合过程中的膜动力学提供了新的见解,并为其他模型系统的研究提供了新途径。

融合部位的囊泡贩运

TEM数据显示在融合部位有囊泡果蝇属和哺乳动物模型系统(Doberstein等人,1997年); 因此,贩运可能涉及膜的聚合。然而,这些囊泡的性质尚不清楚,它们在融合中的作用也不清楚。最近的一份出版物表明,内吞再循环可能是成肌细胞融合所需蛋白质定位的重要机制(Doherty等人,2008年)这为成肌细胞融合的细胞内控制提供了一种新的机制。

肌费林是费林家族的成员,与人类肌费林的同源物,发现于融合成肌细胞之间的界面(Davis等人,2002年;Doherty等人,2005年). 肌纤维蛋白在发育中的骨骼肌中高度表达,并在发育和再生期间的成肌细胞-肌纤维融合中发挥作用(Doherty等人,2005年) (图6), (表2). 最近,Myoferrin被证明与eps15同源结构域蛋白EHD2直接相互作用(Doherty等人,2008年). EHD家族成员参与了膜蛋白的内吞再循环(Daumke等人,2007年;纳斯拉夫斯基和卡普兰,2005年;Rapaport等人,2006年)因此,这种相互作用表明Myoferlin在成肌细胞融合期间的再循环中发挥了作用。与此一致的是米弗林成肌细胞为空,转铁蛋白内化正常,但内吞再循环延迟;转铁蛋白存在于内部聚集物中。同样,显性阴性EDH2的表达损害了成肌细胞融合,并导致肌纤维蛋白在内部隔间的隔离,这表明需要在体外EHD2在成肌细胞融合中的表达,并提示Myoferrin的不当贩运可能是该缺陷的原因(Doherty等人,2008年) (图6), (表2).

考虑到Myoferlin和EHD2在融合部位的共定位,可以认为超微结构分析中看到的小泡来自内吞室。转铁蛋白的再循环而非内化受到干扰(Doherty等人,2008年)表明其他成肌细胞融合受体也可能受到EHD2突变的类似影响。鉴于此,很容易推测EHD2的一个功能是负责成肌细胞相互识别和粘附的跨膜蛋白的再循环。然而,这还需要进行实验测试。此外,ferlin蛋白含有多个C2结构域,这些结构域能够通过结合磷脂的能力进行膜结合(Davis等人,2002年;Doherty等人,2005年); 肌纤维蛋白的C2结构域与突触结合蛋白最为相似,突触结合素被认为参与神经末梢两个独立膜的结合(Hui等人,2006年;Tang等人,2006年). 综上所述,这些数据表明肌费林在成肌细胞-成肌细胞融合部位的内吞小泡融合中发挥作用。

果蝇属,Loner定位于与肌动蛋白焦点相邻的融合位点,似乎在融合位点的肌动蛋白调节中不起作用(Chen等人,2003年;Richardson等人,2007年). Loner在成肌细胞融合中发挥什么作用尚不清楚,尽管它已被确定为Arf6的全球环境基金在体外然而,小鼠的最新数据开始揭示IQSec1(Loner的哺乳动物直系祖先)在成肌细胞融合中的作用。IQSec1(Brag2,GEP100)在哺乳动物成肌细胞融合中发挥保守作用:IQSec1敲除的成肌细胞表现出严重的融合缺陷在体外(表1和3)。).体外小鼠体内的数据表明,IQSec1可以作为Arf6的GEF(Dunphy等人,2007年;Pajcini等人,2008年). 与已知Arf6在细胞内转运中的作用一致,局灶性粘连的一种成分paxillin在IQSec1-击倒的成肌细胞中定位不当。有趣的是,IQSec1缺失的成肌细胞的形态与Dock180敲除的成肌纤维细胞的形态不同(Pajcini等人,2008年),支持数据来自果蝇属这表明Loner和Mbc在成肌细胞融合中具有独立作用(Richardson等人,2007年).

两个独立成肌细胞膜的结合产生一个多核细胞通常被认为是融合的最后一步。对于大多数融合细胞类型来说,确实如此。然而,最终成熟肌纤维的产生需要重复融合步骤,直到达到最终的肌肉大小。因此,融合的一个重要方面是融合后细胞能够将适当的细胞表面蛋白重新定位到膜上,并重置成肌细胞内的细胞内通路,为更多的融合做好准备。人们对这种重置过程知之甚少,因为直到最近,人们对融合背后的蛋白质和机制知之甚微。然而,本文回顾的最新研究结果表明,情况不再是这样。近年来,发现许多脊椎动物的已知融合基因的直系同源基因果蝇属在脊椎动物成肌细胞融合中发挥作用(表1和3))以及新的基因和机制(表2和3))他们的参与表明我们对核聚变过程有很多了解。因此,进一步的了解将帮助我们开始了解需要重置的机制。成肌细胞融合生物学的这一领域尚未探索,但只是现在。

视角

上述研究强调了成肌细胞融合的细胞步骤:迁移、识别和粘附、膜破裂和最终并入新的细胞核(图2). 研究果蝇属斑马鱼和哺乳动物在这些步骤的分子调控中表现出一定程度的进化保守性(图6), (表1和3)。). 然而,与许多其他发展过程一样,不同系统之间也存在许多分歧点,这说明需要多个模型来理解成肌细胞融合期间发生的复杂事件系列(图6), (表2和3)。). 此外,从苍蝇到斑马鱼再到老鼠,其复杂性和肌肉多样性不断增加,突显出未来研究的挑战和令人兴奋的潜力。对多个模型收集的数据进行比较,将发现知识差距,并可用于指导未来的研究。例如,在果蝇属还有待在斑马鱼和老鼠身上测试(图6). 同样,TEM和延时显微镜这一系统中成功使用的技术也可以修改,用于其他模型,以进一步了解核聚变背后的事件。我们预计在未来几年将取得重大进展的一些领域包括识别融合路径的其他组件,更好地评估已经识别的组件之间的相互作用,以及使用复杂的显微镜进一步深入研究成肌细胞融合背后的细胞和亚细胞细节。这个果蝇属斑马鱼和哺乳动物系统都有独特的能力,从专门的成像方法到基因筛查和基因操作;只有将所有这些系统的数据结合起来,我们才能全面了解成肌细胞融合的复杂过程。

致谢

我们感谢Grace Pavlath、Emanuela Gussoni和Carmen Birchmeier为我们的数字提供面板(面板D用于图1; 面板F、G和D、E图5)。我们还要感谢Brian Richardson和Baylies实验室的成员对手稿的有益讨论和评论。这项工作得到了斯隆-凯特琳研究所(Sloan Kettering Institute)的支持,美国国立卫生研究院(NIH)向医学学士授予GM 78318,新加坡分子与细胞生物学研究所(Institutes of Molecular and Cell Biology)和科学技术与研究机构(A*STAR)向S.R。

脚注

出版商免责声明:这是一份未经编辑的手稿的PDF文件,已被接受出版。作为对客户的服务,我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前,将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意,在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误,适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

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