胃肠病学。作者手稿；PMC 2010年4月12日提供。
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PMCID公司：项目经理2853247
美国国立卫生研究院：美国国立卫生研究院182459
Mist1通过p21调节胰腺腺泡细胞增殖CIP1/WAF1
印第安纳州西拉斐特普渡大学生物科学系和普渡癌症中心
*通讯作者：Stephen F.Konieczny，普渡大学生物科学系和普渡癌症中心，Hansen Life Sciences Research Building，201 South University Street，West Lafayette，IN 47907-2064，电话：765-494-7976，传真：765-46-2536，ude.eudrup.oib@kfs网站 - 补充材料
01:补充图1:薄雾1击倒对手胰腺降低p21CIP1/WAF1级蛋白质水平。从4周的WT和薄雾1击倒对手胰腺。使用抗p21抗体进行免疫印迹CIP1/WAF1级和抗β-肌动蛋白。
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02:补充图2:第21页击倒对手与对照窝鼠相比，小鼠胰腺腺泡细胞数量增加。第21页击倒对手和对照组小鼠胰腺的腺泡细胞数/面积如文中所述。
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03:补充表一:敲除Mist1导致细胞倍增和G1倍缩短根据细胞生长曲线计算细胞倍增时间。通过AR42J-Control的FACS分析确定每个细胞周期阶段的长度RNA干扰和AR42J-Mist1RNA干扰细胞。补充表二:薄雾1击倒对手腺泡细胞表现出腺泡细胞数量和细胞增殖指数的增加在WT和薄雾1击倒对手指定年龄的室友。p-H3阳性腺泡细胞的百分比通过将p-H3细胞的数量除以每个区域的腺泡细胞总数来确定。每个数字对应于10张独立幻灯片的平均值。
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摘要
背景和目标
Mist1是一种基本的螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子，对外分泌胰腺的正常发育至关重要。本研究的目的是研究Mist1在调节腺泡细胞增殖中的作用。
方法
设计导管和腺泡胰腺细胞系以表达一种可诱导的薄雾1cDNA或表达靶向内源性的shRNA薄雾1实时RT-PCR和免疫印迹检测RNA和蛋白质水平的变化。进行染色质免疫沉淀和报告基因测定，以绘制靶基因上的Mist1响应元件；腺泡细胞的总增殖指数薄雾1用免疫组织化学方法检测胰腺功能。
结果
的表达式薄雾1导致与诱导表达第21页CIP1/WAF1级.shRNA-直接击倒第21页CIP1/WAF1级生成的细胞对薄雾1表达wheras击倒薄雾1抄本或删除薄雾1小鼠基因组导致细胞增殖增加，p21随之降低CIP1/WAF1级蛋白质水平。令人惊讶的是，Mist1依赖于激活第21页CIP1/WAF1级启动子独立于经典的bHLH蛋白结合位点。相反，Sp1结合位点对Mist1依赖性转录至关重要，表明Mist1激活第21页CIP1/WAF1级通过独特的Sp1途径表达。事实上，共免疫沉淀研究表明，Mist1和Sp1位于同一转录复合物中。
结论
我们的结果表明，Mist1在胰腺外分泌的发育中具有双重作用，即控制细胞增殖和促进终末分化。
简介
胰腺发育的小鼠模型提供了重要的分子见解，以了解个体细胞谱系是如何被指定的，以及关键调节因子在胰腺疾病（包括糖尿病、胰腺炎和胰腺癌）发生中的作用。胰腺由三种主要细胞类型组成：内分泌细胞、腺泡细胞和导管细胞。内分泌细胞被组织成朗格汉斯岛，负责产生调节血糖水平的激素。Acinar细胞合成并分泌大量消化酶，这些消化酶通过复杂的导管系统输送至小肠，以帮助消化1,2三种主要胰腺细胞类型的发育受到调节基因表达的转录因子调控网络的严密控制三该网络中包括同源盒转录因子（PDX1、Pbx1、HB9）、成对同源蛋白转录因子（Pax4、Pax6）、叉头框转录因子（Foxa1、Foxa2）和基本螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子（ptf1a/p48、Mist1、neurogenin3、NeuroD）2,4–6这些个体调节因子的缺失通常会导致胰腺完全或部分发育不全，从而导致胚胎或出生后早期的死亡4,7–9虽然每个因子在建立胰腺细胞谱系和调节终末分化事件中的重要性已被充分记录，但对于这些调节途径如何在成人中维持适当的细胞数量和细胞特性，人们知之甚少。
由于这些蛋白质的组合性质，bHLH转录因子对发育和分化事件特别关键。bHLH因子分为两大类：包括广泛表达的E12/E47/HEB的A类蛋白质和显示组织限制表达模式的B类蛋白质。在大多数情况下，优选的bHLH复合物是由a类成员和B类成员组成的异二聚体。这些异二聚体与靶基因启动子和增强子区域中的E-box位点结合，以调节其转录10四种B类bHLH蛋白已显示出胰腺限制性表达模式（Neurogenin3、NeuroD、ptf1a/p48、Mist1）4. The神经生长素3基因是Notch信号的下游靶点，是所有胰腺内分泌细胞系发育所必需的9,11.神经元D是Neurogenin3的下游靶基因，是胰岛素β细胞中的基因转录12与这些内分泌限制的bHLH因子相比，ptf1a/p48在早期胰腺祖细胞中表达，但在胚胎发育后期和成人中仅限于腺泡细胞8,13ptf1a/p48与A类bHLH因子HEB和脊椎动物无毛因子抑制因子RBPJL一起，形成一种独特的三聚蛋白复合物，启动腺泡特异性基因的转录14–16.
另一种在胰腺腺泡细胞中高水平表达的bHLH转录因子是Mist1（也称为bhlhb8）17.删除薄雾1基因(薄雾1击倒对手)导致胰腺外分泌紊乱，包括细胞极性丧失和胞吐缺陷18.薄雾1击倒对手小鼠也表现出应激反应的改变和对蓝绿色素诱导的胰腺炎的敏感性增加19与大多数B类bHLH蛋白不同，Mist1优先形成激活基因转录的同二聚体复合物20,21.腺泡细胞表型的改变薄雾1击倒对手胰腺表明Mist1对腺泡细胞系的维持至关重要。这种功能可以影响多种细胞内过程，如调节性胞吐，但也可能对控制细胞生长决策至关重要，这些决策有助于维持成熟器官中适当的细胞数量。为了确定Mist1是否在控制腺泡细胞生长中发挥作用，我们检测了胰腺细胞中异位表达Mist1的影响。我们的结果表明，Mist1的表达通过诱导第21页CIP1/WAF1级.靶基因分析证实Mist1调节第21页CIP1/WAF1级基因表达和激活依赖于位于第21页CIP1/WAF1级近端启动子。对完整胰腺的分析也表明米斯特1击倒对手与对照窝友相比，腺泡细胞的增殖指数更高。重要的是，这种表型可以通过异位薄雾1表达式。这些发现揭示了Mist1的新作用，它是胰腺外分泌中末端分化和控制腺泡细胞增殖事件的关键调节器。
材料和方法
小鼠菌株
控制野生型，米斯特1击倒对手和弹性蛋白酶公共关系-薄雾1myc公司(El公司公共关系-薄雾1myc公司)转基因小鼠保持在C57Bl/6背景下。所有研究均按照NIH和普渡大学IACUC指南进行。
细胞培养、转染和病毒感染
ARIP和AR42J细胞在40%F-12 Kaighn’s营养液、25%F-12营养液、20%高糖Dulbecco’s改良Eagle’s培养基和10%胎牛血清中培养。生成ARIP泰特-Mist1细胞系，ARIP细胞用18µg pcDNA6-TR（Invitrogen）和3µg pcDNA4-TO-Mist1-Myc/His（Invit罗gen）电穿孔。在含有5µg/ml Blastidin和200µg/ml Zeocin的完整培养基中选择转染细胞。ARIP泰特-雾1-p21RNA干扰通过转染ARIP生成细胞系泰特-含20µg pSuper-p21的Mist1细胞RNA干扰构建并在含有260µg/ml G418的完整培养基中选择。AR42J-Mist1RNA干扰用20µg pSuper-Mist1电穿孔AR42J细胞生成对照细胞系RNA干扰或pSuper-ControlRNA干扰并在含有260µg/ml G418的完整培养基中选择。为了恢复Mist1表达，AR42J-Mist1RNA干扰细胞被pBrit或pBrit-Milt1感染急诊室病毒存在于8µg/ml聚brene中，并在含有0.8µg/ml嘌呤霉素的完整培养基中选择。
质体构筑
2.4 kb第21页CIP1/WAF1级启动子结构是Dimitris Kardassis的礼物22通过标准PCR程序将截短的p21启动子结构克隆到pGL2载体（Promega）中。p21−124/+3构造的Sp1位点内的点突变是使用Stratagene的QuickChange定点突变试剂盒生成的。米斯特1和第21页CIP1/WAF1级针对大鼠的RNAi序列薄雾1和第21页CIP1/WAF1级转录本是使用Oligoengine程序设计的，并克隆到pSuper载体（Oligoengine）中。
免疫组织化学
石蜡包埋胰腺切片如前所述进行处理20在4°C下与一级抗体孵育过夜，然后与生物素化二级抗体孵育过夜。主要抗体包括兔抗Mist1（1:2000）、兔抗Myc（Santa Cruz A-14，1:100）、鼠抗β-gal（发育研究杂交瘤库，1:100，）和兔抗磷酸-H3（Upstate 06–570，1:200）。
RNA分离和实时RT-PCR
使用RNeasy Mini Kit（Qiagen）分离总RNA。使用缺血cDNA合成试剂盒（Bio-Rad）进行逆转录分析。PCR反应（20µl）包括SYBR绿色PCR主混合液（Applied Biosystems，10µl2O.热循环条件为50°C 2 min，95°C 10 min，然后在94°C下40次放大循环15 s，60°C或63°C下30 s，72°C下30s。每个基因靶的引物序列可根据要求提供。
染色质免疫沉淀分析
AR42J的产生和表征泰特-Mist1~IRES~BirA细胞系将在别处介绍（Jia和Konieczny，正在准备中）。用WT p21-124/+3或mut 1–4 p21-124/+3基因转染细胞，用1µg/ml四环素诱导Mist1表达。转染48小时后，用1%甲醛交联细胞，并在室温下摇晃培养10分钟。通过添加0.125 M甘氨酸阻止了交叉链接反应。通过在冰上添加1 ml细胞裂解缓冲液（50 mM HEPES，pH 7.9，1 mM EDTA，140 mM NaCl，10%甘油，0.5%NP-40，0.25%Triton X-100）进行核提取30分钟。收集细胞核并将其重新悬浮在750µl核裂解缓冲液中（50 mM-Tris-HCl，pH 8.0，10 mM-EDTA，1%SDS）。然后对细胞核进行三次超声处理，并使用可溶性细胞核部分进行染色质免疫沉淀。简言之，通过在4°C下将100µl蛋白G Sepharose在结合缓冲液（0.01%SDS、1.1%Triton-X 100、167 mM NaCl、16.7 mM Tris-HCl、pH 8.1）中培养1小时来预先分离裂解产物。在4°C下用20µl抗Myc抗体孵育预清除的裂解产物过夜。然后添加100µl蛋白G Sepharose，并持续培养1小时。洗涤结合蛋白/DNA复合物，并将其重新悬浮在添加0.195 M NaCl的TE缓冲液中。样品在65°C下反向交联过夜，并在56°C下用蛋白酶K消化4小时。使用Qiaquick PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化DNA，并用于基因特异性PCR。
下拉分析
AR42J公司泰特-BT/Mist1~IRES~BirA和AR42J泰特-用1µg/ml四环素诱导Mist1~IRES~BirA细胞48小时，并如前所述采集核提取物20100µg核蛋白与10µl链霉亲和素结合的Dynal珠（Invitrogen）在TBS-N缓冲液（10 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，0.3%NP-40）中在4°C下孵育2小时。样品用TBS-N缓冲液洗涤六次，并用SDS-PAGE进行分析，然后用Mist1和Sp1（Santa Cruz，1:1000）抗体进行免疫印迹。
结果
Mist1的异位表达导致生长抑制
先前的研究表明，Mist1在胰腺腺泡细胞中积累，在那里它控制着几种腺泡特异性功能18,23–26为了检测Mist1在非腺泡细胞中表达错误的影响，使用胰腺导管细胞系（ARIP）生成稳定克隆（ARIP泰特-Mist1）在四环素（tet）诱导后表达Mist1。ARIP公司泰特-Mist1细胞不表达内源性Mist1（数据未显示）或Mist1myc公司在没有tet的情况下保持转基因。然而，经过tet处理后，Mist1myc公司在第1天检测到(). 与未诱导的ARIP相比，Mist1的诱导导致菌落形成效率降低30%，总菌落大小降低65%泰特-Mist1或控制ARIP单元(). Mist1诱导也显著降低了ARIP的增长率泰特-雾1电池().
Mist1异位表达抑制胰腺细胞生长(一)ARIP公司泰特-第0天通过添加四环素（tet）诱导Mist1细胞，并每天采集全细胞提取物。使用抗myc进行免疫印迹检测Mist1myc公司. (B、 C类)家长ARIP和ARIP泰特-Mist1细胞培养+/-tet 2周，对菌落进行染色和定量。数值代表3个独立实验±标准差的平均值(D类)ARIP或ARIP泰特-按照指示对Mist1细胞进行+/−tet处理，并在5天内测定细胞数量。每个时间点对应于3个独立实验的平均值（±s.d.）。
为了探讨Mist1发挥其抗增殖作用的机制，我们接下来分析了接受或不接受tet治疗的细胞中关键细胞周期调节因子的表达。尽管p27、细胞周期蛋白D和细胞周期蛋白A水平保持不变，p21CIP1/WAF1级tet处理的细胞蛋白质水平增加了约3倍(). 实时RT-PCR证实第21页CIP1/WAF1级在表达Mist1的细胞中转录水平升高，而在细胞周期蛋白D,细胞周期蛋白E,第16页,第18页,第27页，或第57页转录水平(). 确定p21是否升高CIP1/WAF1级Mist1诱导的生长抑制所需的水平，我们生成了ARIP泰特-雾1-p21RNA干扰内源性第21页CIP1/WAF1级水平被“击倒”第21页CIP1/WAF1级shRNA(). 尽管tet治疗导致Mist1表达的预测诱导，p21CIP1/WAF1级p21中仍检测不到水平CIP1/WAF1级shRNA株(). 有趣的是，诱导的Mist1表达并不影响ARIP的生长特性泰特-雾1-p21RNA干扰单元格()，确认p21CIP1/WAF1级Mist1需要表达才能诱导生长抑制。
Mist1通过诱导p21抑制细胞增殖CIP1/WAF1级(A、 B类)ARIP细胞周期调节因子的免疫印迹泰特-雾1电池+/-测试。(C类)ARIP的实时RT-PCR分析泰特-Mist1细胞处理+/-tet。(D类)ARIP的免疫印迹泰特-雾1-p21RNA干扰显示p21的细胞系CIP1/WAF1级tet（箭头，Mist1蛋白；星号，非特异性带）存在或不存在时无法检测到蛋白质水平。(E类)控制和ARIP泰特-雾1-p21RNA干扰对细胞株进行+/-tet处理，并在5天内测定细胞数量。每个时间点对应于3个独立实验的平均值（±s.d.）。
内源性Mist1的敲除导致细胞增殖增加和p21降低CIP1/WAF1级水平
协调归纳法第21页CIP1/WAF1级具有薄雾1表达表明Mist1通过转录激活第21页CIP1/WAF1级基因。为了验证这一假设，我们使用了第二种胰腺细胞系AR42J，它具有腺泡细胞特征并积累内源性Mist1蛋白(). AR42J-喷雾1RNA干扰生成稳定的细胞系，其中内源性薄雾1转录水平被一种专门针对大鼠的shRNA转录物击倒薄雾1基因。如所示，的表达式薄雾1RNAi使Mist1蛋白水平降低80%，而非特异性对照RNAi没有影响。重要的是，薄雾1RNAi还导致p21的减少CIP1/WAF1级蛋白质水平(). 如预期，雾1和p21减少CIP1/WAF1级与对照RNAi细胞相比，该水平允许更高的增殖率和更短的细胞周期时间(;补充表一). 内源性Mist1的敲除导致G1的长度显著减少，表明米斯特1表达主要影响G1细胞周期蛋白/CDK复合物的活性。作为最后的测试，非目标形式的Mist1（鼠标Mist1急诊室)引入AR42J-Mist1RNA干扰病毒感染引起的细胞(). 正如预测的那样，异位米斯特1表达恢复了对AR42J-Mist1的生长限制RNA干扰单元格()，确认AR42J-Mist1的超高产RNA干扰细胞是由于雾1水平的降低。
shRNA-定向敲除内源性Mist1导致p21降低CIP1/WAF1级水平和增加的扩散(一)AR42J-对照的免疫印迹RNA干扰和AR42J-Mist1RNA干扰细胞株显示内源性薄雾1转录本导致减少第21页CIP1/WAF1级水平。(B类)AR42J-Control的生长分析RNA干扰和AR42J-Mist1RNA干扰细胞。(C类)AR42J-Mist1的免疫荧光RNA干扰感染pBrit或pBrit-mMist1的细胞急诊室病毒。pBrit-List1的90%急诊室细胞对Mist1呈强阳性或弱阳性（闭合箭头）急诊室而仍有少量细胞残留在Mist1急诊室负值（打开箭头）。（D） AR42J-Mist1的增长分析RNA干扰感染pBrit或pBrit-mMist1的细胞急诊室病毒。每个时间点对应于3个独立实验的平均值（±s.d.）。
Sp1位点对Mist1-induced p21至关重要CIP1/WAF1级转录
Mist1影响胰腺细胞生长和第21页CIP1/WAF1级基因表达表明Mist1与靶基因的调控区结合以控制其转录表达。为了验证这一假设，我们检测了Mist1是否可以激活含有−2.4 kb的p21-luc报告基因第21页CIP1/WAF1级发起人(). 如所示，Mist1和p21-luc的联合转染使第21页CIP1/WAF1级启动子活性。序列分析显示，−2.4 kb启动子内共有16个E-box调控元件，可作为潜在的Mist1结合靶点(). 为了消除大多数位点，我们接下来生成了包含1个电子盒（E3）的−194/+3构建体，以及不包含电子盒的−124/+3和−44/+3构建体(). Mist1完全诱导了−194/+3和−124/+3基因的表达，而−44/+3启动子区域保持转录不活跃(). 因此，Mist1诱导表达所需的必要调控元件位于−124和−44近端区域。令人惊讶的是，这个80 bp的序列缺少一个推测的Mist1结合位点（E-box）。
Sp1结合位点对Mist1诱导的p21至关重要CIP1/WAF1级表达(一)全长和截断的示意图第21页CIP1/WAF1级启动子荧光素酶基因构建。接线盒（E1–E16）代表电子接线盒站点。(B类)将对照pcDNA或pcDNA-Mist1表达质粒与指示的p21-luc启动子基因共同转染到AR42J细胞中，并对p21-luc活性进行量化。(C类)WT和突变的−124/+3 p21-luc结构的示意图。开盒：WT Sp1结合位点（1-6）。实心盒：突变的Sp1结合位点。(D类)Sp1结合位点1-4对Mist1活性至关重要。对照pcDNA或pcDNA-Mist1表达质粒与指示的−124/+3 p21-luc启动子构建物共同转染到AR42J细胞中，并对p21-lux活性进行量化。(E类)用相应的质粒转染细胞，并进行荧光素酶分析。免疫印迹显示Mist1和Sp1的表达水平。Mist1和Sp1协同激活−124/+3 p21-luc报告基因。中的值B类,D类,E类是3个或更多独立实验的平均值（±s.d.）。
−124/+3的进一步分析第21页CIP1/WAF1启动子区域显示了6个与第21页CIP1/WAF1级转录表达22为了确定其对Mist1诱导转录的重要性，将点突变引入每个Sp1结合位点(). 荧光素酶分析显示，Sp1位点1-4的突变显著降低了Mist1诱导的表达(). 当位点1-4同时突变（mut1-4）时，Mist1-induced activity被完全消除。作为进一步的测试，分别测试了Sp1和Mist1以及−124/+3 p21-luc报告基因。正如预期的那样，Mist1和Sp1分别诱导截断的第21页CIP1/WAF1发起人()尽管由于从该表达质粒获得的Sp1水平较低，因此对Sp1的反应很小。然而，Mist1和Sp1的共同转染导致协同活化()表明这两种转录因子一起显著升高第21页CIP1/WAF1表达。
Mist1:Sp1复合物与p21结合CIP1/WAF1级近端启动子
我们的研究支持Mist1与Sp1相互作用以诱导转录激活第21页CIP1/WAF1级为了直接检查这一点，我们使用含有tet-inducible Mist1的AR42J细胞进行了改良的联合免疫沉淀分析myc公司或一种tet-inducible biotionalited Mist1myc公司（BT-列表1myc公司)蛋白质。在tet诱导后，收集核提取物，并使用链霉亲和素结合珠进行“下拉”分析(). 如预期，内源性Mist1蛋白与BT-Mist1共同纯化myc公司确认Mist1形成同二聚体体内 20,21有趣的是，内源性Sp1也与BT-Mist1共同纯化myc公司首次揭示胰腺腺泡细胞中存在Mist1:Sp1复合物。
Mist1:Sp1复合物与p21相关CIP1/WAF1级发起人(一)表达tet-inducible Mist1的AR42J细胞myc公司（M） 或生物素化雾1myc公司（BT）用四环素诱导，核提取物用链霉亲和素结合珠进行下拉试验。Sp1与BT-Mist1联合净化myc公司.（B）AR42J公司tet公司-对Mist1细胞进行+/-tet处理，并使用内源性第21页CIP1/WAF1级, β-肌动蛋白和微管蛋白发起人。数值为3个或更多独立实验的平均值（±s.d.）。(C类)AR42J公司泰特-使用Mist1细胞将WT−124/+3 p21-luc或mut 1–4−124/+3 p21-luc基因构建导入细胞。使用−124/+3侧翼区特异性引物对Mist1 ChIP产物进行实时PCR第21页CIP1/WAF1级发起人。Mist1明确限制了WT第21页CIP1/WAF1级启动子而非突变第21页CIP1/WAF1级发起人。数值为3个独立实验的平均值（±s.d.）。
Mist1与Sp1相互作用并激活的能力第21页CIP1/WAF1级基因表达表明Mist1:Sp1蛋白复合物必须与内源性第21页CIP1/WAF1级基因启动子。为了验证这个假设，我们接下来使用我们的tet-inducible Mist1细胞系和基因特异性引物进行染色质免疫沉淀（ChIP）分析。如所示，Mist1与近端AR42J结合第21页CIP1/WAF1级与−tet样品相比，+tet组的启动子增强了3倍。相反，控制基因(肌动蛋白,微管蛋白)未显著富集。重要的是，Mist1与第21页CIP1/WAF1级启动子完全依赖于完整的Sp1结合位点。鉴于第21页CIP1/WAF1级启动子-Mist1复合物很容易被ChIP检测到，当Sp1位点被破坏时，没有复合物被免疫沉淀(). 我们的结论是第21页CIP1/WAF1级是Mist1的直接靶点，Sp1位点是与近端启动子相互作用所必需的。
Mist1缺失导致外分泌胰腺腺泡细胞增殖增加
我们的研究表明，Mist1通过诱导第21页CIP1/WAF1级因此，可以预测p21CIP1/WAF1Mist1的存在与否同样会影响完整胰腺的水平和细胞数量。为了检验这一点，我们首先分析了p21的蛋白质水平CIP1/WAF1级野生型（WT）和薄雾1击倒对手胰腺18.如预期，删除薄雾1导致p21水平下降CIP1/WAF1级(补充图1). WT和WT中胰腺腺泡细胞的定量薄雾1击倒对手老鼠透露成年老鼠薄雾1击倒对手与对照WT同窝仔相比，胰腺腺泡细胞含量总是高出2倍(). 详细分析显示薄雾1击倒对手3周龄时的腺泡细胞，KO/WT细胞比率为1.2(补充表二). 然而，随着动物年龄的增长，KO/WT比率增加，因此增加了3个月薄雾1击倒对手胰腺的腺泡细胞数量是对照组的两倍。腺泡细胞增加薄雾1击倒对手胰腺是由于增殖率增加，而不是由于WT样本中的细胞丢失（数据未显示）。这一点通过抗磷酸化H istone 3（p-H3）免疫组织化学证实，其中薄雾1击倒对手胰腺腺泡细胞增殖指数升高(;补充表二). 有趣的是，第21页CIP1/WAF1级空白胰腺腺泡细胞数量也有类似增加(补充图2)支持Mist1和p21的假设CIP1/WAF1级是腺泡细胞生长的关键调节器。
迷雾1击倒对手胰腺腺泡细胞增殖指数增加(A、 B类)WT和薄雾1击倒对手用Mist1或β-半乳糖抗体检测腺泡细胞，对窝友进行IHC。(C、 D类)抗p-H3 IHC显示薄雾1击倒对手与WT样品相比，腺泡细胞表现出更高的细胞增殖指数。(E、 F类)WT和米斯特1击倒对手用p-H3抗体和苏木精-伊红染色法对窝友进行IHC，以鉴定含有酶原颗粒的腺泡细胞。
Mist1的表达myc公司胰腺外分泌导致腺泡细胞增殖指数降低
我们的在体外实验表明，Mist1控制了胰腺细胞的生长潜能。测试是否可以观察到类似现象体内，我们利用了El公司公共关系-薄雾1myc公司腺泡细胞表达a的小鼠薄雾1myc公司转基因自弹性蛋白酶发起人(). 穿越El公司公共关系-薄雾1myc公司将基因转入薄雾1击倒对手line恢复了作为WT胰腺标志的正常腺泡特异性生长抑制(). 类似地，WT小鼠表达薄雾1myc公司与缺乏转基因的对照窝友相比，其增殖指数更低(). 这些结果，结合我们的在体外研究支持Mist1通过诱导第21页CIP1/WAF1级.
雾的表达1myc公司转基因导致腺泡细胞增殖降低(A、 B类)WT和El公司公共关系-薄雾1myc公司对转基因同窝出生的配偶进行IHC检测薄雾1myc公司蛋白质（箭头）。(C类)胰腺切片来自薄雾1击倒对手,薄雾1击倒对手/El公司公共关系-薄雾1myc公司、重量和重量/El公司公共关系-米斯特1myc公司使用抗p-H3抗体对窝友进行IHC试验。每个值对应于10个或更多部分的平均值。
讨论
胰腺细胞谱系的规范由在促进分化和控制细胞生长中发挥重要作用的关键转录因子协调。必须仔细调节内分泌和外分泌室的细胞数量，以确保器官的正常功能，因为细胞量的调节不当往往会导致胰腺疾病。β细胞团的维持或扩张缺陷可导致糖代谢受损和糖尿病27，而外分泌胰腺的生长控制不当通常与胰腺炎和胰腺癌有关28,29虽然最近的研究表明胰腺的总体大小由胚胎祖细胞的初始数量控制30，关于成人外分泌胰腺中细胞增殖事件是如何调节的，目前知之甚少。
在这项研究中，我们探讨了Mist1是否有助于维持适当的腺泡细胞群。我们发现了薄雾1击倒对手胰腺腺泡细胞数量增加，腺泡细胞增殖指数升高。腺泡特异性表达薄雾1myc公司转基因导致增殖能力下降。正如所预测的那样，Mist1在胰腺细胞系中的异位表达也会导致较低的增殖率，这与诱导第21页CIP1/WAF1级基因表达。Mist1的生长抑制作用完全取决于第21页CIP1/WAF1级，表明Mist1控制第21页CIP1/WAF1级转录。事实上，染色质免疫沉淀和报告基因分析证实Mist1转录激活第21页CIP1/WAF1级基因表达。自第21页起CIP1/WAF1级是一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，用于阻止细胞周期31，我们认为Mist1通过诱导p21来控制腺泡细胞增殖CIP1/WAF1级.
bHLH转录因子激活基因转录的经典机制是通过与位于靶启动子近端区域的E-box序列结合。我们的结果显示第21页CIP1/WAF1级Mist1的启动子与E-box序列无关。事实上，近端Ebox位点E1–E3的突变并未导致Mist1依赖性启动子活性的显著改变（数据未显示）。相反，我们的分析确定了四个对第21页CIP1/WAF1级表达式。先前的研究表明，Sp1是第21页CIP1/WAF1级转录，不仅仅是通过激活第21页CIP1/WAF1级基因转录，也可以作为包括Smad蛋白在内的其他转录激活物和/或阻遏物的对接位点32，c-6月33和c-Myc34在这项研究中，我们发现类似的机制与Mist1在腺泡细胞中起作用。事实上，共免疫沉淀和ChIP实验揭示了一种常见的Mist1:Sp1复合物与第21页CIP1/WAF1级启动子，支持Mist1激活的假设第21页CIP1/WAF1级通过Sp1转录。这些结果为研究组织限制因子（Mist1）如何影响胰腺腺泡细胞中普遍存在的细胞周期机制的激活提供了一个独特的视角。
Mist1的调节能力第21页CIP1/WAF1级表达和细胞增殖使人想起其他bHLH转录因子的活性，如ptf1a/p48和MyoD35,36除了它们分别在胰腺和肌肉发育中的重要作用外，这些蛋白质还通过激活第21页CIP1/WAF1级基因。其他研究表明，其他bHLH转录因子，包括成骨细胞中的E1237，神经元细胞中的NeuroD38和肌细胞中的肌生成素39，通过激活细胞周期素依赖性激酶抑制剂基因的转录参与调节细胞生长。因此，bHLH超家族成员通常通过抑制细胞增殖来控制终末分化事件。然而，Mist1调节第21页CIP1/WAF1级基因表达的机制不同于其他bHLH蛋白。Mist1控件不是直接绑定到E-box序列第21页CIP1/WAF1级通过与普遍表达的转录因子Sp1结合进行转录。
Mist1的抗增殖活性与其作为外分泌性胰腺疾病（如胰腺炎和胰腺癌）发展的守门人的功能相关。例如，米斯特1击倒对手小鼠对蓝绿色素诱导的胰腺炎过敏19最近的研究表明，Mist1对控制胰腺导管腺癌（PDA）的发展也至关重要。虽然PDA被认为起源于导管细胞喀斯特致癌基因40几项研究表明，腺泡细胞也可参与PDA的前病变，称为胰腺上皮内瘤变（PanIN）41–43这个过程包括沉默腺泡特异性基因表达(淀粉酶，薄雾1)，打开导管特异性基因(角蛋白19)激活细胞周期机制。在异质性腺泡导管化生单位中，保持Mist1阳性的腺泡细胞生长受阻，而表现导管表型的细胞为Mist1阴性且高度增殖42激活Mist1表达细胞内的Kras通路可导致PanINs的快速形成，但在薄雾1击倒对手背景（L.Zhu、G.Shi和S.Konieczny，未发表的数据）。这些发现表明，Mist1也可能是一个关键的抗癌因子。未来的研究将旨在阐明影响正常胰腺功能和疾病状态下Mist1活性的调节途径。
补充材料
01
补充图1:薄雾1击倒对手胰腺降低p21CIP1/WAF1级蛋白质水平。从4周的WT和薄雾1击倒对手胰腺。使用抗p21抗体进行免疫印迹CIP1/WAF1级和抗β-肌动蛋白。
02
补充图2:第21页击倒对手与对照窝鼠相比，小鼠胰腺腺泡细胞数量增加。第21页击倒对手和对照组小鼠胰腺的腺泡细胞数/面积如文中所述。
03
补充表一:敲除Mist1导致细胞倍增和G1倍缩短根据细胞生长曲线计算细胞倍增时间。通过AR42J-Control的FACS分析确定每个细胞周期阶段的长度RNA干扰和AR42J-Mist1RNA干扰细胞。
补充表二:薄雾1击倒对手腺泡细胞数量和细胞增殖指数增加在来自WT和薄雾1击倒对手指定年龄的室友。p-H3阳性腺泡细胞的百分比通过将p-H3细胞的数量除以每个区域的腺泡细胞总数来确定。每个数字对应于10张独立幻灯片的平均值。
致谢
我们感谢Dimitris Kardassis提供第21页CIP1/WAF1级启动子构建体，用于产生pcDNA4-TO-Mist1-Myc/His的Michael Collingswood，以及用于产生本研究中使用的小鼠系的Judy Hallett和普渡转基因小鼠核心设施。
赠款支持：这项工作得到了国家卫生研究院（DK55489，CA124586）、国防部（BC043093）和卢斯特加滕胰腺研究基金会（Lustgarten Foundation for Pancreat Research）对S.F.K.的资助。D.J.得到了普渡研究基金会研究生奖学金的支持。
脚注
出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们提供这份手稿的早期版本。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。
不存在利益冲突
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