癌症研究。作者手稿；PMC 2011年4月1日提供。
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NIHMSID公司：美国国家卫生研究院174575
microRNA靶位点内的单核苷酸多态性对肿瘤敏感性的影响
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米莱娜·尼科洛索
*德克萨斯大学安德森癌症中心实验治疗学系，美国德克萨斯州休斯顿，邮编77030
郝孙
$中国香港特别行政区新界沙田香港中文大学化学病理学系李嘉诚健康科学研究所
†美国宾夕法尼亚州费城威斯塔研究所系统与计算生物学、分子与细胞致癌计划中心，邮编：19104
里卡多·斯皮佐
*德克萨斯大学安德森癌症中心实验治疗学系，美国德克萨斯州休斯顿，邮编77030
金贤秀
†美国宾夕法尼亚州费城威斯塔研究所系统与计算生物学、分子与细胞致癌计划中心，邮编：19104
普里扬卡拉·维克拉马辛格
†美国宾夕法尼亚州费城威斯塔研究所系统与计算生物学、分子与细胞致癌计划中心，邮编：19104
清水Masayoshi Shimizu
*德克萨斯大学安德森癌症中心实验治疗学系，美国德克萨斯州休斯顿，邮编77030
西尔维娅·沃伊西克
†俄亥俄州立大学综合癌症中心，美国俄亥俄州哥伦布43210
贾娜·费尔丁
*德克萨斯大学安德森癌症中心实验治疗学系，美国德克萨斯州休斯顿，邮编77030
#卢布尔雅那大学生物技术学院动物科学系，斯洛文尼亚Domzale 1230
Tanja Kunej先生
#卢布尔雅那大学生物技术学院动物科学系，1230 Domzale斯洛文尼亚
肖连春
##美国德克萨斯州休斯顿市德克萨斯大学安德森癌症中心定量科学部，邮编77030
Siranoush Manoukian公司
§意大利米兰国家肿瘤研究所预防和预测医学基金会IRCCS医学遗传学部，20133
乔治·塞克托
¶意大利米兰国家肿瘤研究所预防和预测医学部激素研究实验室，Fondazione IRCCS，20133
费尔南多·拉瓦格尼
**意大利米兰国家肿瘤研究所Fondazione IRCCS诊断病理和实验室部免疫血液学和输血医学服务部，20133
王雪梅
##美国德克萨斯州休斯顿市德克萨斯大学安德森癌症中心定量科学部，邮编77030
保罗·拉迪斯
††意大利米兰国家肿瘤研究所，Fondazione IRCCS，实验肿瘤和分子医学系，癌症遗传易感性研究室，20133
§§IFOM，FIRC分子肿瘤研究所基金会，20139，意大利米兰
卡洛·克罗斯
†俄亥俄州立大学综合癌症中心，美国俄亥俄州哥伦布43210
拉马纳V.达武卢里
†美国宾夕法尼亚州费城威斯塔研究所系统与计算生物学、分子与细胞致癌计划中心，邮编：19104
乔治·A·卡林
*德克萨斯大学安德森癌症中心实验治疗学系，美国德克萨斯州休斯顿，邮编77030
*德克萨斯大学安德森癌症中心实验治疗学系，美国德克萨斯州休斯顿，邮编77030
$中国香港特别行政区新界沙田香港中文大学化学病理学系李嘉诚健康科学研究所
†美国宾夕法尼亚州费城威斯塔研究所系统与计算生物学、分子与细胞致癌计划中心，邮编：19104
†俄亥俄州立大学综合癌症中心，美国俄亥俄州哥伦布43210
#卢布尔雅那大学生物技术学院动物科学系，斯洛文尼亚Domzale 1230
##美国德克萨斯州休斯顿市德克萨斯大学安德森癌症中心定量科学部，邮编77030
§意大利米兰国家肿瘤研究所（Istituto Nazionale Tumori）IRCCS基金会预防和预测医学部医学遗传学部，20133年
¶激素研究实验室，预防和预测医学系，IRCCS基金会，国家肿瘤研究所，20133，意大利米兰
**意大利米兰国家肿瘤研究所Fondazione IRCCS诊断病理和实验室部免疫血液学和输血医学服务部，20133
††意大利米兰国家肿瘤研究所，Fondazione IRCCS，实验肿瘤和分子医学系，癌症遗传易感性研究室，20133
§§IFOM，FIRC分子肿瘤研究所基金会，20139，意大利米兰
||Milena S.Nicoloso和Hao Sun为这项工作做出了同等贡献
- 补充资料
1
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10
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三。
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9
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摘要
与多基因疾病（如乳腺癌）相关的单核苷酸多态性（SNPs）可以产生、破坏或修饰微小RNA（miRNA）结合位点；然而，单核苷酸多态性在多大程度上干扰了miRNA基因的调控，并影响了癌症的易感性，这在很大程度上尚不清楚。我们假设SNPs破坏miRNA靶结合是与癌症易感性相关的广泛机制。为了验证这一点，我们分析了已知与BC风险相关的SNP，生物信息学和在体外，因为它们能够修改miRNA结合位点和miRNA基因调控，并将其称为靶SNP。我们确定rs1982073-TGFB1和rs1799782-XRCC1为目标SNP，其等位基因可以通过与miR-187型和miR-138型分别是。全基因组生物信息学分析预测，约64%的转录SNP为靶SNP，可以修改（增加/减少）假定miRNA:：mRNA双工体的结合能90%以上。为了评估靶SNP是否与BC敏感性有关，我们进行了一项病例对照人群研究，观察到rs799917-BRCA1和rs334348-TGFR1的种系发生率在具有不同BC发病风险的人群中存在显著差异。靶SNP等位基因变异体的荧光素酶活性和不同基因型癌细胞系中的蛋白水平在两种相互作用的miRNAs过度表达后显示出靶基因的差异调节(miR-638基因和miR-628-5p). 因此，我们认为转录的靶SNP通过一种新的精细基因调控机制改变miRNA基因调控，进而改变蛋白质表达，从而增加癌症易感性的可能性。
关键词：单核苷酸多态性、microRNA、mRNA、BC、肿瘤易感性
简介
MiRNAs是一个内源性、短的非编码RNA家族，调节转录后基因调控。它们通过结合主要位于3′非翻译区（UTR）的完整或部分互补序列，以及相应信使RNA（mRNAs）的编码序列（CDS）和5′UTR内的互补序列，对蛋白编码基因（PCG）的表达发挥调节作用。最终，这会影响mRNA的稳定性和翻译(1–三). miRNA在人类癌症发病机制中的作用已经通过鉴定miRNA基因座的遗传改变、定义不同肿瘤表型的miRNA表达特征以及作为miRNA靶点的许多致癌基因和抑癌基因而得到了很好的证实(4).
影响癌症易感性的种系变异的发现是目前研究的热点(5). 最常见的变异是单核苷酸多态性（SNP），它在人类基因组中大约每100到300个碱基对发生一次，为揭示人类癌症发病机制、临床过程和治疗反应的异质性提供了巨大的信息来源。一些研究小组已经研究了候选基因中SNP与癌症风险的相关性，估计大约有50000-25000个SNP，大多位于25000个PCG中或其附近，具有假定的生物学效应(6). SNP可以通过改变氨基酸序列（非同义SNP）或干扰其调节（例如影响启动子活性）来影响蛋白质功能(7)，拼接过程(8)以及DNA和前mRNA构象）。当SNP出现在3′UTR中时，它们可能通过改变聚腺苷酸化、蛋白质：：mRNA和miRNA:：mRNA调节相互作用来干扰mRNA的稳定性和翻译。最近的研究发现3′UTR单核苷酸多态性通过miRNA基因调控影响PCG在不同疾病中的表达(9–14). 这些实验证据使我们假设，位于5′UTR、CDS或3′UTR的SNP破坏miRNA靶结合是导致癌症易感性和发生的普遍机制。为了支持我们的假设，Slack小组最近显示let-7靶点增加了中度吸烟者患非小细胞肺癌的风险(15). 此外，由于未对PCG的3′UTR进行足够的突变/多态性筛查，因此这种异常的程度可能远大于最初的预测。
乳腺癌（BC）是女性最常见的恶性肿瘤之一，每年新诊断100多万例(16). 人们普遍认为，大多数BC风险可能是由多个低遗传率等位基因的组合产物决定的（有关综述，请参阅(17)); 然而，迄今为止发现的多种变异不能解释约80%的家族性BC病例，这些病例与高外显率BC易感基因无关。位于BC相关基因的多态性变异体在肿瘤易感性中的作用已被广泛讨论((18,19)和补充表S1). 然而，在研究基因组变异对BC敏感性的致病意义的报告中，没有一份评估了SNP在miRNA:：mRNA基因调控中的作用及其在BC发育中的作用。
在此，我们分析了与BC敏感性相关的SNP影响miRNA结合位点和miRNA:：mRNA基因调控的能力。我们确定了SNP依赖性miRNA相互作用，这可能解释了已知BC相关SNPs的发病相关性。我们对PCG转录区（3′UTR、CDS和5′UTR）内可能改变miRNA结合（称为靶SNP）的SNP进行了全基因组扫描。最后，我们说明了靶SNP对miRNA调节蛋白质表达的功能性后果，以及由于家族性BCs、散发性BCs和对照组之间的频率分布差异，它们可能的临床意义。
方法
数据来源
我们从NCBI build 36数据库（版本13.0）中获得了成熟的人类miRNA序列（共885个）。我们从HapMap（Release 21A）下载了SNP数据。我们从UCSC中检索到5′UTR、3′UTR和CDS mRNA基因组位置(http://genome.ucsc.edu/)已知基因表（人类基因组组装，NCBI构建36，hg18）。
miRNA:：SNP相互作用分析
对于每个SNP，我们检索到2个序列，以每个等位基因为中心，两侧各有25个核苷酸。我们使用了miRNA靶预测程序miRanda(2)使用两种不同的截止值（得分≥80，MFE≤−16Kcal/mol和得分≥50，MFE≤−5Kcal/mol）来计算所有可能的以miRNA:：SNP为中心的序列的最小自由能（MFE）。对于所有预测的相互作用，我们计算了等位基因依赖的MFE变化。根据MFE变化的分布，我们确定了miRNA:：target SNP识别的20%和80%阈值(). 基于这些计算，我们将SNP等位基因称为活性或非活性等位基因，活性等位蛋白是导致MFE降低和与靶点结合更强的miRNA的变体。
miRNA的全基因组鉴定：靶SNP相互作用用于miRNA和SNP相互作用分析的综合生物信息学策略的示意图概述。8%的MFE绝对变化对应于从MFE变化分布中获得的20%和80%的阈值(补充图S2).
患者样本采集
在意大利米兰国立肿瘤研究所（INT）收集了家族性和散发性BC患者的血液样本以及对照组受试者的血液样本，并获得了他们的知情同意。使用QIAamp®DNA迷你试剂盒（Qiagen）从外周血白细胞中纯化总基因组DNA。
乳腺癌相关SNP的筛选
我们使用MedLine/PubMed数据库进行了文献检索(20)涵盖2006年1月至2008年12月的时间，以检索报告SNP与BC风险之间关联研究的论文。我们选择了一篇或多篇论文和/或大规模全基因组关联研究中证实与BC风险相关的SNP。补充表S1显示了用于后续miRanda分析的SNP的初始列表。
DNA测序和SNP克隆
对基因组DNA（铂Taq高保真；Invitrogen）进行转录SNP区的PCR扩增。可根据要求提供底漆。在应用生物系统3730 DNA分析仪（应用生物系统）上使用BigDye终止反应化学v3.1进行序列测定。所有序列分析和比对均使用SeqmanPro程序Lasergene 7.1版（DNASTAR）进行。PCR扩增的携带活性或非活性等位基因的SNP区域被XbaI克隆到pGL3控制载体（Promega）的3′UTR中。
细胞培养、转染和免疫印迹
所有细胞系均由ATCC获得。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染细胞。总蛋白提取物在0.5%NP40裂解缓冲液中制备。对于免疫印迹，蛋白质提取物在4%至20%的SDS-PAGE（标准预涂凝胶；Bio-Rad）中分离，并转移到硝化纤维素膜（Bio-Rad）中。TGFB、TGFBR1和XRCC1的抗体来自细胞信号；来自Calbiochem的BRCA1（克隆MS110）和来自Santa Cruz的Vinculin（克隆N-19）。使用GelDoc XR软件（Biorad）量化色带。
荧光素酶检测
MCF7电池（200×105每24孔细胞数）联合转染0.4ug pGL3（荧光素酶）、0.08ug pRLTK（肾小球）（Promega）和50nM前体miRNA分子或干扰阴性对照（Ambion）。转染30小时后，根据双荧光素酶报告物分析方案（Promega）和用Veritas光度计（Turner BioSystems）测量的荧光素酶活性，在100ul被动裂解缓冲液中对细胞进行裂解。
统计分析
Fisher精确检验用于确定SNP与患者疾病状态的相关性。Cochran-Armitage趋势检验用于调查癌症患者的二项式比例（分别为熟悉+零星、熟悉或零星）在每个SNP的不同基因型水平上是否存在趋势。单变量和多变量logistic回归模型适合评估SNP基因型与患者状态的相关性。
其他方法包括患者信息、统计分析、RNA提取、逆转录和实时PCR，可在补充材料.
结果
BC易感性等位基因影响miRNA结合能力的分析
为了验证我们的假设，即SNP可以通过改变miRNA:：mRNA结合来影响BC敏感性，我们利用了已知与BC相关的遗传变异（参见方法和补充表S1). 对于每个SNP，我们检索到两个51个核苷酸长的序列，一个以普通等位基因为中心，另一个以变异等位基因为主。我们用miRanda扫描了检索到的序列(2)搜索miRNA:：mRNA靶位点并计算等位基因变体引起的MFE变化(补充表S2). 我们观察到等位基因变体可以增加或减少相应RNA双链的MFE，从而分别导致miRNA:：mRNA结合增强或减弱。此机制还可能导致创建新的绑定站点或销毁现有的目标站点。我们只关注那些miRNA（包括补充表S2)在BC样本和细胞系中表达(补充图S1和数据未显示），并选择3个候选靶SNP进行功能验证，共16个miRNA:：SNP相互作用(补充表S3). 16个相互作用中有两个是阴性对照，其中相互作用的miRNA结合没有被SNP等位基因变异体修饰。为了验证所选的BC-associated SNP是否真的能影响miRNA结合，我们进行了在体外荧光素酶报告分析。对于每个SNP，我们生成了两个pGL3-SNP结构()携带活性或非活性等位基因，并与预测的相互作用miRNAs或干扰阴性对照物并行共转染。TGFB1内的rs1982073和XRCC1内的rs1799782()在以下方面显示出统计上显著的影响miR-187型和miR-138型活动，分别(和). 通过miRanda分析预测TGFB1的rs1982073[C]活性等位基因，为miR-187型，在使用严格设置时，更常见的[T]变体没有这种功能。荧光素酶试验显示miR-187型在携带[C]活性等位基因的结构上，[T]非活性等位蛋白完全缺失（荧光素酶活性降低40%，p=0.006）(，左侧面板）。这与miRNAs对基因表达具有抑制作用的主要证据一致。相反，根据miRanda的预测，rs1799782-XRCC1[T]是增加细胞结合能的活性等位基因miR-138型与[C]变体相比。什么时候？miR-138型用pGL3-rs1799782-XRCC1构建物进行分析，我们观察到[T]等位基因的荧光素酶活性比[C]等位蛋白显著增加（增加34%，p=0.0003）(，右侧面板）。这清楚地表明，对于miR-138型与rs1799782-XRCC1[T]变体的结合力更强。
BC-associated target SNPs影响miRNA基因调控(一)米兰达预测。#表明没有发现具有默认阈值的特异性miRNA:：SNP相互作用（MFE<-16，得分>80）。(b)荧光素酶报告子结构的示意图，包含miRNA结合位点内的靶SNP及其对miRNA相互作用的影响。(c（c）)顶部，对于选定的SNP，miRNA:：mRNA相互作用显示为活动等位基因（绿色）或非活动等位蛋白（红色）突出显示。BC-associated SNP与预测的相互作用miRNA或干扰阴性对照共转染pGL3-SNP构建物的荧光素酶活性（=1）；值表示在六个重复中进行的3到5个独立实验的平均+/-标准偏差。(d日)TGFB1（左）和XRCC1（右）的WBmiR-187型和miR-138基因分别在携带不同rs1982073-TGFB1和rs1799782-XRCC1变体的细胞系中进行转染。基因型显示在免疫印迹的顶部；以下是报告的TGFB1和XRCC1表达水平归一化文丘里蛋白水平，并与每个细胞系的打乱阴性对照转染（=1）进行比较。
表1
已确定的乳腺癌常见易感性单核苷酸多态性被证明影响miRNA结合。
| SNP公司 | 基因 | 位置 | 染色体 | 人口 | 病例/对照数量 | 裁判 | 笔记 | 基因型和BC风险 | 比值比（95%CI；p） |
|---|
| 1982073卢比(电话+29C) | TGFB1型 | Exonic（错义；Leu10Pro） | 19（问题13.2） | 欧洲（荷兰） | 143/3,646 | [27] | | CC承运人增加了BC的风险 | 1.4（1.1–2.0；p=0.04） |
| 欧洲的 | 3,987/3,867 | [28] | TGFB1前体变异体由细胞分泌更高 | CC与T-携带者（Pro/Pro与Leu携带者）增加了BC风险 | 1.21（1.05–1.37；p=0.01） |
| rs1799782（580摄氏度>温度） | XRCC1公司 | Exonic（错义；Arg194Trp） | 19（问题13.31） | 混合种族（荟萃分析） | 4,933/6,775 | [22] | 乳腺癌和其他癌症 | TT+CT与CC携带者（Trp/Trp+Arg/Trp与Arg/Arg携带者）的BC风险较低 | 0.89 (0.81–0.98) |
| 混合种族（护士健康研究） | 1,004/1,385 | [35] | 与乳腺癌风险和类胡萝卜素水平的关系 | Trp携带者患BC的风险略低，与高类胡萝卜素水平相关的风险明显较低 | 0.79（0.60–1.04）单独和0.32（0.16–0.61；p=0.003）高类胡萝卜素水平 |
| 美国人 | 502/502 | [36] | 绝经后妇女 | 绝经后妇女中Trp携带者的BC风险较低 | 0.62（0.40–0.95；p<0.05） |
随后，我们通过转染相互作用的miRNAs，测试了这两个靶SNP对携带不同SNP基因型的癌细胞系内源性TGFB1和XRCC1蛋白水平的影响。miR-187与荧光素酶结果一致，携带[CC]rs1982073活性等位基因的TGFB1基因优先下调蛋白水平；然而，miR-187型对[TC]和[TT]rs1982073基因型分别有中间和相反的影响(，左侧面板）。同样，miR-138型当在rs1799782-XRCC1杂合细胞系中过度表达时，显示出稳定作用。虽然[CC]携带者显示XRCC1蛋白水平降低，但携带[CT]基因型的细胞系显示XRCB1水平升高，这与荧光素酶结果一致(，右侧面板）。在我们筛选的25种不同的癌细胞系中，我们没有发现任何rs1799782-XRCC1[TT]纯合携带者，这支持了[TT]携带者可以防止癌症发展的观点(21). 综上所述，这些结果表明，大约15%的被调查转录SNP（14个靶SNP相互作用中有2个预测为等位基因依赖性，并在我们的分析中进行了测试，,补充表S3和数据未显示），它们与BC的已知关联可能是由于干扰miRNA结合，从而干扰miRNA基因调控。考虑到所有miRNA靶预测程序的高假阳性率，只有七分之一的靶SNP相互作用能够得到生物证实，这并不奇怪。虽然已知miRanda程序比其他优先考虑种子互补性或种间靶标保守性的现有程序产生更多的假阳性预测，但它具有更高的灵敏度。因此，我们选择miRanda来识别非规范的miRNA靶点（即种子互补性低的靶点），如rs1982073-TGFB1和rs1799782-XRCC1，否则这些靶点会被只关注3′UTR并考虑广泛的5′互补性的预测程序所忽略（数据未显示）。总的来说，我们的生物信息学预测中，我们验证了靶SNP相互作用，这些相互作用被预测具有广泛的MFE变化范围（从8%到42%），MFE和真正miRNA:：靶SNP交互作用的概率之间没有直接相关性。因此，在随后的分析中，我们过滤了MFE变化至少为8%的预测靶相互作用，在我们的体外实验中，检测到了显著的生物效应。此外，在这个截止点，通过全基因组靶SNP分析（见下文），我们注意到MFE变化分布中有一个明显的峰值，进一步支持MFE变化大于8%的可能生物学意义(补充图S2).
干扰miRNA:：mRNA相互作用的靶SNPs的鉴定和表征
在人类HapMap数据库（Release 21a）中包含的3839363个SNP中，我们鉴定了90985个位于mRNA区域的SNP（即转录的SNP），并根据其基因组位置（5′UTR、CDS和3′UTR）对其进行分组。我们通过综合生物信息学方法确定了候选靶SNPs，这些SNPs可能由于等位基因特异性MFE的变化而产生、破坏或修饰miRNA结合位点(和方法），包括miRanda的预测(2). 在补充表S4,第5章和S6系列，我们给出了分别位于3′UTR、CDS和5′UTR的SNP的前100个miRNA:：SNP等位基因特异性MFE变化（如有要求，可提供额外的靶SNP相互作用）。我们观察到3′UTR、5′UTR和CDS的MFE变化具有高度相似的双峰分布(补充图S2)并将诱导至少8%MFE变化的所有SNP视为目标SNP。使用此策略()和严格的miRanda设置（见方法），我们发现41%、6%和53%的靶SNP分别位于5′UTR、CDS和3′UTR内。在所有转录SNP的MFE变化分布中，较低的2.5%和较高的97.5%对应最小的94%MFE变化。通过使用94%的截止值，我们发现大约64%的转录SNP被预测破坏（增加/减少）假定miRNA:：mRNA双工体的MFE。总之，通过这种全基因组生物信息学方法，我们确定了一组假定的靶SNP，它们修改了miRNA:：mRNA结合的MFE，并最终影响miRNAs与其靶的相互作用和调节功能。
此外，我们对Saunders等人在实验验证的miRNA靶位点和相应的相互作用miRNA内鉴定的17个SNPs进行了类似的分析(22) (补充表S7). 我们观察到78%的SNP能够改变miRNA MFE至少8%。因此，实验验证的miRNA靶位点内的变异等位基因可以改变miRNA:：mRNA相互作用的状态并影响基因表达，这与我们的全基因组生物信息学预测一致。
BC和对照人群中的目标SNP分布
我们对一组BC患者（166例散发和169例家族性BRCA1和BRCA2阴性先证者）和对照组（186例）进行了测序（参见补充材料用于患者信息），以确定位于癌症相关基因内的选定目标SNP的种系存在().补充表S8总结了目标SNP基因型的分布及其与高加索病例（散发和家族性BC）和对照组BC风险的关系。logistic回归分析表明，rs799917-BRCA1[T]携带者更可能与BC相关（所有病例与对照组相比：[CT]携携者的单变量分析比值比1.57，p=0.03，在多变量分析中仍有显著性，OR=1.86，p=0.046，[TT]携带器的单变量分析比值比1.95，p=0.03），尤其是散发性BC（散发病例与对照组：CT携带者的单变量分析OR为1.98，p=0.007，[TT]携带者为2.81，p=0.003）(). 此外，分析表明，rs334348-TGFBR1[AG]携带者更有可能患有BC（所有病例与对照组：单变量分析OR 1.69，p=0.048），尤其是熟悉的BC（熟悉组与控制组：单因素分析OR 2.2，p=0.005；熟悉组与散在组：单因子分析OR 1.99，p=0.01）在多变量分析中，这种相关性也很显著（熟悉与对照：多变量分析OR 2.67，p=0.002；熟悉与散发：多因素分析OR 2.17，p=0.02）(). 尽管病例对照研究人群规模较小，但这一证据表明，特定目标SNP在家族性BCs、散发性BCs和对照组之间存在差异性分布。
表2
通过对乳腺癌和对照样品进行直接测序分析的癌相关基因中的目标SNP列表，以及相互作用的miRNA示例。
| 基因 | SNP公司 | 等位基因变异 | 基因组位置 | 交互式miR | 活动通道 | MFE公司 | MFE更改 |
|---|
| BRCA1型 | 799917卢比 | 转交 | 外显的 | miR-638型^,# | C类 | −27.52 | −8% |
| MDM2型 | 769412卢比 | A/G公司 | 外显的 | miR-296-5p | G公司 | −18.15 | 66% |
| TGFBR1型 | 334348卢比 | A/G公司 | 3英尺UTR | miR-628-5p^,# | G公司 | −20.95 | 29% |
| TP53BP2型 | rs17739 | 转交 | 3英尺UTR | miR-129-5p | T型 | −19.31 | 121% |
| TP53输入1 | 7760卢比 | G/T公司 | 3英尺UTR | miR-330-5p | G公司 | −17.92 | −92% |
| XIAP公司 | 28382751卢比 | A/C公司 | 3英尺UTR | miR-542-5p^ | C类 | −21.25 | 28% |
表3
| SNP（基因） | （散播+家庭）vs控制 | 家庭vs控制 | 散点vs控球 | 家庭vs SPORADIC |
|---|
| OR（95%置信区间）* | p值 | OR（95%置信区间）* | p值 | OR（95%置信区间）* | p值 | OR（95%置信区间）* | p值 |
|---|
| rs334348（TGFBR1） | AG与AA | 1.69(1.01, 2.83) | 0.048 | 2.2（1.29，4.07）
2.67(1.19, 6.03) | 0.005
0.002 | 1.15 (0.63, 2.11) | 0.65 | 1.99(1.15, 3.46)
2.17（1.15，4.07） | 0.01
0.02 |
| GG与AA | 0.71 (0.26, 1.99) | 0.52 | 0.46 (0.11, 1.86) | 0.27 | 0.94 (0.31, 2.88) | 0.92 | 0.48 (0.12, 1.97) | 0.31 |
| rs799917（BRCA1） | CT与CC | 1.57(1.04, 2.37)
1.86(1.01, 3.42) | 0.03
0.046 | 1.25 (0.76, 2.05) | 0.38 | 1.98(1.20, 3.26) | 0.007 | 0.63 (0.36, 1.10) | 0.1 |
| TT与CC | 1.95(1.06, 3.6) | 0.03 | 1.26 (0.59, 2.71) | 0.55 | 2.81(1.40, 5.64) | 0.003 | 0.45（0.21，0.97） | 0.04 |
目标SNP预测的验证
为了验证目标SNP的计算预测和生物相关性，首先我们进行了在体外荧光素酶报告分析。位于BRCA1型,TGFBR1型和XIAP公司()预测的相互作用miRNAs显著影响（p<0.05）pGL3-SNP荧光素酶活性(和补充图S3). 在所有三个测试的病例中，miRNAs与活性等位基因相互作用时表现出更高的抑制作用。接下来，我们测试了我们发现与BC相关的两个目标SNP rs799917的作用-BRCA1型和rs334348-TGFBR1型内源性BRCA1和TGFBR1蛋白水平。我们转染了相互作用的miRNAs(miR-638型和miR-628-5p)在携带不同靶SNP基因型的癌细胞系中。以下miR-638型过度表达，9个细胞系中有7个（其中BRCA1被明确检测以进行正确的条带定量）显示BRCA1蛋白水平降低(左侧面板和数据未显示）。通过对细胞系进行亚分组miR-638型根据rs799917基因型诱导BRCA1减少，我们观察到[CC]基因型的存在导致BRCA1蛋白水平的强烈降低（61%减少vs.79%，p=0.047；左侧面板）。此外，我们排除了以下可能性miR-638型依赖性BRCA1减少是由于TargetScan通过荧光素酶和BRCA1过度表达实验预测的BRCA1 3′UTR内的保守靶点所致(补充图S4)，进一步证实了目标SNP相互作用位点的功能意义。按照类似的方法，我们评估了rs334348对miR-628-5p法规TGFBR1型.过度表达miR-628-5p在不同的细胞系中，我们观察到miR-628-5p表现为TGFBR1型(右面板，数据未显示），并且其对TGFBR1蛋白水平的阻遏活性依赖于TGFBR1型3′UTR miRNA靶序列（[AA]和[CC]基因型分别减少80%和50%，p=0.006；右侧面板）。在存在活性或非活性等位基因的情况下，观察到miRNA对蛋白质调节的显著影响(,和补充图S3)支持我们的假设，即miRNA靶点内的遗传变异实际上可以破坏miRNA基因调控并影响蛋白质表达，最终导致肿瘤易感性。
目标SNP预测的验证(一)顶部，对于两个SNP，miRNA:：mRNA相互作用显示为活动等位基因（绿色）或非活动等位蛋白（红色）突出显示。与预测的相互作用miRNA共同转染的pGL3-SNP等位基因对的荧光素酶报告分析，rs799917-BRCA1：：miR-638型（左面板）和rs334348-TGFBR1:：miR-628-5p（右侧面板）。荧光素酶活性相对于加扰阴性对照表达（=1）；数值表示在六个重复中进行的至少3个独立实验的平均+/-标准偏差。根据miRanda预测，还显示了miRNA:：mRNA的相互作用，活动等位基因（绿色）或非活动等位蛋白（红色）突出显示。(b)BRCA1（左侧面板）和TGFBR1（右侧面板）的WBmiR-638型和miR-628-5p分别在携带不同rs799917-BRCA1或rs334348-TGFBR1变体的细胞系中进行转染。基因型显示在免疫印迹的顶部；以下报道了针对Vinculin蛋白水平标准化的BRCA1和TGFBR1表达水平，并与每个细胞系的扰乱阴性对照转染（＝1）进行比较。(c（c）)miRNA转染后分析的所有细胞中BRCA1和TGFBR1蛋白减少的平均值（分别为左面板和右面板），与每个基因型的打乱自然对照（=1）相比。
讨论
在本研究中，我们利用miRNAs转录后基因调控的最新知识，确定了一种新的发病机制，以解释某些SNP与BC敏感性的关联。从我们的综合分析中得出的SNPs对miRNA结合的影响的证据揭示了SNPs在基因表达调控中的新作用。支持这一理论的是，最近的一项研究表明，种族间SNP等位基因频率的差异是基因表达差异的原因(23). 11人中有2人顺式Spielman等人发现的SNP(23)实际上是位于3′UTR中的转录SNP，通过生物信息学分析，我们发现这两个SNP都有资格诱导MFE绝对变化大于8%，且多个假定的相互作用miRNAs(补充表S9). 因此，我们推测顺式SNPs通过改变miRNA靶结合能力来调节表型基因表达多样性，至少部分如此；最终导致对复杂遗传病（如BC）易感性的差异。值得注意的是，在BC中差异表达的靶SNP中，我们发现rs334348位于TGFBR1型最近发现该SNP与TGFBR1的种系等位基因特异性表达相关，并表明其增加了结直肠癌的风险(24). 例如，这种表型可以通过miRNA相互作用的改变来解释，因此强烈支持我们的假设，即影响miRNA功能的SNP有助于等位基因特异性蛋白的表达，从而在肿瘤易感性中发挥作用。Kim和Bartel最近的一项研究(25)基于杂合小鼠菌株的转录组分析，表明多态性miRNA靶位点决定了基因表达的差异，这进一步支持了我们的假设。
本研究的重点是探讨转录的SNP对miRNA:：mRNA相互作用的影响，以及这些SNP对基因表达的调节，这些SNP在肿瘤发生中可能具有的意义。我们发现许多靶SNP可以有效地干扰miRNA靶识别，并且这些SNP在BC和对照人群中的分布显著不同，这表明在BC易感性中可能起作用。值得注意的是，BC-associated rs1982073-TGFB1变异体以前曾在肿瘤发生的初始阶段与TGFB1的低表达水平相关，而在更晚期的转移性BC阶段则有较高的表达水平(26,27). TFGB1表达的这种转变可能是由于miR-187型表达水平，携带[T]变异体可能更受欢迎。此外，所述模型以及TGFB1在肿瘤发生不同阶段的促或抗肿瘤活性，可以解释观察到的rs1982073-TGFB1与BC相关的相互矛盾的结果。另一个有趣的观察结果是，miRNA和活性等位基因之间的较强结合确实意味着抑制；事实上，如rs1799782-XRCC1所示，miR-187型携带活性等位基因时稳定XRCC1的表达。这一发现与其他证据一致，表明miRNAs可以积极调节蛋白质表达(28,29). 此外，通过搜索完整的PCG转录物（5′UTR，CDS，3′UTR）中的miRNA靶SNP，我们已经鉴定出miR-638型作为BRCA1的调节因子，通过与CDS内的靶位点结合（据我们所知，这是迄今为止发表的第一个调节BRCA1的miRNA）。虽然TargetScan在BRCA1的3′UTR中预测了一个保守的相互作用位点，但我们发现在我们测试的条件下它不是一个功能位点。最近，Tay及其同事还证明了位于PCG CDS内的miRNA靶点的存在和丰富性(三)，确认了以下可能性miR-638型以类似方式管理BRCA1。尽管大型病例对照研究尚未就miRNA靶点SNP rs7799917与BC敏感性的相关性得出统一的结论BRCA1型光盘(30,31)最近在多形性胶质母细胞瘤DNA修复基因的SNP分析中强调了其与肿瘤易感性的关系(32). 在本研究中，我们发现rs7799917[T]等位基因与较弱的miR-638型依赖BRCA1减少，并与BC相关(). 目前正在进行进一步调查，以解释这种明显的不一致。我们推测这是由于肿瘤发展过程中的伴随变化miR-638型表达水平。此外，我们观察到低频CDS突变（同义和非同义，数据未显示）可能对miRNA基因的调节作用产生类似于靶SNP的影响(33). 这为同义词突变的重要性提供了一个创新的见解，未来应重新关注这一点并对其进行研究。
在这里提供的数据的支持下，我们强调了基因变体和microRNA表达模式可以解释不同群体之间基因表达差异的可能性。因此，新发现的目标SNP类别可能导致癌症易感性，而不是其本身（或作为特定单倍型的标签(30,31))但与miRNA表达模式一致，在这个miRNA分析的新时代，这种模式变得更容易获得。
总之，考虑到BC敏感性的多因素模型，我们认为转录的等位基因变体可以改变miRNA PCG调节，从而增加miRNA异常。这些因素通过微妙的基因调控机制导致肿瘤易感性和肿瘤一般风险，但尚未完全被认识到。随着miRNAs和靶SNP列表的不断增加，确认靶SNP对基因表达的影响变得越来越迫切，这将最终帮助我们更深入地了解与BC和其他人类恶性肿瘤发展相关的分子途径的许多变量。
致谢
G.A.C.以得克萨斯大学M.D.安德森研究信托基金（The University of Texas M.D.Anderson Research Trust）研究员、得克萨斯州大学系统董事会研究学者（The University ofTexas System Regents Research Scholar）研究员和拉德耶瓦尔迪安董事会研究奖学金（Ladjevardian Regents Research Schooler Fund）的。这项研究得到了G.A.C.R.D.乳腺癌SPORE发育奖的部分支持，R.D.担任费城医疗信托捐赠主席职位；他的实验室研究得到了费城医疗信托基金、NHGRI/NIH和美国癌症协会的支持。我们感谢古斯塔沃·巴尔达萨雷（Gustavo Baldassarre）赠送BRCA1表达载体，并感谢艾伦·科（Ellen Ko）的英文编辑。
工具书类
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