氨基酸、多胺和有机阳离子（APC）转运蛋白是一大家族二级转运蛋白的成员，可催化跨膜双层广泛底物的单运、同运和反运(1). APC转运体存在于整个生命王国，是细胞生理学不可或缺的组成部分，在人类中包括多溶质载体（SLC）家族(;表S1) (2). 典型APC转运体包括SLC7谷氨酸/胱氨酸反转运蛋白（xCT），这是一种钠非依赖性的反转运蛋白，可将细胞外胱氨酰交换为细胞内谷氨酸(三,4). 阳离子氨基酸转运蛋白（CATs）也是SLC7家族的成员，它们为一氧化氮合成提供精氨酸，而一氧化氮合成是哮喘发病的主要因素(5). 在癌症中，APC我-型氨基酸转运蛋白1提供肿瘤生长所需的氨基酸，在肿瘤细胞中上调(6)并调节对化疗药物melphalin的摄取(7). 胱氨酸尿症（最常见的原发性遗传性氨基酸尿症）和赖氨酸尿蛋白不耐受症都是SLC7基因突变的结果(8-10).
ApcT是一种广泛特异的氨基酸转运蛋白(一)人类和选定细菌APC转运体的树状图。与原核APC、CAT、CCC、VIATT、SNAT、PAT和HAT相对应的分支定义见表S1. (B类) [三H] -丙氨酸的摄取依赖于pH值。ApcT和非蛋白对照蛋白脂质体在pH7（分别为蓝色和黑色）或pH4（分别为红色和灰色）的缓冲液中装载。吸收实验是通过将这些脂质体稀释在添加了500nM的pH 4缓冲液中进行的[三H] 阿拉误差条表示三次测量的SEM。(C类)FCCP和安定霉素治疗对[三H] -丙氨酸摄取。用100mM KCl和pH7或pH4 20mM柠檬酸盐缓冲液装载蛋白脂质体。在30℃下，在20mM柠檬酸盐缓冲液pH4、100mM KCl、750nM L中进行吸收实验-[三H] Ala和存在或不存在4μM FCCP和/或100nM缬氨霉素。在20分钟时测量时间点(D类)Ala和Glu是逆流实验中ApcT的首选底物。蛋白脂质体被装载有4mM Ala、pH值4和特殊的[三H] 测定了500 nM浓度的氨基酸。吸收和非特异性转运或结合的估计值由pH4（外部；黑条）的实验确定，而非特异性运输或结合的估算值则由pH7（外部；灰条）的试验确定。
SLC12族阳离子氯共转运蛋白（CCCs）归入APC地幔之下，是几种治疗性利尿剂的靶点，参与活性氯离子-肾脏吸收、血压维持和细胞体积动态平衡(11); 在中枢神经系统中，这些转运蛋白在设定静息氯化物浓度以及γ-氨基丁酸（GABA）和甘氨酸介导的神经传递中发挥着重要作用(12). 其他APC转运体参与神经系统中的多种生化过程，包括将抑制性神经递质包装到突触小泡中(13)以及谷氨酰胺的钠或质子依赖性结合，这是谷氨酸和GABA再循环的关键步骤(14). 在上皮细胞中，SLC36转运体通过与质子梯度耦合，驱动肠上皮细胞顶膜对氨基酸的吸收(15). 值得注意的是，一些APC转运蛋白充当“受体”，即转运蛋白-底物复合物，以类似受体的方式将信号传递到细胞内部(16).
为了加深我们对APC转运蛋白的整体理解，并理解质子偶联和钠偶联转运蛋白之间的分子共性和区别，我们研究了质子依赖性APC转运蛋白的原子结构和机制。我们通过荧光检测、大小排阻色谱（FSEC）对谷氨酸/半胱氨酸反转运蛋白的细菌同源基因进行预结晶筛选，从而启动了这项工作(17). 对几个嗜热同源物的分析表明，一个435氨基酸的完整膜蛋白贾纳氏甲烷球菌（ApcT；GI:1591319；)具有清晰的对称洗脱曲线，无论是单独洗脱还是与抗ApcT Fab片段复合洗脱(图S1)因此，它是研究功能和结构的一种有希望的APC转运体。
我们通过检测四种蛋白的摄取来发现ApcT的功能三H标记氨基酸-我-爵士，我-格林，我-丙氨酸和甘氨酸-使用纯化的ApcT重组成脂质囊泡。几个APC转运蛋白是在pH值范围内活动的交换器(三,18,19)因此，我们用冷底物装载囊泡，并探索不同的内外质子浓度。在低外部pH值下我-[三H] -序列号，我-[三H] 格林，我-[三H] -Ala，以及[三H] -甘氨酸是强健的；然而，在中性pH值下，转运可忽略不计(图S2). 因为ApcT可以高效地传输[三H] 阿拉(图S3)，我们选择丙氨酸做进一步的实验。底物摄取不需要内部Ala，尽管在存在内部底物的情况下摄取活性可跨刺激约3倍(图S4). 时间进程[三H] -证明了在质子梯度条件下以及在没有内部丙氨酸的情况下丙氨酸的吸收(). 丙氨酸交换取决于酸性pH值(图S5)但摄取并不需要钠或钠梯度(图S6). 质子和钾离子载体的包合会破坏pH梯度，极大地降低运输活性，使其接近在没有质子梯度的情况下测得的水平(和图S7).
为了探讨ApcT的底物特异性，我们使用标准的20我-氨基酸，d日-丙氨酸、β-丙氨酸和GABA作为冷竞争抑制剂[三H] -丙氨酸摄取测定。吸纳[三H] 几乎所有人都抑制丙氨酸我-氨基酸，赖氨酸、精氨酸和脯氨酸除外(图S8). 传输是立体特定的，因为d日-Ala无法有效竞争我-Ala运输。β-Ala确实抑制转运，表明抑制不需要α-氨基。在冷竞争实验的基础上，我们选择了一组氨基酸进行测试真诚地底物，发现ApcT运输一系列氨基酸(我-谷氨酸，我-阿拉，>我-爵士，我-格林>我-Phe），但运输最小（Gly）或最大（Trp）氨基酸的速度非常慢(). 综上所述，我们的数据表明，ApcT是一种在酸性pH下具有活性的钠非依赖性、广泛特异性氨基酸转运蛋白。我们建议ApcT将底物摄取与一个或多个质子耦合，尽管这种耦合以及底物-质子化学计量学的决定性测定需要进一步研究。
ApcT溶解于n个-辛基-β-d日-硫代葡萄糖苷形成晶体，单独衍射或与7F11 Fab片段复合衍射到高分辨率。我们使用已知的Fab结构作为搜索探针，通过结合分子替换解决了ApcT的晶体结构(表S2和S3)和单波长反常散射，使用硒代蛋氨酸标记的ApcT。由于在pH~9下单独生长的ApcT晶体的衍射分辨率高于Fab复合物的衍射分辨率，并且ApcT在两种晶体形式中的构象相似，因此我们采用前者的结构进行分析。ApcT的高分辨率电子密度图允许完整追踪多肽链，几乎所有侧链的准确定位，以及约180个水分子的准确拟合。我们没有发现结合离子或底物分子的证据，也没有生长出底物络合物的晶体。因此，目前的结构代表高pH、apo状态。
ApcT的结构显示出整体圆柱形、胞内氨基和羧基末端、短胞质和胞外环以及12个跨膜（TM）螺旋(、和图S9). 在前10个TM螺旋中，片段1-5和6-10具有相似的构象，并由平行于膜的伪2倍对称轴关联，位于TMs 1和TMs 6之间，大约穿过假定双层的一半(,第10节). 两个5螺旋重复重叠，不仅“支架”螺旋3-5和8-10重叠良好，而且“束”螺旋1-2和6-7以及细胞内外环IL1和EL4也重叠良好(). 这两个五螺旋重复序列一起形成了一个圆柱形的桶，外面是TMs 11和12。ApcT的蛋白质折叠和伪对称性与LeuT相似(20)，一种钠偶联氨基酸转运体，和叠加证实了这两种转运蛋白具有显著的亲缘关系，与亲水性分析一致(21). 其他类LeuT钠偶联转运体，包括vSGLT(22)，百万分之一(23)和BetP(24)，不叠加在ApcT和LeuT上(支持联机文本).
ApcT的体系结构(一)沿着分子对称的伪2倍轴，平行于膜的ApcT结构的带状图。(B类)从外部俯视ApcT。(C类)切片通过ApcT的溶剂可及表面，显示溶剂可及途径深入到转运蛋白。水分子显示为氰球。(D类)脚手架将ApcT和vSGLT的TMs 3-5和8-10螺旋叠加到LeuT的等效元件上，表明在ApcT中，TM1b向外部封闭，TM1a向内部部分开放。LeuT的TMs 2-10显示为α-碳痕量。
精氨酸/胍丁胺反转运蛋白大肠杆菌(19)（AdiC）是APC转运蛋白家族的成员。最近，Gao等人报告了其晶体结构(25). 由于ApcT在氨基酸序列和生物化学功能上与AdiC相关，我们将我们在2.35º分辨率下测定的ApcT结构与在3.6º分辨率（PDB代码3H5M）下测定的AdiC结构进行了比较。从氨基酸序列的关系可以看出，ApcT和AdiC的蛋白质折叠是相似的。然而，我们发现ApcT和AdiC结构的重叠与跨膜段6、7和8中独立排列的氨基酸序列之间存在显著差异(图S11和S12). 通过对结构和序列比对的分析，我们得出结论：在AdiC结构中，在TMs 6、7和8区域，可能到C末端，氨基酸序列被几个相对于ApcT的氨基酸残基偏移，从TMs 5和6之间的“环”开始。这意味着TM5结束后的许多残基，包括关键残基，如Glu208、Tyr239和Trp293，“帧偏移”了约4个残基或约一圈α-螺旋(25) (图S11-S13). 由于这种帧移位，我们在分析APC转运蛋白时没有使用AdiC结构。
使用三种不同标准对ApcT结构进行的分析表明，它采用了无基底、向内但封闭的构象。首先，在TMs 1和TMs 5之间，存在从细胞质溶液到Lys158的溶剂可进入路径(). 其次，从LeuT、vSGLT和ApcT结构对TM1的构象进行分析，这是一种结构元素，在允许进入底物结合囊中起着关键作用，表明TM1采用的构象完全阻断了进入外部的通道，但仅部分阻断了进入内部的通道(,S14和表S4). 第三，结合水分子在转运蛋白上的映射清楚地显示了转运蛋白细胞外表面的一条溶剂带，在细胞外边界和假定的底物结合囊之间有一条约8º厚的无溶剂带，以及转运蛋白细胞质“一半”内和周围的一条宽的溶剂位点带(图S15). ApcT的这种载脂蛋白构象与~3.3º分辨率BetP结构的底物结合的闭塞构象最为相似(图S14) (24)从而证明，通过我们的高分辨率结构，这种闭塞状态的形成不依赖于结合基底的存在。
ApcT中有一个充满水的口袋，大约穿过与LeuT底物位置重叠的膜双层的一半().这个假定的底物结合位点分别位于TMs1和6的非α螺旋区、TMs3和8的残基以及IL1和EL4的“底部”和“顶部”氨基酸附近(,图S9). 充满水的口袋的体积约为195Å三并且足够容纳苯丙氨酸（191.9欧三)，但不是色氨酸（228.2μ三)(26)与我们确定的Phe比Trp更好的底物一致() (27). 口袋由极性氨基酸、芳香族氨基酸和脂肪族氨基酸组成，因此就像LeuT一样(20)，底物的氨基和羧基之间的离子相互作用可能通过与极性侧链原子以及与主链羰基和酰胺部分的氢键相互作用来满足。
基板凹槽(一)LeuT（灰色）和ApcT（绿色）的TMs 1-10的结构叠加。使用DaliLite程序将LeuT的TMs 1-10叠加在ApcT的TMs1-10上，并显示了它们的Cα轨迹。LeuT中的底物亮氨酸和两个钠离子显示为球形。C、 N、O和Na原子分别为灰色、蓝色、红色和紫色。ApcT中TM区域中部埋藏的水分子以青色显示。(B类)ApcT中假定溶剂袋的特写视图。所示为TM螺旋1、3和6以及围绕溶剂袋的IL1和EL4环。预测参与底物结合的关键残基显示为球状和棒状模型。(C类)TM3在底物结合中的作用。所示序列比对是由PROMALS 3D生成的原核转运体（PheP、AroP、CAN1、GNP1、AdiC、LeuT和ApcT）以及ApcT单独与xCT同源序列的独立比对的组合。底物结合中涉及的残基以红色突出显示，其他同源物中的等效残基以灰色阴影突出显示。
在相关的APC转运蛋白中，TMs 3和8以及IL1的残基在底物结合中起着重要作用。在TM3中，PheP中的Phe111和AroP中的Tyr103大肠杆菌和酵母Gnp1中的等效Trp239介导底物特异性(28). TM3的ApcT、Tyr97中的相应残基与推测的底物结合位点部分一致。在人类谷氨酸/胱氨酸交换器中，与ApcT的Tyr97等效的残基是Arg135，我们认为该残基与底物的γ-羧酸实体相互作用。TM3中排列在充满水的口袋中的其他残基-Leu93、Ser100和Phe104-对应于酵母Can1的残基Tyr173和LeuT的Val104和Tyr108，氨基酸也在底物特异性中起着核心作用() (20,28). 在TM8中，ApcT的Ala287和Thr291对应于LeuT中的底物结合残基Ser355和Ile359(20)而AdiC（TM8）的Trp293对底物结合和转运至关重要(29). 这些观察结果共同证实了充水囊是一个合理的底物结合位点。
ApcT是一种质子偶联氨基转运体，因此我们询问在功能显眼的区域是否存在可滴定基团。值得注意的是，Lys158（TM5）的有序伯胺基团位于TMs 1和8之间(;图S19)并与G19（TM1）的主链羰基氧原子和S283（TM8）的羟基形成氢键(). 根据与LeuT的结构比对，Lys158的胺（ApcT）叠加在Na2离子（LeuT；图S16). 与Lys158胺基团的埋藏位置一致，计算预测pKa比未扰动赖氨酸残基的pKa低3-4个pH单位(30). 为了验证Lys158对ApcT转运活性很重要的假设，我们进行了Lys到Ala的取代（K158A），发现突变体没有可测量的三H-Ala转运活性(图S17).
Lys158对ApcT转运功能至关重要（A） TM1和8之间的Lys158视图。（B） Lys158的胺分别与Gly19和S283的羰基和羟基氧形成氢键。（C） 我们提出，当K158的胺基为中性时，ApcT采用向内的封闭构象（左下图）。酸性pH促进K158质子化和异构化为外向构象（左上）。在底物结合（右上）时，ApcT异构化为开-入状态（右下）。底物和质子释放到细胞质之前，形成了向内但封闭的构象，如当前晶体结构（左下面板）所示。
野生型ApcT晶体结构是在碱性pH下测定的，在碱性pH条件下，转运体不活跃，因此我们推断，如果Lys158在转运周期中经历可逆质子化和脱质子化，则当前结构可能代表胺基的中性、非质子化状态，即在底物和质子与细胞质结合解除后，转运蛋白的功能状态。为了评估去除赖氨酸残基的结构后果，我们求解了ApcT K158A晶体结构。与我们的假设一致，野生型结构代表Lys 158的中性、非质子化状态，ApcT K158A晶体结构既没有对蛋白质的整体折叠进行重大重排，也没有对残基158周围的残基位置进行重大改变(图S18).
ApcT、LeuT、vSGLT（SLC5）、Mhp1（NCS-1）和BetP的结构比对表明，赖氨酸的铵基占据的位置与Mhp1、vSGLT和BetP中预测的钠位非常相似。此外，定义TM1和TM8之间这些必需钠或铵离子结合位点的关键氧原子也在氯化钠-钾协同转运子中保守(图S16)揭示了这种单价阳离子结合位点在许多不同的次级转运蛋白中广泛保守。Lys158及其在ApcT的TM1和TM8中的氢键伙伴也在谷氨酸/胱氨酸反转运蛋白（SLC7）中保守。
ApcT的结构提供了APC转运体的原子分辨率视图，该转运体捕获于向内但被阻断的apo状态。我们认为，这种状态可能代表了在底物和质子通过开-对-内状态与细胞内溶液结合后，转运蛋白的构象，并且细胞内的门部分关闭。在Lys158胺基质子化后，我们推测ApcT将从内向状态异构化为开放到外向构象，准备结合底物并返回内向构象。
ApcT中Lys158的质子化和去质子化，或钠与LeuT中Na2位点的结合和解结合，如何调节转运蛋白的构象？我们认为，与Lys158的质子结合和解结合改变了TM1的构象，改变了螺旋中扭结的位置，分别打开和关闭了细胞外的门(). 这怎么会发生？如果我们比较LeuT和ApcT的结构(图S16)，我们看到Na2离子由TMs1和8的5个配体完全配位。相比之下，我们断言Lys158的初级胺基在当前结构中是中性的，它只由两个氢键供体协调，TM1和TM8中各有一个。由于ApcT和LeuT在结构和TM1螺旋序列上密切相关，我们建议，当ApcT的Lys158与质子结合时，现在带正电的胺基的配位发生变化，TM1在与LeuT中的扭折类似的位置形成扭折，补充Ile22（TM1）的羰基氧，以及Ser283和Ser286（TM8）的羟基。与Lys158胺基的质子结合和解离不仅可以调节TM1的局部构象，而且还可以促进TMs 1a、1b、6a和6b的运动，从而促进细胞外和细胞内闸门的打开和关闭。
