心脏和血管壁亚硝酸盐还原为一氧化氮的机制

1.心脏中亚硝酸盐形成NO的证据

在心血管系统中，传统上认为NO仅由内皮一氧化氮合酶（eNOS）在内皮细胞中产生，然后被动扩散到平滑肌细胞，激活可溶性鸟苷酸环化酶（sGC），或扩散到血液中，主要由血红蛋白（Hb）消耗。然而，1995年，我们首次观察到，在缺血和细胞内酸中毒的条件下，亚硝酸盐也可以是心脏组织中NO的主要来源[8]. 在同位素标记的情况下¹⁵不₂⁻，NO产生自¹⁵用自旋阱铁N-甲基-D-葡糖胺二硫代氨基甲酸盐（Fe²⁺-MGD）。¹⁵NO产生一个特征性的双峰¹⁵NO-Fe公司²⁺-MGD谱，而不是用自然丰度观测到的三重态¹⁴NO，可直接和选择性检测亚硝酸盐衍生NO的形成。心脏标记为1 mM¹⁵不₂⁻正常灌注1分钟或缺血开始前灌注1分钟。在正常灌注的对照心脏中，¹⁵不₂⁻没有导致显著的NO生成(图1A，左）。标记心脏，然后缺血30分钟；然而，观察到明显的NO形成，并出现非常大的双信号(图1B，左）。在添加自然丰度的匹配实验中¹⁴不₂⁻，发现大量NO三重态信号(图1C，左）。虽然观察到的信号与不添加亚硝酸盐时的信号相似，但该信号的强度要高得多。这些实验表明，亚硝酸盐在缺血心脏中被还原为NO。

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图1

亚硝酸盐在心脏中形成NO的EPR谱。心脏预先标记为1 mM¹⁵N或¹⁴N亚硝酸盐。左面板显示了Fe-MGD心脏的光谱；A类，缺血前；B类，缺血30分钟¹⁵N-亚硝酸盐；C、 30分钟缺血¹⁴N-亚硝酸盐。右侧面板显示硝基苯形成；A类，使用¹⁴N-亚硝酸盐；B类，使用¹⁵N-亚硝酸盐。

还进行了实验，测量了标记有1 mM的心脏缺血心脏组织中亚硝酸盐的形成¹⁵不₂⁻由于形成和结合¹⁵不₂⁻进一步证实NO是由长期缺血心脏组织中的亚硝酸盐生成的(图1B，右侧）。使用¹⁴不₂⁻观察到类似幅度的三重NO信号(图1A，右侧）。

亚硝酸盐还原为NO的速度取决于pH值。在心肌缺血期间，会发生明显的细胞内酸中毒，pH值可能降至6.0或以下[21]. 低pH值和低氧下的高度还原状态可能导致亚硝酸盐快速还原为NO。这一过程与心脏病发作的临床情况一样，在心肌缺血后发生，推测在缺血或休克条件下，亚硝酸盐歧化和减少将是任何组织中普遍存在的现象，此时会发生灌注不良和伴随的酸中毒[8,21].

2.亚硝酸盐介导NO形成的测量、定量和成像方法

NO具有顺磁性，与水溶性自旋阱Fe具有高亲和力²⁺-MGD，形成一个单亚硝基铁络合物，在g=2.04时具有特征三重态光谱，具有超精细分裂a_N个=12.8. 根据观察到的光谱强度，可以对NO生成进行定量测量[8,21]. 如上所述，该技术已用于测量亚硝酸盐介导的NO生成¹⁵N标记的亚硝酸盐，可用于同位素追踪亚硝酸盐介导的NO形成过程[16-18,25-30].

电化学NO传感器的优点是能够直接检测溶液或生物样品中的NO浓度，灵敏度高，检测极限为几纳米摩尔[31,32]. 这一优点使NO电极成为研究NO反应动力学的一个极好的工具，特别是在生物样品中。NO电极研究用于研究酶催化的亚硝酸盐从XO还原，该方法避免了陷阱存在可能引起的任何扰动[16-18]. 电化学检测器连续记录通过工作电极的电流，该电流与溶液中的NO浓度成正比。

NO产生的实时速率可以使用化学发光NO分析仪来测量。在分析仪中，NO与臭氧反应，形成激发态NO₂，它发光[33]. 可以在配备加热套的玻璃清洗容器中，在受控温度下混合试剂并从反应混合物中分离NO。通过分析光电倍增管的数字记录信号来量化NO的释放。由于NO分析仪记录了吹扫气体混合物中NO的流量，因此它测量了系统中NO的生成速率[33]. 使用NO分析仪测量了黄嘌呤氧化还原酶（XOR）、醛氧化酶（AO）、细胞色素P450、大鼠组织和血液中产生NO的速率[16-18,26,34-36].

随着EPR成像（EPRI）方法和低频EPR仪器的发展，在体内外生物组织中对自由基和顺磁性物质的存在、数量和位置进行空间映射已成为可能[37,38]. 使用¹⁵N亚硝酸盐，在缺血心脏中进行亚硝酸盐衍生NO的空间定位[39]. 一系列大鼠心脏被铁负载²⁺-MGD和¹⁴N或¹⁵N亚硝酸盐并遭受全脑无血流缺血。60分钟后，获取三维投影数据并进行图像重建。图2A显示了在这些心脏中获得的3D图像。两个¹⁴N-和¹⁵N标记的心脏显示出类似的NO分布图像。这个¹⁵然而，由于超精细双峰结构的灵敏度提高和分辨率提高，NO图像在一定程度上更清晰。图像清楚地显示NO在整个左心室心肌中形成。NO图像能够显示心外膜、右心室心肌和左室和左室心内膜内表面的外部形状。然而，RV中的NO浓度要低得多，仅为LV壁中NO浓度的20–25%。为了了解缺血心脏中NO生成的空间分辨时间过程，对NO生成进行了EPRI，作为缺血持续时间的函数。在60分钟的缺血期间，每5分钟进行一系列图像。穿过LV的纵向和横向切口的代表性切片如所示图2B观察到，随着整个LV心肌缺血时间的延长，亚硝酸盐产生的NO浓度逐渐增加。也有报道称，全身EPR成像显示NO的形成和被血红素蛋白捕获[38].

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图2

A.显示三维EPR图像（25×25×25 mm^三)在离体大鼠心脏中亚硝酸盐衍生NO的形成。心脏内装有Fe-MGD，或者¹⁴N或¹⁵N亚硝酸盐，然后遭受无流缺血。NO与Fe-MGD结合的图像显示为切片3D视图。B.对缺血心脏中亚硝酸盐形成NO的时间进程进行成像。老鼠的心脏里装满了¹⁵亚硝酸盐和成像¹⁵执行与Fe-MGD的NO结合。从3D空间图像中显示了一系列纵向（上图）和横向（下图）切片作为缺血持续时间的函数。

3.涉及的途径：酶依赖或独立

我们和其他人已经确定了几种将亚硝酸盐还原为NO的机制，包括低pH值下的非酶歧化[40]，酶依赖性还原[8,21]，通过XOR进行酶转化[16-18,36]和AO[26]，细胞色素C还原[41,42]，第450页[35]以及脱氧血红蛋白或肌红蛋白的减少[9-14].

在酸性条件下，通过亚硝酸盐歧化或酶诱导的化学还原的简单过程可以生成NO。本杰明和他的同事在1994年报告说，亚硝酸盐酸化会在胃中释放NO[43]. 此外，1994年，Lundberg等人报告称，测量了人类胃中排出的空气中NO的高水平[44]. 我们观察到，亚硝酸盐以微摩尔浓度存在于组织中，并在缺血期间发生的酸性和高度还原条件下转化为NO。在缺血状态下，pH值可降至5.5。亚硝酸盐歧化产生NO的速率预计为4–100 pM/s。这可能导致缺血60分钟内NO增加15–360 nM[21]. 因此，随着组织长时间缺血进展到坏死，这种NO形成机制可能是NO生成的重要来源[8,21].

XOR是一种钼酶，在正常生理和疾病中发挥着多种重要作用。在哺乳动物中，XOR以两种相互转化的形式存在，黄嘌呤脱氢酶（XDH）和XO，而XO喜欢氧作为电子受体，XDH喜欢NAD⁺转换为NADH。这两种形式的XOR都可以作为亚硝酸盐还原酶产生NO[16-18] [36]. 在我们之前的研究中，我们描述了XO介导的亚硝酸盐生成的机制、数量和生理重要性[16-18]. 除钼外，XO还具有FAD结合位点和铁硫中心。XO具有不同的位点特异性电子给体。黄嘌呤和2,3-二羟基苯甲醛（DBA）通过与钼位结合，作为XO的电子供体，钼位是XO介导的亚硝酸盐还原发生的位置[16]. 然而，NADH在酶的FAD位点减少XO，FAD位点也是减少氧气的位点。XO在酶的钼位点将亚硝酸盐还原为NO，黄嘌呤、NADH或醛底物提供必要的还原当量[16-18]. 为了测量厌氧条件下亚硝酸盐介导的NO生成，进行了EPR研究。发现典型类型的XO还原底物，包括NADH、2，3-二羟基苯甲醛（DBA）和黄嘌呤，作为XO催化亚硝酸盐还原的电子供体，并触发大量NO生成。XO催化的亚硝酸盐还原的动力学研究表明，每种典型的还原底物都支持亚硝酸盐还原为NO，并且这些反应中的每一种都遵循Michaelis-Menten动力学。对于这些还原底物中的每一种，XO介导的NO生成速率也被确定为亚硝酸盐浓度的函数。再次，观察到典型的迈克尔利斯·蒙顿动力学。K系列_米，K_猫、和V_最大值通过拟合Michaelis-Menten方程获得值(图3). 根据这些动力学数据以及组织中已知的酶和底物水平，可以预测XO介导的NO生成速率的大小，并确定NO生成途径在生物系统中的定量重要性。

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图3

XO生成NO的动力学，作为降低底物或亚硝酸盐浓度的函数。A类显示了[NADH]对0.04 mg/ml XO和1.0 mM亚硝酸盐生成NO速率的影响。B类显示了[黄嘌呤]对0.02 mg/ml XO和1.0 mM亚硝酸盐生成NO速率的影响。C类显示了[2,3-二羟基苯甲醛]对0.02 mg/ml XO和1.0 mM亚硝酸盐生成NO速率的影响。D类显示了在0.2-4 mM亚硝酸盐存在下，0.04 mg/ml XO和1.0 mM NADH生成NO的速率。E类显示了在5μM-2.5 mM亚硝酸盐存在下，0.02 mg/ml XO和5μM黄嘌呤产生NO的速率。F类显示了在0.5 mM-5 mM亚硝酸盐存在下，0.02 mg/ml XO、40μM 2,3-二羟基苯甲醛生成NO的速率。对于这些图中的每一个，对应的拟合(实线)K（K）_米，V_最大值、和K（K）_猫数据是使用迈克利斯·曼顿方程获得的。采用日期：[35].

除XO外，我们最近的研究表明，另一种钼酶AO也可能是组织中NO的来源[26]. AO是一种细胞溶质酶，在药物和外源性物质的生物转化中起着重要作用（21）。XO和AO均存在于肝脏，但也广泛分布于其他组织，如肺、血管、心脏和肾脏[45-49]. AO和XO的氨基酸序列非常相似，同源性为～86%，它们属于同一个含钼蛋白家族，具有两个铁硫簇、一个黄素辅因子和一个钼蝶呤辅因子（22，23）。正如使用NO分析仪在厌氧条件下进行的调查，在添加AO之前，在NADH（500μM）存在的情况下，亚硝酸盐（100μM）没有检测到NO生成。然而，在添加AO（0.01 mg/ml）或XO（0.04 mg/ml）后，显著的NO生成被触发(图4A、B). 这些结果进一步证实了钼酶AO和XO作为强效亚硝酸盐还原酶发挥作用。

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图4

测定分离酶介导的亚硝酸盐还原产生的NO。在37°C厌氧条件下，使用化学发光NO分析仪在5ml PBS中进行测量箭头显示添加AO、XO或亚铁血红蛋白的时间。亚硝酸盐（100μM）、NADH（500μM）和AO（0.01 mg/ml）产生NO(迹线A); 亚硝酸盐（100μM）、NADH（500μM）和XO（0.04 mg/ml）(迹线B). 复制自[26].

4.氧气调节

我们之前的研究表明，XO介导的亚硝酸盐NO的形成受到氧张力的敏感控制[18]. 对于XO，有不同的位点特异性电子给体。黄嘌呤和DBA在钼位点结合并贡献电子，XO介导的亚硝酸盐还原也发生在钼位点[16]. 然而，NADH在其FAD部位还原XO，在那里发生氧还原。在厌氧XO介导的亚硝酸盐还原中，黄嘌呤和DBA是比NADH更有效的电子供体[16]. 然而，好氧条件下的底物偏好和控制是完全不同的。当黄嘌呤或DBA向XO的钼位提供电子时，NO的生成速率遵循迈克尔逊动力学，氧作为竞争性抑制剂。Lineweaver-Burk图描述了K的转移_米氧的值，并证明氧是亚硝酸盐还原的竞争性抑制剂(图5A、B). 然而，以FAD位点结合底物NADH为电子供体，亚硝酸盐的好氧NO生成速率不遵循迈克尔利斯·曼顿动力学(图6). 好氧NO生成维持在厌氧水平的70%以上，NADH与FAD位点的结合似乎可以阻止氧结合。

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图5

Lineweaver-Burk分析XO生成NO与不同氧张力下亚硝酸盐浓度的关系。倒数图，1/速度与1/[亚硝酸盐]。A类，0.02 mg/ml XO，0.02 mM黄嘌呤，存在400单位/ml SOD和4-60 mM亚硝酸盐。B类在存在400单位/ml SOD和2–64 mM亚硝酸盐的情况下，添加0.02 mg/ml XO和0.5 mM DBA。在37°C下用21、10、5或2%的氧气吹扫样品溶液，氧气浓度分别达到214、102、51和20μM。复制自[18].

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图6

在厌氧或好氧条件下，XO介导以NADH为还原底物的亚硝酸盐产生NO。用化学发光NO分析仪测量NO生成的初始速率。A类亚硝酸盐浓度对0.02 mg/ml XO和1 mM NADH在0.02–4 mM亚硝酸盐和400单位/ml SOD存在下产生NO速率的影响。B类，如中所示A类，但用空气净化。复制自[18].

以NADH为还原底物，XO介导的NO可能通过以下两种可能的过程产生：

在过程I中，在FAD位点自由的情况下，氧和亚硝酸盐都能接受还原XO的电子。在过程II中，氧还原被FAD位点的NADH结合完全阻断；同时，在钼位置，XO介导的亚硝酸盐还原不受影响。在以NADH为还原底物的好氧条件下，XO的亚硝酸盐还原酶活性被抑制不到30%，这表明大多数亚硝酸盐还原发生在FAD位点被NADH占据时。NADH是厌氧条件下最不有效的还原底物，在有氧条件下是最有效的还原基质。

值得注意的是，XO将氧还原为超氧化物和过氧化氢，被认为是心血管系统中负责活性氧物种的关键酶之一[45,50-53]. XO在缺血条件下可以作为一种强大的亚硝酸盐还原酶，但在有氧条件下也是NO清除剂超氧化物的来源。服用亚硝酸盐后，XO可以同时作为NO和超氧物的来源，XO的产物和功能受氧张力、还原底物和pH的敏感控制。这可能解释了氧嘌呤醇对亚硝酸盐诱导的血管内血管扩张缺乏抑制的观察结果[58]而其他研究表明，XO是将亚硝酸盐还原为NO的主要酶[59-61]. 从报告的酶浓度、动力学数据、降低心脏底物水平来看，由生理量亚硝酸盐产生的钼酶XO和AO介导的NO可以接近或超过组成型NOS产生的最大NO，估计为1.5 nM/s[8,54]XO和AO在组织中产生的这种亚硝酸盐衍生NO可以作为缺血条件下NOS产生NO受损时NO的替代来源。

5.容器壁中亚硝酸盐转化为NO

体内的亚硝酸盐和硝酸盐可以内源性地来自一氧化氮合酶（NOS）途径，也可以外源性地来自饮食。血液中的亚硝酸盐通过与氧血红蛋白反应转化为硝酸盐。血液中检测到的亚硝酸钠水平通常为1μM或更低。然而，组织中的亚硝酸盐水平要高得多。研究表明，心脏中的亚硝酸盐水平可以达到10μM以上[8]. 结果表明，在低氧条件下，10μM亚硝酸盐可引起兔主动脉环大血管扩张（>40%）[55]. 向健康志愿者输注或饮食补充生理水平的亚硝酸盐或硝酸盐，显示前臂循环的血管扩张显著[56]血压显著下降[57]表明体内亚硝酸盐和硝酸盐的减少在生理上相关，并参与血压的调节。在病理或药理学条件下，组织中的亚硝酸盐浓度会增加到更高的水平。由于NOS途径需要氧作为底物，并且随着氧浓度的降低，将亚硝酸盐/硝酸盐转化为NO的非酶途径更加有效，因此，这种NOS依赖性途径可以用作NOS依赖NO形成的后备系统，以确保在氧气供应受限时充分形成NO[24,58,59]. 所有这些研究结果表明，亚硝酸盐依赖性NO生成的潜在生理、病理和药理重要性。然而，亚硝酸盐在组织中的生物转化机制尚不清楚。

为了确定亚硝酸盐转化为NO的机制，在大鼠模型中进行了研究，测量有氧条件下亚硝酸盐对离体主动脉体内血流动力学和体外血管舒张的影响。亚硝酸盐在1–3分钟内缓慢注入大鼠的左颈静脉，此时溶解在PBS（pH 7.4）中的浓度为200 mM的浓溶液达到根据体重和循环血容量计算的最终浓度，即10μM至2 mM[60]. 给麻醉大鼠注射亚硝酸盐后，血流中10μM的亚硝酸盐水平显著降低了收缩压和舒张压。随着亚硝酸盐浓度从10μM增加到2 mM，血压呈剂量依赖性下降[60]这意味着亚硝酸盐或亚硝酸盐衍生物是血管扩张剂(图7).

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图7

亚硝酸盐对正常体温（37°C）麻醉大鼠血压（BP）和心率的浓度依赖性影响。曲线一：心率；曲线b：收缩压；曲线c：舒张压。基准血压和心率表示为基线百分比，指定为100%。

为了确定血管扩张剂是亚硝酸盐还是亚硝酸盐衍生物，在器官室实验中测量了亚硝酸盐对大鼠主动脉环张力的影响。观察到，当亚硝酸盐浓度大于10μM时，亚硝酸盐以剂量依赖性的方式诱导主动脉舒张，亚硝酸钠浓度为2 mM时达到完全舒张（～100%）(图8). NO清除剂20μM oxyHb可抑制亚硝酸盐诱导的血管舒张作用。这表明亚硝酸盐衍生的NO，而非亚硝酸盐本身，是亚硝酸盐诱导血管舒张的物种。已经证明红细胞中的Hb可以将亚硝酸盐转化为NO，并且这种转化在缺氧条件下更有效[61]. 然而，在我们的实验中，在没有红细胞的情况下会发生亚硝酸盐诱导的血管舒张，这表明在我们的试验条件下，红细胞不参与血管舒张。由于硝酸盐诱导的主动脉扩张是在没有红细胞的情况下发生的，因此亚硝酸盐必须在主动脉壁中转化为NO。一些证据表明，亚硝酸盐也可以通过XOR、线粒体电子传输链、细胞色素P450或组织中的NOS转化为NO[16,35,36,62,63]. 因此，目前尚不清楚哪些蛋白质负责在血管壁中将亚硝酸盐转化为NO。因此，我们设计了进一步的实验来研究亚硝酸盐诱导的血管舒张作用，并确定血管壁中亚硝酸盐是否产生可测量的NO，以及哪些蛋白质参与了亚硝酸盐向NO的血管转化。

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图8

在有氧条件下（pH 7.4，37°C），亚硝酸盐对用苯肾上腺素（10μM）预收缩的离体大鼠主动脉舒张的影响。松弛效应表示为最大苯肾上腺素收缩的松弛百分比。

6.测量容器壁中亚硝酸盐产生的一氧化氮

NO电极和EPR技术用于进一步确认血管壁中亚硝酸盐产生NO[60]. 为了检测血管壁中的亚硝酸盐衍生NO，将一段主动脉壁放置在含有37°C组织缓冲液的腔室底部，主动脉壁内皮侧朝上。当主动脉壁中的亚硝酸盐生成NO时，生成的NO可以从主动脉壁扩散到溶液中。因此，在溶液阶段，NO浓度在内皮表面最高，在远离内皮表面的本体溶液中降至零。因此，将NO电极置于内皮表面附近。将500μM亚硝酸盐添加到培养箱中后，观察到内皮表面的NO浓度缓慢增加并达到稳定(图9). 为了测试检测到的NO是否由亚硝酸盐生成，进行了EPR光谱研究。自¹⁴N和¹⁵N NO将分别产生三重和双重EPR信号[8]，我们添加了¹⁴N或¹⁵N亚硝酸盐进入主动脉。如果生成的NO来自亚硝酸盐，我们将分别观察到三重态或双重态EPR信号。我们的实验结果与此预测一致(图10)表明检测到的NO是由血管壁中的亚硝酸盐转化而来的。

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图9

ODQ对有氧条件下（pH 7.4，37°C）主动脉环中亚硝酸盐转化NO的影响。在腔室底部放置一块主动脉壁。将Clark型NO电极置于主动脉壁表面附近。向培养箱中添加500μM亚硝酸盐后，NO电极检测到NO生成。检测到的NO被10μM ODQ消除。箭头显示添加不同药物的时间。

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图10

NO-Fe的代表性电子顺磁共振（EPR）光谱²⁺-在77 K温度下，在添加亚硝酸盐或NO的情况下，从离体大鼠主动脉形成DETC复合物。使用Bruker ER 300光谱仪在9.77 GHz X波段进行EPR测量。主动脉在PBS中与0.5%牛血清白蛋白、亚硝酸盐（500μM）、硫酸铵-铁（II）（1 mM）和二乙基二硫代氨基甲酸酯（DETC）（2 mM）（pH 7.4，37°C）孵育，如下：A类：无（15μM）；B类:¹⁴N亚硝酸盐（500μM）；C类:¹⁵N亚硝酸盐（500μM）；D类：高温（100°C，8分钟）和¹⁴N亚硝酸盐（500μM）；和E类：ODQ（20μM）和¹⁴N亚硝酸盐（500μM）。F类：背景效果¹⁴N亚硝酸盐（500μM），无主动脉。每个光谱代表至少5个独立实验。请注意A类以1:10的震级呈现。复制自[60].

血红素蛋白负责血管壁中亚硝酸盐转化为NO

已使用不同的抑制剂来确定亚硝酸盐转化为NO的可能途径[60]. 观察到氧嘌呤醇、鱼藤酮、粘噻唑、17-Octadecynoic acid（17-ODYA）和L-硝基精氨酸甲酯（L-NAME）对亚硝酸盐引起的主动脉扩张反应没有任何显著影响，这分别表明XOR、线粒体电子传递链、，细胞色素P450或NOS不是亚硝酸盐转化为NO的主要机制。相比之下，亚硝酸盐诱导的主动脉扩张被10μM 1H所阻断-[1,2,4]恶二唑-[4,3-a]喹喔啉-1-酮（ODQ）。众所周知，ODQ是sGC的有效抑制剂[64,65]. ODQ也是血红素蛋白的氧化剂[60,66]. 因此，ODQ对血管舒张的抑制可能是通过阻断NO-sGC-cGMP通路和/或阻断亚硝酸盐通过血管血红素蛋白转化为NO引起的。

为了测试在ODQ存在下亚硝酸盐产生NO的速率是否发生变化，我们在内皮表面附近放置NO电极，以检测在500μM亚硝酸盐存在下主动脉壁亚硝酸盐生成NO的情况。将50μM ODQ添加到溶液中后，我们观察到内皮表面的NO浓度迅速降至零(图9)表明亚硝酸盐生成NO受到抑制。抑制后，内皮表面相对较高的NO浓度迅速扩散到周围溶液中，从而使内皮表面的NO浓度快速降低并接近于零，即本体溶液中的NO浓度。上述实验结果有力地表明，血管血红素蛋白在血管壁中将亚硝酸盐转化为NO。我们的实验结果表明，亚硝酸盐引起大鼠主动脉的剂量依赖性血管舒张，并导致有氧条件下血压的剂量依赖下降。功能和分析研究均表明，亚硝酸盐的血管舒张作用是通过sGC或ODQ抑制的其他血红素蛋白生成NO来介导的。这些发现提供了强有力的证据，证明主动脉平滑肌中的亚铁血红素蛋白参与了有氧条件下亚硝酸盐诱导的NO产生。从这项工作来看，这种血红素蛋白的身份尚不清楚。血红蛋白（Hb）和肌红蛋白（Mb）都被认为是亚硝酸盐还原酶，但在血管壁中不存在显著水平。然而，细胞球蛋白在包括血管在内的许多组织中普遍存在，很可能是这种基于血红素蛋白的亚硝酸盐减少的候选成分。值得注意的是，我们观察到细胞球蛋白被ODQ氧化[60].

与血红蛋白类似，Mb在有氧条件下作为NO-清除剂，在缺氧和缺血条件下作为亚硝酸盐还原酶[58,67]. Mb必须至少部分脱氧才能充当亚硝酸盐还原酶，并且当氧气水平降至P以下时₅₀这将被加强。然而，以前有人提出Mb的调节作用是基于氧化Mb与NO反应和清除NO的能力[68]. 实验证明，NO对Mb-/-小鼠心脏冠脉张力和心肌收缩力的调节更有效。正在进行的工作继续评估sGC、细胞球蛋白、P450、细胞色素C或其他血红素蛋白在这一过程中的作用。