生殖中心起源的滤泡性和弥漫性大B细胞淋巴瘤中EZH2（Y641）的体细胞突变

Illumina文库的制备和测序

使用AllPrep DNA/RNA Mini Kit（美国加利福尼亚州巴伦西亚的齐亚根）和DNaseI处理从总淋巴结切片中提取RNA。对于全转录组鸟枪测序（WTSS/RNA-seq）分析，我们使用了一种类似于我们之前描述的方案的改进方法⁷简单地说，PolyA⁺根据制造商的说明，使用MACS mRNA分离试剂盒（Miltenyi Biotec，Bergisch-Gradbach，Germany）从5-10 ug DNaseI处理的总RNA中纯化RNA。从纯化的polyA合成双标记cDNA⁺使用上标双链cDNA合成试剂盒（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）和浓度为5μM的随机六聚体引物（Invit罗gen）的RNA。该cDNA通过超声波破碎，并按照Illumina配对文库制备协议（Illuminia，Hayward，CA，USA）制备配对文库。

用于构建全基因组鸟枪测序（WGSS）文库的基因组DNA是使用Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit（美国加利福尼亚州巴伦西亚市Qiangen）从相同的活检材料中制备的。在构建文库之前，通过分光光度法（260/280和260/230）和凝胶电泳评估DNA质量。使用功率设置为“7”的Sonic Dismembrator 550，以30秒的脉冲间隔冷却30秒（加拿大安大略省渥太华市Fisher Scientific公司的Cup Horn），将DNA剪切10分钟，并在8%的PAGE凝胶上进行分析。将200-300bp的DNA部分从凝胶切片中分离出来，在4°C下用300μl洗脱缓冲液（5:1，LoTE缓冲液（3 mM Tris-HCl，pH 7.5，0.2 mM EDTA）-7.5 M醋酸铵）洗脱过夜，并使用Spin-X过滤管（Fisher Scientific）和乙醇沉淀进行纯化。WGSS文库是使用Illumina Inc.（Illuminia，Hayward，USA）提供的改良配对试剂盒协议进行准备的。这涉及DNA末端修复和使用Klenow片段（3′至5′外显子缺失）形成3′腺苷悬液，并连接到Illumina PE适配器（带5′悬液）。适配器连接产物在QIAquick自旋柱上纯化（QIAquick spin columns，Valencia，CA，USA），并使用Phusion DNA聚合酶（NEB，Ipswich，MA，USA。使用8%PAGE凝胶从适配器结扎伪影中纯化出所需大小范围的PCR产物。使用安捷伦DNA 1000系列II试验（安捷伦，加州圣克拉拉，美国）和Nanodrop 7500分光光度计（Nanodrot，威明顿，德国，美国）评估和量化DNA质量，随后将DNA稀释至10nM。使用Quant-iT dsDNA HS检测试剂盒和Qubit荧光计（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）确认最终浓度。为了进行测序，使用v1簇试剂在Illumina簇工作站上生成簇。使用Illumina GA上的v3测序试剂生成配对读取_ii（ii）平台遵循制造商的说明。使用Illumina的基因组分析管道v1.0进行图像分析、基数计算和误差校准。配对的WTSS和WGSS文库被测序为36、50或76个周期。WGSS库由13条36纳米读取的流动单元通道、16条50纳米读取的通道和6条76纳米读取的路径组成。

使用读取索引进行有针对性的超深度重新测序

该程序描述了EZH2第15外显子的单个PCR扩增、单个扩增子的索引以及随后的汇集和测序。单个索引允许对来自多路复用库中单个样本的读取进行反褶积，这样可以在同一库中同时对多个样本进行排序。单个样本的基因组DNA标准化为5ng/uL，每个样本的5ng用Phusion DNA聚合酶（美国马萨诸塞州伊普斯威奇新英格兰生物实验室）以96-well格式用基因特异性引物（引物EZH2_015R3和引物EJH2_015F，补充表7)产生~300bp的扩增子。热启动PCR条件：98°C，60s，然后36个循环（98°C-10s，60°C-15s，72°C-30s），最终延伸72°C，5min。在Biomek F/X（Beckman Coulter，Fullerton，CA，USA）上使用AMPure珠（Beckman-Coulter，CA，US）清洁扩增子，并用40uL洗脱缓冲液EB洗脱（QIAGEN，US）。使用1X TAE缓冲液在1.2%SeaKem LE琼脂糖凝胶（Cambrex，East Rutherford，NJ，USA）上对清洁的扩增物进行QC测试。频带由QBit量化^™荧光计（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）高灵敏度分析。然后在室温下30分钟（T4 DNA Pol 5U，DNA Pol I（Klenow）1U，T4 PNK 100U，dNTP混合物0.4mM（Invitrogen），在50uL反应中对大约500ng的每个扩增子DNA样品进行磷酸化和最终修复。使用AMPure珠清洁末端修复反应，并使用Klenow（exo-）5U和0.2mM dATP在1X Klenow缓冲液（Invitrogen）中在Tetrad热循环仪（MJ Research，USA）中在37°C下孵育30分钟，将dATP添加到3′-末端。使用Biomek FX再次清洁AMPure珠子上的DNA。使用0.03uM适配器（多路复用适配器1和2，补充表7)，100ng DNA，T4 DNA连接酶5U，0.2mM ATP，1X T4 DNA连接酶缓冲液（Invitrogen），室温下30分钟。使用Biomek FX上的AMPure珠清洁连接的DNA。选择的DNA样本在QBit上进行量化^™（Invitrogen）。使用引物1.0和2.0（IDT，美国）和96个自定义引物（引物索引如补充表6). PCR程序如下：98°C持续60s，然后是98°C、10s、65°C、15s、72°C、30s的15个循环。使用AMPure珠清洁PCR产物，并在40uL洗脱缓冲液EB（美国QIAGEN）中洗脱。产品质量通过QC凝胶进行评估：1.75%SeaKem LE琼脂糖1X TAE（每个扩增子0.2uL）和生物分析仪-1000（安捷伦科技，加州圣克拉拉，美国）。然后将每个板中的所有96~400bp扩增物（每个孔15uL）汇集到一个单独的1.5mL微量离心管中。因此，一个试管代表96个不同DNA模板的96个聚合和索引PCR产物。使用8%PAGE凝胶（1X TAE）纯化400bp DNA粒级，并在4°C下于400μl洗脱缓冲液（5:1，LoTE缓冲液（3 mM Tris-HCl，pH 7.5，0.2 mM EDTA）-7.5 M醋酸铵中从凝胶片中洗脱过夜。凝胶块使用Spin-X过滤管过滤（美国宾夕法尼亚州匹兹堡费希尔科学公司）。使用乙醇沉淀DNA，并使用安捷伦DNA 1000系列II分析（安捷伦科技，加州圣克拉拉，美国）定量，然后稀释至10nM。使用Quant-iT dsDNA HS检测试剂盒和QBit确认最终浓度^™荧光计（Invitrogen）。从每个索引样本构建一个单独的文库（包含多达96个不同模板DNA的扩增子）。这些库中的每一个都在单个流动池通道上进行了测序。

肿瘤DNA和RNA序列的SNV分析

所有读取结果都与人类参考基因组（hg18）或（对于WTSS）与基因组文件进行了比对，该基因组文件使用MAQ比对器扩增了一组所有外显子-外显子连接序列²⁷v0.7.1。使用与我们之前描述的方法类似的方法，在对齐的基因组序列读取和转录组读取中识别候选单核苷酸变体（SNV）⁷在本研究中，我们的变体调用的一个关键区别是我们小组目前正在开发的贝叶斯SNV识别算法（“SNVmix”）的应用（版本0.11.7；http://compbio.bccrc.ca/？page_id=204)²⁸该方法能够识别覆盖率最低为两个高质量（Q20）基地的SNV。所有被评估为多态性（SNP）的位点都被忽略，包括与dbSNP或Venter个人基因组中的位置匹配的变体²⁹，Watson，匿名亚洲人³⁰和约鲁班³¹个人。此外，该患者生殖系DNA基因组序列中发现的所有候选突变均被忽略。对于目标重新排序实验，密码子641的覆盖率通常大于1000倍读取深度。因此，我们使用跨越该站点的所有明确映射的读取来确定质量不匹配的读取百分比（Illumina基本质量≥20）。报告中每个样本的这些百分比补充信息（补充表6）.

用于SNV鉴定和Sanger序列验证的Amplicon测序

第15外显子EZH2型用EZH2_ASP_1和EZH2-ASP_2从基因组DNA中扩增。M13正向-21和M13反向的引物位点被添加到它们的5′端，以允许扩增子的直接Sanger测序。除非另有说明，扩增子是从肿瘤和匹配的正常患者DNA的基因组DNA中产生的。使用突变检测仪对所有毛细血管痕迹进行分析，并对所有变体进行目测检查，以确认其在肿瘤中的存在和生殖系痕迹中的缺失。

EZH2野生型和突变型SET结构域的计算建模

EZH2 SET结构域序列用于在蛋白质数据库中搜索同源建模的结构模板。MLL1 SET域的可用晶体结构（PDB ID 2w5z）¹²被确定为最佳模板（SET域的序列一致性为39%，没有对齐间隙）。通过蛋白质建模服务器SWISS-model构建EZH2 SET结构域的三维模型³²由于MLL1是一种H3K4结合蛋白，有人担心EZH2（K27）的目标赖氨酸残基可能不在同一构象中。另一个问题是MLL1晶体结构为开放构象，与封闭构象相比，这种构象降低了甲基转移酶活性。构象变化可能会改变Y641的位置。为了证实这一点，我们使用其他结构作为模板构建了替代模型。我们使用了H3K9结合蛋白EHMT1（PDB ID 2RFI）、DIM-5（1PEG）、SUV39H2（2R3A）和G9a（2O8J）以及H3K36结合蛋白SETD2（3H6L）。与Y641相对应的保守酪氨酸残基的显著重叠证实，无论是开放构象还是闭合构象，Y641在所有蛋白质中的位置都保持不变。1PEG和2RFI中的共结晶H3肽帮助我们确认K4和K9在这些模型中的构象非常相似。因此，我们假设EZH2中的K27将形成接近模型所示的构象。

体外EZH2 H3K27三甲基化测定

利用Refseq EZH2的定点突变生成突变构建物({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_004456”，“term_id”：“1732746237”，“term_text”：“NM_004455”}}NM_004456)带有N末端的His标签。使用杆状病毒表达系统（pVL1392，使用巴米希和限制酶). 这五种蛋白质结合在一起形成酶活性PRC2复合物在体外通过Western blot证实四个突变结构中每个结构的EZH2蛋白的表达，并使用抗EZH2。检测板涂有生物素化组蛋白H3（21-44）肽。将纯化的PRC2与S-腺苷甲硫氨酸（在测定缓冲液中）一起加入平板中以检测酶活性。甲基化组蛋白H3是使用一种高度特异的小鼠衍生单克隆抗体测量的，该抗体只识别组蛋白H4的三甲基化K27残基³³（活动主题，目录编号39535。）。用时间分辨荧光（620nm）检测二级抗体，并用铕标记。以不同的纯化PRC2量（0至200ng）测试每个突变株（和野生型EZH2）的PRC2甲基化酶活性。

细胞系

数据库³⁴，KARPAS卡帕斯422³⁵，SU-DHL-6³⁶和WSU-DLCL2³⁷是从DSMZ和所有“OCI-LY”获得的细胞系³⁸这些线来自NIH的L Staudt博士。

来源细胞（COO）测定

根据制造商的方案（Affymetrix），将总RNA反向转录（一个周期）并与U133-2 Plus阵列杂交。使用稳健的多芯片分析（RMA）规范化CEL文件。根据Lenz等人描述的185-基因模型，利用ABC和GCB的模型分数计算原始细胞（COO）。¹¹以及Wright等人³⁹.

本研究的部分资金来自国家癌症研究所癌症基因组办公室（见下文）、加拿大国家癌症研究院（NCIC）特里·福克斯基金会新前沿项目拨款（拨款编号016003/拨款类型230/项目名称：癌症生物学：滤泡淋巴瘤作为癌症进展模型）和Genome Canada/Genome BC Grant Competition III（项目名称：滤泡淋巴瘤基因组的高分辨率分析）授予J.M.C.、M.A.M.、R.D.G.和D.E.H.，并得到了Terry Fox基金会（批准号：019001）的支持。此外，N.A.J.通过NCIC（019005）和迈克尔·史密斯健康研究基金会（MSFHR）（ST-PDF-01793）颁发的奖项，成为特里·福克斯基金会的研究员。M.A.M.是特里·福克斯（Terry Fox）的年轻调查员和迈克尔·史密斯（Michael Smith）的高级研究学者。A.J.M.获得了白血病和淋巴瘤协会的奖学金。R.D.M.是Vanier学者（加拿大卫生研究院），也得到了MSFHR高级研究生奖学金的支持。本研究的实验室工作由基因组科学中心、不列颠哥伦比亚省癌症研究中心和转化与应用基因组中心承担，该中心是省级卫生服务局实验室的一个项目。作者感谢卑诗省癌症基金会和国际狮子俱乐部的支持。作者感谢D.Gerhard的有益讨论。特别感谢C.Suragh和A.Drobnies提供的专业项目管理援助。根据NO1-CO-12400号合同，该项目全部或部分由国家癌症研究所、国家卫生研究院的联邦资金资助。本出版物的内容不一定反映卫生与公共服务部的观点或政策，提及商品名称、商业产品或组织也不意味着美国政府的认可。