生长因子、基质和作用力结合并控制干细胞

摘要

在复杂的体内环境中控制干细胞的贩运、存活、增殖和分化是非常具有挑战性的。在对动物模型和人类的研究中，干细胞移植在注射后已被量化，但在数天或数周后，只有少数细胞残留(1)]. 尽管如此，许多临床试验仍在进行中，尤其是成人骨髓间充质干细胞（MSC）的临床试验，MSC正在被研究用于治疗非造血组织疾病，主要是心肌梗死和外周缺血(2). 虽然FDA批准人类测试胚胎干细胞分化细胞（ESC）是该领域最近的里程碑(三)，两个广泛报道的临床病例突出了干细胞在软组织修复中的一些技术机遇和挑战。2008年，西班牙的一名患者成功移植了一个重建的气管：供体气管首先用洗涤剂脱细胞（不使胶原基质变性），然后用MSC衍生软骨样细胞在旋转生物反应器中对支架进行再细胞化(4). 长期安全性和有效性对监测和了解非常重要。事实上，在第二个案例中，一名患有共济失调毛细血管扩张症（AT）的男孩的小脑被注射了人类胎儿神经干细胞（NSC），四年后，发现了一个干细胞来源的胶质神经元脑肿瘤(5). 植入后，干细胞及其衍生谱系会遇到多种可能影响细胞命运的线索。解析从实验室到临床转化的分子机制的工作将越来越多地受益于广泛的新技术和既定技术。在这里，我们简要回顾了微环境、力学和材料系统的显著特征，这些特征正被用于控制干细胞的基本见解和应用。

生态位相互作用和体外设计

生态位是调节干细胞存活、自我更新和分化的体内微环境。关键的生态位成分和相互作用包括生长因子、细胞间接触和细胞基质粘附(图1A). 这些生态位因子的相互作用对于理解是否需要使任何所需的干细胞反应强健以用于治疗尤其重要，即抵抗体内交付的细胞所遇到的多种类型的扰动。

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图1

干细胞生态位和设计

(A类)可溶性和基质结合因子与细胞间接触、细胞-基质粘附和梯度（如O₂)来指导细胞的命运。(B类)基于转录因子Oct4的免疫荧光，带有细胞外基质（ECM）2D微板的底物控制ESC菌落的大小和ESC的多能性(15). 图：大岛增加了经历自我更新的多能性种群，而小岛抑制了24小时的时间常数导致分化(C)具有微焊缝的基底有助于标准化准球形3D类胚体的直径(21). 细胞和ECM（层粘连蛋白）呈球状对称，内部为多能干细胞。

添加到培养物中或由干细胞和附近的小生境细胞分泌的生长因子通常对细胞命运具有强大的影响，因此在胚胎发育中，生长因子在空间和时间上受到严格的调控(6). 在培养基中，控制二维生态位相互作用的一种方法是利用细胞外基质（ECM）岛的微模式，这限制了分泌生长因子在岛内和岛间的扩散，也限制了基质和细胞接触的调节作用。例如，在人-电子稳定控制系统中，通过在基底上进行微观夯实而形成的ECM岛(图1B)证明了维持和扩大多能国家的最小岛屿规模；这种机制部分基于转化生长因子-β（TGF-β）超家族两个不同成员之间的拮抗作用(7). 这些因素会影响分泌细胞（自分泌）或其他细胞（旁分泌），因此，为了时空控制浓度，已经制造了微流体装置，在灌注已知浓度的活性因子的同时，不断洗去分泌因子。例如，对于人NSC（hNSC），在单个培养箱中对生长因子的微流体控制非常清楚地表明，增殖量和分化细胞的比例遵循严格的反向关系(8). 事实上，大多数终末分化细胞不会增殖，而干细胞和祖细胞会增殖，但在标准培养中很难区分这种差异，因为大多数细胞是半随机爬行的，动态地改变生长因子的任何梯度暴露和与其他细胞的接触。为了直接评估细胞间接触在可溶性因子信号传递中的任何调节作用，已经制造了微机械装置来可逆地将细胞移动到接触状态(7). 结果表明，在特定细胞类型对局部分泌因子产生反应之前，可能需要接触不同的细胞类型。

细胞外基质不仅介导细胞粘附并为细胞提供关键线索（见下文），而且还常常结合生长因子，限制其扩散。这可以通过将生长因子合成地固定在基质上来模拟(9)用于提高MSC的存活率(10)并调节小鼠ESC（mESC）中的选择性转录网络(11).

MSC和ESC与基质或其他细胞的粘附对于存活至关重要——单个细胞在悬浮状态下无法存活，但粘附信号可以用合成模拟物控制得更好。这种材料可以替代人类干细胞常用的非人类生态位细胞或动物衍生基质产品（例如Matrigel™）。在早期与人胚胎干细胞（hESC）和肌源性干细胞的组合研究中，25种不同的丙烯酸酯基聚合物的576种不同组合的刚性点排列在一起，并发现它们与可溶性因子结合，对细胞附着、增殖和谱系诱导产生广泛影响(12). 对于三维培养，交联透明质酸（HA）水凝胶被证明在支持未分化肿块（即类胚体）中的hESC生长方面是独特的，这可能是因为HA是胚胎发育中一种重要的ECM聚合物(13). 也可以使用聚合物微孔和其他方法将类胚体雕刻成可控的直径(图1C)(14,15). 大小控制对于减少氧气梯度和其他调节干细胞命运的物理或化学因素至关重要(16). 尽管如此，类胚体（以及胚胎）内的细胞分离和分化仍需更深入地了解，其机制可能植根于细胞用来感知其微环境的多种途径(17).

力、基质弹性和纤维化

无论是在体外还是体内，细胞都会产生力，并且经常暴露在力下——两者都会影响干细胞的命运。胚胎发生中细胞分化的最初阶段确实在敲除普遍存在的力生成肌球蛋白后被阻断(18). 流动的流体也会对流动中的任何物体产生力（当你把手伸出车窗时，你会感觉到这种力），并且已经发现典型的血流流体力会在孤立的ESC中启动内皮细胞程序(19). 机械变形或应变在实体组织中也很常见（如跳动的心脏、扩张的动脉），施加5%的基质应变可以诱导MSC向平滑肌分化(20). 从机械上来说，是一种力量（f）会使任何物理连接的蛋白质产生应变并影响动力学速率k个蛋白质相互作用或构象变化(21)作为

干细胞很可能拥有比典型的力耦合信号通路集合更多的功能，作为一种手段，使自己对微环境敏感，从流动的液体和应变的组织到具有不同弹性的固体组织，这些微环境包括物理上的微环境(图2A). 事实上，当MSC生长在模拟肌肉弹性并涂有胶原蛋白I的硬凝胶上时，肌源性标记物上调，而当MSC在模拟预钙化骨的硬凝胶中生长时，细胞似乎成骨(21). 增加的诱导因子通过矩阵来增强或反对这种编程。同样，对于NSC，模拟正常大脑的软矩阵更有利于神经元分化，而典型胶质瘢痕的硬矩阵则促进分化为胶质细胞(22). 后面的例子——以及地形模式(23)–建议精心制作的材料可以为特定祖细胞的扩张做好准备。

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图2

干细胞贩运的力量

(A类)为了从循环中渗出并侵入组织，干细胞必须牢固地粘附在血管壁上并承受高流动力。在组织内，额外的物理因素可以引导运动细胞，包括硬组织向细胞植入的组织硬纤维化区域扩散。(B类)软组织弹性量表从软脑开始测量(72)，脂肪(73)和横纹肌(25)到僵硬的软骨(E类粘着范围为20–30 kPa(74))和预钙化骨(25). (C)模拟软组织和硬组织微环境的体外基质（左图）表明，细胞更强烈地锚定在硬基质上，形成局部粘连和肌动蛋白应力纤维。示意图（右）显示基质粘附和生长因子影响细胞生理和谱系。生长因子受体的信号不仅传播到细胞核（蓝色虚线箭头）和直接转录（黑色箭头），还影响Rho-GTPase活性（蓝色虚点箭头）。Rac推动运动向前，Rho调节压力纤维的收缩（红色），两者都可以影响基因表达（红色虚线箭头）。

在体内，当干细胞从其生态位进入循环时(24)或者，当干细胞作为治疗方案的一部分被静脉注射时，液体的力量会推动和拖曳细胞(图2A)它反对粘附在血管壁上，而组织进入需要干细胞运动，并可能受益于干细胞细胞核的高变形性(25). 这些过程与广泛研究的白细胞和转移癌细胞的过程相似[例如：(26)]. 后一种比较特别有趣，因为转移性“捕获”强烈依赖于至少一种基质纤维化因子（催化胶原交联的赖氨酰氧化酶），纤维化瘢痕形成是干细胞许多再生目标共同面临的挑战。

急性心肌梗死后纤维化瘢痕的最新力学测量(27)或者有更多的慢性刺激(28)显示纤维化组织与正常组织相比，局部硬化至少几倍。原子力显微镜探测给出了细胞尺度的弹性E类软组织纤维化伤口约20–60 kPa(27,29)，超过E类用于软组织，与软骨和预钙化骨重叠(图2B).

刚性纤维组织本身可以提供归巢信号。基于使用具有良好控制的弹性、基质配体和密度的各种凝胶基质，发现大多数（如果不是所有的话）细胞粘附、扩散、组装其细胞骨架(图2C)与软基材相比，刚性基材的锚定力更强(30). 因此，在弹性梯度中，细胞在更硬的基质上积累，这一过程被称为“硬度”(31)，这可能构成MSC为什么位于损伤和纤维化部位的生物物理基础(1). 基质也可以成为MSC比标准诱导鸡尾酒更有效的分化线索(32,33). 而据报道，小鼠梗死瘢痕中的MSC在心脏中生成骨骼(34)，MSC也经常被发现可以减轻瘢痕形成(1,27). 最近的“盘子里的疤痕”模型表明，经过充分研究的成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化需要坚硬的基质(E类>20 kPa）和TGF-β，ECM中的生长因子释放依赖于细胞收缩驱动的ECM复合物的展开，该复合物可隔离TGF-(29). 基质和细胞力对干细胞的生长因子调节尚未见报道，但发育关键的细胞间相互作用似乎介导了细胞膜上Notch受体的强制去折叠。力打开一个分裂位点，最终释放出一个Notch片段，扩散到细胞核中影响转录(35).

材料渗透到干细胞生物学中，往往是无意的。干细胞在刚性组织培养塑料上的分离和生长会促进富含肌动蛋白应力纤维的细胞扩散。对于类似的刚性表面，如果MSC接触面积由粘合图案控制(36)研究发现，诱导脂肪和骨骼的混合诱导鸡尾酒会导致小岛屿上的脂肪生成（减少基质接触）和大岛上的骨生成（最大化收缩锚定）。基质和运动的传感机制仍在阐明中，但Rac和Rho在干细胞运动、收缩性和锚定中的生长因子和整合素耦合作用已得到充分证明。在造血干细胞（HSC）中，Rac亚型是植入和骨髓保留的关键调节因子，Rac的激活是通过β1整合素与基质的粘附以及包括基质衍生因子（SDF-1）在内的因素的刺激实现的(37). 生长因子诱导的MSC磷酸化蛋白组中也发现了锚定信号通路的类似原型耦合(38).

符合胚胎内分化对非肌肉肌球蛋白的严格要求(18)MSC中肌球蛋白的药理学抑制阻断了刚性和顺应性底物上的所有谱系(21,36)对蛋白质组的折叠和组装有可测量的影响(39). Rho激酶效应器ROCK的抑制导致肌球蛋白失活，也会阻断刚性底物上的所有谱系(36)，但不在兼容基板上(21). 游离人胚胎干细胞中ROCK的抑制作用(40)也大大提高了生存率；尚未报告对ESC分化的影响。多年来，已知细胞骨架的这种药理学扰动会影响软骨细胞等间充质谱系(41)，但影响可能与基质耦合。气管重建最近的成功(4)清洁剂脱细胞供体气管内软骨生成的合适基质信号可能有益，虽然清洁剂可能保留或不保留组织力学，但并非所有组织再生都可以使用这种方法。

对正常组织和病变组织的物理透视有助于产生新的假设。心脏病是导致死亡的主要原因，是干细胞治疗的主要靶点(2)但心脏发生涉及机械化学因素的复杂相互作用。胚胎源性心肌细胞在弹性小于或等于正常心脏组织的基质上保持自发搏动，但细胞在机械模拟纤维化瘢痕的坚硬基质上抽动并停止搏动(42). 对新生儿心肌细胞的研究进一步表明，ROCK抑制选择性地阻断硬底物上的细胞功能障碍(43). 因此，未来对来源于ESC或诱导多能干细胞的心肌细胞的实验需要密切关注基质微环境。

体内合成生态位

干细胞领域的一个最初假设是，移植细胞将直接参与组织的构建；然而，现在很明显，旁分泌效应也很重要(44). MSC的高级临床应用可用于免疫/炎症性疾病，包括骨髓移植引起的肠道克罗恩病和移植物抗宿主病（GvHD）(1). MSC治疗并不利用组织构建能力，而是发挥免疫调节功能，扩展到伤口愈合和减少瘢痕形成。这些应用再次强调了严格控制干细胞纯度和分化的重要性，需要提高移植细胞的存活和移植策略，以及不同策略可能对移植有用的可能性，这取决于所寻求的特定功能结果。

解决干细胞移植中的一些挑战的一个吸引人的方法是开发和使用材料系统，为细胞创造专门的生态位。传统细胞输注或注射的局限性包括细胞在预定位置的传递和滞留不良，或因失锚（失巢）导致细胞死亡。由于各种天然衍生材料和合成聚合物能够为相互作用的细胞提供粘附力，它们目前正在开发成为干细胞移植的载体；通过这些材料控制粘附位点的呈现（例如结合整合素的肽密度）可以提高移植细胞的存活率和参与组织再生(45,46). 材料结构可用于进一步模板化组织结构(图3A、B)由相互作用的干细胞形成(47)，一种用于在动物模型中形成组织补片以增强心脏功能的方法(48)并为一名患者制作一个新的下颌骨(49). 尽管凝胶力学特性可以调节体内毛细血管的形成，但还没有证据表明基质力学特性可以调控体内干细胞的命运(50)支持此概念。一个复杂的问题是，人工生态位的力学特性和降解速率通常是耦合的，并且降解速率已被证明可以通过移植的干细胞促进骨再生(51).

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图3

体内合成生态位

(A类)材料可以填充特定的解剖缺陷（粉红色）以定位移植细胞，并作为新组织形成的支架。(B类)患者形成的下颌骨使用金属和聚合物结构，其中植入了MSC和细胞因子(49). (C)设计的材料生态位维持干细胞的生存能力和增殖，同时在适当的分化阶段促进向外迁移。(D类)干细胞从生态位分散到再生骨骼肌(60). (E类)招募宿主干细胞以随后归巢到组织损伤部位。(F类)带有GFP骨髓源细胞（绿色）的小鼠显示再生肌肉浸润了内皮细胞标记物CD31（红色）双重标记的细胞，表明新生血管化(75).

生长因子或细胞因子可以通过控制释放粒子系统（例如(52))或来自用作合成干细胞壁龛的材料支架。通过从移植载体中协调释放胰岛素样生长因子（IGF），心肌细胞功能得到了显著改善(46)间充质干通过释放TGF-β家族蛋白进行成骨(53). 然而，完全的再生只能来自再生组织和周围组织的机械、血管和神经整合。呈现血管生成因子的材料可以增强局部血管化(54)增加移植干细胞的存活率和随后的再生(55). 材料也可用作ESC衍生内皮细胞祖细胞的载体，形成新的血管网络(56). 神经系统整合也可以通过提供神经营养因子梯度的材料来增强(57)并植入横断神经附近(58).

与其用材料将移植细胞固定在特定位置，还不如模拟干细胞龛来调节子细胞的增殖、分化和向周围组织扩散，以参与再生或提供大量营养因子(图3C、D). 因为细胞分化阶段、形态因子和细胞因子的暴露以及植入部位的条件都会调节移植后的干细胞功能(59,60)，这种利基方法似乎非常有用。最近，一种材料增强了卫星细胞衍生的成肌细胞在损伤后促进骨骼肌再生的能力，该材料激活了驻留细胞，但阻止了终末分化，直到细胞离开该材料(61). 这种方法在广泛散布分泌影响宿主细胞的营养因子的干细胞群体中可能最为有用。物质导向的内皮祖细胞甚至会协调局部血管重建和坏死肢体的抢救(62).

体内已经存在潜在有用的细胞群，并将这些细胞吸引到所需的解剖部位(图3E、F)具有提供新的治疗选择的潜力。与体外生物反应器相比，成本和复杂性应降低。例如，以骨修复为例，植入不含生长因子的简单生物材料显示了体内环境在生成天然骨方面的强大作用(63)–尽管存在植入损伤的风险。用G-CSF或他汀类药物从骨髓中动员内皮祖细胞也在缺血性条件下进行测试(1).

系统生物学与翻译

HSC和MSC体内的命运决定似乎受到生理需求的严格调控。除了前面强调的所有细胞外信号外，刺激反应可能会因组织特异性的配体和受体表达模式而复杂化(64)以及顺序自分泌和旁分泌诱导环(65)随着细胞群的发展和适应而出现(66). 全基因组研究(67)和数学模型(68)已经开始生成相关的网络模型，但只有少数尝试解开细胞间信号(69,70). 细胞（与蛋白质或基因相对）可以被视为网络中的节点，通过细胞接触、共享基质和分泌因子连接。将免疫细胞，特别是自然杀伤细胞和巨噬细胞整合到这种网络中，对于理解植入细胞是如何植入组织并对其作出贡献的，或者是如何被清除的，这一点非常重要(71).

除了这些被引用的研究之外，干细胞研究对未来的机遇和其他挑战提供了重要的观点。可溶性因子策略结合对细胞粘附和力学的关注，似乎可以与合成材料利基协同作用，尽管如此，组织衍生基质在使干细胞治疗安全、有效和常规方面发挥重要作用。

致谢

参考文献和注释

图图例中的其他参考