摘要
非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的特征是胰岛素抵抗、血清游离脂肪酸（FFA）水平升高和肝脏脂肪浸润。肝细胞中甘油三酯的积累是肝脏吸收和酯化循环FFA的结果。与当前理论相反，肝脂肪变性似乎是一个解毒过程，因为游离脂肪酸对肝细胞具有直接的细胞毒性，抑制甘油三酯的形成会增强游离脂肪酸的毒性。肝细胞凋亡是NAFLD的主要特征，与疾病严重程度相关。由于FFA诱导的毒性，或脂肪凋亡，代表了NAFLD的发病机制，本文将重点介绍导致肝细胞脂肪凋亡的细胞途径。到目前为止，还没有证明对NAFLD患者有效的治疗方法，深入了解脂肪凋亡的分子介质有助于促进该病的有效治疗策略。
关键词：BH3-only蛋白、CCAAT/增强子结合同源蛋白、c-Jun N末端激酶、死亡受体、内质网应激、肝脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎
非酒精性脂肪性肝炎与脂肪细胞凋亡
非酒精性脂肪肝（NAFLD）在西方国家非常普遍，通常与代谢综合征的临床特征有关，如2型糖尿病、肥胖和血脂异常[1]. 这种疾病的特点是脂肪在肝脏中积聚，包括广泛的肝脏疾病，从良性单纯性脂肪变性到脂肪性肝炎。非酒精性脂肪性肝炎（NASH）占NAFLD的5-10%，与肝脏炎症以及脂肪变性、肝细胞损伤和不同程度的纤维化相关[2]. NASH代表一种潜在的进展性肝病，因为它最终会导致肝硬化、慢性肝病伴门脉高压、肝衰竭和肝细胞癌[三,4].
NASH的一个主要危险因素是胰岛素抵抗，它发生在代谢综合征的背景下[1,5,6]. 事实上，外周脂肪组织内脂肪分解的胰岛素抑制受损会导致血浆游离脂肪酸（FFA）水平升高[7]. 因此，脂肪来源的FFA向肝脏的输送增加直接导致2型糖尿病患者肝脂肪变性的发展[8]. 非二糖组织中脂质的异常和过度积累，脂质的储存能力有限，导致细胞功能障碍或细胞死亡，这一现象称为脂质凋亡[9,10]. 虽然脂肪变性是NAFLD的特征，但脂肪凋亡似乎是由FFA介导的，而不是由其酯化产物（甘油三酯）介导的。事实上，许多研究表明，非酯化FFA对肝细胞具有固有毒性[11–17]而FFA酯化生成中性甘油三酯似乎是一个解毒过程[18,19]. 在小鼠实验性脂肪性肝炎期间，肝脏FFA水平升高[20,21]NASH的特征是血清FFA水平升高和肝细胞凋亡，循环FFA的大小与疾病严重程度相关[22,23]. 与肝细胞凋亡增加一致，升高的血清半胱氨酸天冬氨酸酶裂解细胞角蛋白18片段可区分单纯性人类肝脂肪变性和NASH[24]. 因此，FFA诱导的毒性或脂肪细胞凋亡可能是与NASH相关的潜在机制。
肝脏脂质
循环游离脂肪酸可用性的增加和向肝脏输送游离脂肪酸的增加很可能在NAFLD肝脂肪变性的发展中起着关键作用。在本文中，术语FFA是指具有16个以上碳原子的饱和和不饱和长链FFA。
肝游离脂肪酸
进入肝脏的游离脂肪酸来源于饮食甘油三酯的水解或空腹状态下脂肪组织甘油三酸酯的脂肪分解。肝脏中脂肪堆积过多也可能是由于脂肪合成增加、脂肪氧化（β-氧化）减少或以VLDL形式输出脂肪的能力降低。然而，在人类和啮齿类动物身上进行的研究表明，肝甘油三酯的过度积累主要是脂肪衍生FFA向肝脏输送的增加和增强的结果从头开始肝脏中的脂质合成，仅受到通过β-氧化或VLDL输出的脂质处置的轻微影响[25]. 此外，膳食脂类对肝脂肪变性的影响最小[26].
游离脂肪酸通过被动扩散和促进运输进入细胞，包括特定的脂肪酸转运蛋白（FATP）[27]和脂肪酸转位酶FAT/CD36[28]. 这些脂肪酸转运蛋白表达的改变直接有助于脂肪诱导的三酰甘油在细胞中的积累。特别是，FATP2和FATP5在肝脏中高度表达，并参与长链FFA的摄取[29]. 肝脏FATP5的缺失通过将脂质流向外周组织来减少小鼠肝细胞中的膳食脂质沉积；在饮食诱导的肝脂肪变性动物模型中，FATP5的小发夹RNA靶向敲除可以减少已建立的肝脂质积聚[30]. 此外，在喂食高脂肪饮食的小鼠中，FAT/CD36的肝脏表达增加[31,32]肝细胞中FAT/CD36的强制表达显著增加了肝脂肪酸的摄取[31]. 迄今为止，尚未报道FATP5或FAT/CD36的遗传多态性，但这些蛋白表达的改变可能在NAFLD的易感性和/或进展中起重要作用。在NAFLD患者的肝脏中，FAT/CD36和FATP5的肝脏表达也增加，并与肝脏脂肪含量相关[33–35]. 最后，胞质肝特异性脂肪酸结合蛋白（L-FABP）的基因缺失减少了不饱和脂肪酸进入细胞甘油三酯[36,37]L-FABP在人类NAFLD早期肝脏表达增加[38].
脂肪变性和非酒精性脂肪性肝炎的肝脏脂质
NASH患者循环中FFA水平增加，并与疾病严重程度相关[23,39,40]. 尽管从头开始NAFLD患者的脂肪生成增加[40]，这些人中60-80%的循环游离脂肪酸来自脂肪细胞的脂肪分解，并在肝脏中提供大约60%的游离脂肪酸[26]. 更准确地说，阿尔梅达等研究了NASH患者循环长链FFA增加的确切成分。NASH被证明主要与饱和FFA、棕榈酸（C16:0）、单不饱和FFA（C18:1）和棕榈油酸（C16-1）水平升高有关[39]. 尽管总（酯化和非酯化）肝饱和和不饱和脂肪酸增加，但与正常患者相比，NAFLD和NASH患者的肝活检中肝饱和或不饱和FFA没有或只有轻微增加[41,42]. 因此，有证据表明，过量的循环饱和和不饱和脂肪酸在肝细胞内迅速酯化，形成二酰甘油酯和三酰甘油酯[41].
值得注意的是，在患有良性单纯性脂肪变性的NAFLD患者中观察到肝总脂质（二酰甘油酯或三酰甘油酯）含量的最大增加，而不是在患有更晚期NAFLD的NASH患者中[41]. 除此之外，一个新出现的概念表明，细胞内积累的甘油三酯并无毒性本身相反，过量非酯化饱和FFA或其代谢产物的积累会介导脂肪毒性[43]. 事实上，大量数据表明，饱和FFA对肝细胞的毒性大于不饱和FFA[11–17]. 最近的一些研究报告称，饱和和不饱和FFA之间的毒性差异取决于它们快速酯化并合并为甘油三酯的能力[18,44,45]. 此外，酯化不饱和脂肪酸是各种脂质中最丰富的，包括磷脂和甘油三酯。因此，肝细胞暴露于无毒的不饱和FFA（例如油酸和棕榈油酸）会导致甘油三酯的大量积累，而暴露于有毒的饱和FFA中（例如棕榈酸）会使肝脂滴增加最少[18,44,45].
将饱和FFA转化为甘油三酯可保护肝细胞免受饱和FFA诱导的毒性(). 事实上，单不饱和FFA，如油酸和棕榈油酸，可以抑制饱和FFA引起的肝毒性[15–18]不饱和脂肪酸的保护作用是因为它们能够将饱和脂肪酸重新导向甘油三酯的储存[18]. 例如，硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD）1催化棕榈酸和硬脂酸去饱和分别生成棕榈油酸和油酸，在肝脏甘油三酯积累中起重要作用；SCD1过度表达可增加甘油三酯合成并防止脂肪细胞凋亡[18]. 相比之下SCD1系列在小鼠实验性脂肪性肝炎中减少肝脂肪变性并加重肝细胞凋亡和肝损伤[44]. 以类似的方式，在NASH小鼠模型中，反义寡核苷酸介导的二酰甘油酰基转移酶2（FFA酯化为甘油三酯的关键酶）沉默，尽管降低了肝甘油三酸酯含量，但仍会加重肝损伤和纤维化[19].
饱和游离脂肪酸向中性甘油三酯转化是肝脏脂肪凋亡的保护机制胰岛素抵抗是NAFLD的一个特征，导致循环FFA的血清浓度升高。这些循环的FFA通过特定的脂肪酸转运体（CD36/FAT和FATP5）和结合蛋白（L-FABP）运输到肝细胞。在肝细胞内，这些游离脂肪酸可酯化为中性甘油三酯，导致肝脂肪变性。FFA的酯化作用是一种缓冲机制，使细胞在面对过多的非酯化FFA暴露时保持活力。饱和和不饱和FFA的脂肪凋亡潜能不同。不饱和FFA的毒性低于饱和FFA，并被DGAT2酶快速酯化，并作为甘油三酯并入。相比之下，SCD1酶将饱和FFA转化为不饱和FFA似乎是将饱和FFAs转化为甘油三酯形成所必需的。未能通过抑制SCD1或DGAT2活性将非酯化FFA分解为甘油三酯，导致肝细胞凋亡和肝损伤，进而导致脂肪性肝炎的发展。
DGAT：二酰甘油酰基转移酶；FATP：脂肪酸转运蛋白；FFA：游离脂肪酸；L-FABP：肝特异性脂肪酸结合蛋白；NAFLD：非酒精性脂肪肝；SCD：硬脂酰辅酶A去饱和酶。
从单纯脂肪变性到NASH，在人类NAFLD进展中观察到了不同的L-FABP表达模式[38]. L-FABP在单纯脂肪变性患者的肝脏中过度表达，但随着NAFLD阶段进展到NASH，L-FABP的表达显著降低[38]. 类似地，给小鼠喂食高脂肪饮食会导致广泛的脂肪变性，而不会引起肝细胞损伤或纤维化，从而增加肝脏SCD1的表达，而给小鼠喂食蛋氨酸和胆碱缺乏的饮食会再现严重NASH患者中观察到的纤维化性脂肪性肝炎，从而显著降低SCD1的表达[44]. 因此，NASH肝损伤发生的潜在致病机制可能涉及细胞能力受损，将有毒FFA并入中性甘油三酯。
脂肪变性和脂肪性肝炎中的肝细胞死亡
肝细胞无法通过将多余的游离脂肪酸转化为甘油三酯来处理它们，这与肝细胞脂肪凋亡风险增加有关，而脂肪凋亡是NASH的主要致病特征[22]. FFA诱导毒性的相关机制尚未完全确定，但最近令人信服的数据表明，肝细胞脂肪凋亡主要是由FFA诱导的细胞内细胞器，特别是内质网（ER）和线粒体的脂毒性应激引起的。
内质网应激
内质网紊乱似乎与脂肪凋亡途径有关，甚至可能是介导细胞死亡的重要因素。内质网是一种重要的细胞器，除其他功能外，还负责蛋白质的合成、成熟、折叠和运输，以及脂质的合成和包装，以及细胞钙稳态的调节。这些过程的扰动产生了一种称为内质网应力的条件。作为一个主要事件，内质网应激导致被称为未折叠蛋白反应（UPR）的适应性和保护性信号网络的激活，该信号网络用于克服应激刺激并重建内质网稳态[46]. 然而，如果细胞无法适应，持续的内质网应激将触发促凋亡信号，通过激活下游分子（主要是c-Jun N末端激酶（JNK）和转录因子CCAAT/增强子结合同源蛋白（CHOP））间接导致细胞死亡。
内质网应激反应由三种不同的内质网跨膜信号分子诱导，即激活转录因子6（ATF6）、PKR-like ER kinase（PERK）和肌醇需要酶（IRE）1α，这些分子可被伴侣葡萄糖调节蛋白（GRP）78保持不活动。作为初始事件，这三种激酶的激活将诱导多种机制来减少内质网中未折叠蛋白的负担。然而，当这些适应性机制无法重建内质网内稳态时，过度激活常驻内质网激酶将诱导促凋亡信号。当激活时，PERK磷酸化并灭活真核翻译起始因子（eIF）2α，减少mRNA翻译并减少内质网中的蛋白质负荷。矛盾的是，eIF2α的磷酸化选择性地有利于ATF-4的翻译[47]，调节GRP78的启动子[48]也导致转录因子CHOP的转录上调。活性IRE1α经典切割X盒结合蛋白（XBP）-1 mRNA，合成的剪接蛋白sXBP-1控制与ER辅助降解、蛋白质折叠和蛋白质质量控制相关的广泛基因的上调[49]. 此外，活性IRE1α可以招募适配器分子TNF-受体相关因子2，进一步招募激活JNK信号通路的凋亡信号调节激酶[50]. 虽然PERK和IRE1α的激活将促进重建内环境稳定的细胞保护过程和促凋亡过程，但ATF6主要上调GRP78的表达和ER降解增强甘露糖苷酶样蛋白，导致ER-caperone活性增加和错误折叠蛋白的降解[51,52].
先前对肥胖的遗传和饮食小鼠模型的研究表明，内质网应激和肝脏中UPR的激活在肥胖诱导的胰岛素抵抗和2型糖尿病的发展中起着决定性作用[53]. 事实上，研究表明，肥胖诱导的内质网应激通过持续的JNK活化导致胰岛素受体底物-1磷酸化和失活，从而抑制胰岛素受体信号[53]. 此外，在肝脏脂肪变性的饮食小鼠模型中，内质网应激诱导的CHOP表达和XBP-1型mRNA剪接在大鼠肝脏中增加并与肝损伤的发展相关[16]. 最后，在NAFLD和NASH患者中，观察到PERK的强烈激活，如eIF2α磷酸化增加所反映的[54]; 在NASH患者的肝活检中也观察到IRE1α下游靶点JNK的磷酸化和活化[13,54].
在肥胖诱导的肝脂肪变性中，内质网应激和UPR信号激活的机制尚不完全清楚。然而，脂肪肝中的脂肪酸组成，而不是肝脏脂肪变性本身，似乎是诱发内质网应激介导的肝损伤的重要决定因素。因此，尽管喂食富含多不饱和脂肪酸或饱和脂肪酸的食物的大鼠积累的肝甘油三酯的程度相似，但只有喂食富含饱和脂肪酸食物的大白鼠表现出强烈的内质网应激标记物激活和肝损伤[16]. 由于细胞内的游离脂肪酸被输送到内质网并在内质网内酯化，因此用游离脂肪酸淹没肝细胞可能会干扰内质网功能并诱导内质网应激反应。根据这个概念，内质网饱和脂质含量的增加直接损害内质网的形态和完整性[55]. 最近在体外研究表明，饱和FFA诱导的肝细胞凋亡依赖于内质网应激介导的CHOP诱导和JNK激活；不饱和FFA对肝细胞的低毒性可能是因为它们不能诱导常驻ER激酶、PERK和IRE1α依赖的信号通路[15,17,45]. 由于伴侣蛋白（如GRP78和钙网蛋白）的钙依赖性，正常蛋白质折叠需要适当的ER-ca水平[56]. 内质网钙的缺失会导致蛋白质的错误折叠，并可能触发UPR或内质网应激。事实上，饱和FFA耗尽了肝细胞中的ER钙储存，而这一过程通过饱和FFA部分导致了ER应激[17]. 内质网释放到细胞液中的钙也可以被线粒体吸收，促进细胞器的功能障碍，从而触发细胞凋亡[57].
CHOP下游目标
CCAAT/增强子结合同源蛋白是一种诱导亮氨酸拉链转录因子，在内质网应激诱导的细胞凋亡中起重要作用。尽管CHOP敲除对FFA介导的内质网应激诱导的胰腺β细胞凋亡具有保护作用[58]并防止酒精性肝损伤中的肝细胞凋亡[59]，其在脂肪细胞凋亡中的作用以及CHOP促进脂肪细胞凋亡的机制尚不完全清楚。
考虑到CHOP是一种转录因子，最近的研究表明CHOP调节Bcl-2家族几个成员的转录。Bcl-2蛋白家族调节线粒体凋亡途径，该蛋白家族由促凋亡和抗凋亡成员组成。例如，ER应激介导的CHOP表达下调抗凋亡蛋白Bcl-2[60]而CHOP及其异二聚体伴侣C/EPBα直接与促凋亡蛋白Bim的启动子结合并上调Bim转录[61]. 据报道，Bcl-xL表达减少和Bim表达增加有助于饱和FFA介导的肝细胞凋亡[11,12,62]. 然而，FFA诱导的Bcl-2家族成员的调节是否取决于CHOP转录活性，值得进一步研究。
在人类癌细胞中进行的研究表明，CHOP可以转录上调TNF相关凋亡诱导配体（TRAIL）受体2（TRAIL-R2或死亡受体5[DR5]），这是TNF受体基因超家族的成员[63]. 死亡受体的上调，如TRAIL受体和/或Fas可以通过外源性细胞途径促进细胞凋亡[64]. TRAIL与脂肪变性相关的肝损伤有关。例如，在NASH患者的肝活检中观察到DR5的表达增强[65]. 类似地，FFAs上调肝癌细胞系中DR5的表达，而沉默DR5表达可防止FFAs介导的凋亡[65]. 虽然健康的人肝细胞对TRAIL有抵抗力，但FFA诱导的脂肪变性使肝细胞对RAIL细胞毒性敏感[66]. 其他死亡受体也可能与脂肪性肝炎的发病机制有关。事实上，NASH患者肝脏中死亡受体Fas（或CD95）和TNF-α受体1的表达增强[22,67]. 在NASH实验模型中Fas也增加，FFA处理的肝细胞过度表达Fas[68]. 此外，肥胖诱导的脂肪变性增加了肝细胞对Fas配体介导的凋亡的敏感性[22,69]. FFA诱导的内质网应激是否调节这些DR的表达仍有待探索。
JNK信号通路
c-Jun N末端激酶属于有丝分裂原活化蛋白激酶家族，在两种非酒精性脂肪性肝炎饮食小鼠模型中被认为是FFA诱导肝细胞脂肪凋亡的中心介导物[70–72]在人类NASH中[13,54]; JNK的药理抑制可防止FFA诱导的肝细胞凋亡[11]. JNK持续激活，继发于饱和FFA刺激的有丝分裂原活化蛋白激酶激酶MLK3[73]和/或二次饱和FFA引起的内应力[15,50]，可通过转录和转录后机制引起细胞死亡信号[74]. 本节将更详细地讨论这些机制。
在已知的三个JNK基因中，只有JNK1号机组和JNK2号机组在肝细胞中表达[75]这两种同工酶交替剪接，产生p54和p46蛋白的α和β亚型[76]. 虽然JNK1和JNK2都与肝损伤有关，但这两种亚型根据损伤刺激不同地促进肝细胞凋亡。而JNK2似乎在TNF-α诱导的肝损伤模型中诱导细胞凋亡[77]最近的研究表明，增强的JNK1信号转导在脂肪性肝炎小鼠模型中诱导肝细胞凋亡中起着重要作用[70,71].
c-Jun N-末端激酶-1主要参与转录因子c-Jun的磷酸化[13,70,71,78]，激活蛋白-1（AP-1）转录因子复合物的关键成员。在脂肪性肝炎的实验模型中，高水平的磷酸化c-Jun和增强的AP-1复合物结合活性与肝细胞凋亡增加相关[70,71]. 最近的一项研究确定，Bcl-2家族促凋亡成员p53上调凋亡调节剂（PUMA）的JNK1依赖性诱导，以及随后Bax的激活，也有助于肝细胞的脂凋亡[13]. 在本研究中，饱和FFA介导的JNK1/c-Jun磷酸化导致形成活性AP-1复合物，该复合物直接结合PUMA的启动子并上调其在肝细胞中的转录[13]. 基因缺失JNK1号机组阻止FFA介导的c-Jun激活和PUMA诱导[13]和降低小鼠脂肪性肝炎介导的肝细胞凋亡[70,71]. 同样，晚期NAFLD患者（NASH患者）JNK的持续激活[54]与含有AP-1复合物的肝脏c-Jun的DNA结合活性显著增加相关[79]，肝脏PUMA水平显著增加[13]和肝细胞损伤的发展[22,54].
另外，JNK还可以在转录后磷酸化和调节Bcl-2家族的其他成员。例如，JNK介导的抗凋亡蛋白Bcl-2或Bcl-xL的磷酸化抑制其抗凋亡活性并促进细胞凋亡[80]. 相反，Bad、Bim或Bax的JNK依赖性磷酸化增强了这些蛋白的促凋亡潜能[81–83]. Bcl-2家族中这些促凋亡和抗凋亡成员的转录后修饰是否发生在脂毒性损伤期间尚不清楚，也不知道每个JNK亚型在这些过程中的确切作用。最后，已经证明JNK也转录上调DR5[65]和Fas配体[84]; 如前所述，这两个因素也可能导致脂肪细胞凋亡。
BH3-only蛋白与脂质凋亡中的线粒体功能障碍
促凋亡BH3-only蛋白家族成员，包括Bad、Bid、Bik、Bim、Bmf、Hrk、Noxa和PUMA，是脂肪凋亡的关键调节因子。这些蛋白质是细胞死亡的生物传感器，并启动核心促凋亡机制。其中，饱和FFA、棕榈酸可诱导肝细胞中Bim和PUMA的表达[11–13]. 在这种情况下，Bim的诱导被证明是由FoxO3a的转录激活引起的，FoxO3a在被蛋白磷酸酶2A去磷酸化后迁移到细胞核中并结合比姆发起人。使用小干扰RNA敲除Bim可部分保护肝细胞免受脂肪凋亡[12]. 先前的观察表明，蛋白磷酸酶2A可以被内质网应激激活[61]这一机制可能解释了其在肝细胞脂肪凋亡过程中的激活。如前所述，饱和FFA还通过JNK1/AP-1依赖机制刺激PUMA表达，以及彪马小鼠肝细胞对棕榈酸介导的凋亡产生抵抗[13].
鉴于Bim和PUMA具有互补功能，这两种促凋亡蛋白很可能在脂肪凋亡中协同作用，正如在其他细胞死亡过程中所证明的那样[85]. FFA介导的Bim和PUMA诱导导致Bcl-2家族多域促凋亡成员Bax的激活[11,13,86]. Bim和PUMA可以直接绑定和激活Bax[87,88]. 此外，PUMA可通过结合和禁用原生物Bcl-2蛋白（如Mcl-1和/或Bcl-xL）的功能间接促进Bax活化[89,90]. 有趣的是，棕榈酸介导的肝细胞凋亡也会导致抗凋亡蛋白Mcl-1和Bcl-xL的丢失。抑制Mcl-1降解或强制过表达Bcl-xL可通过饱和FFA减弱细胞凋亡[14,62].
因此，前面讨论的数据表明，毒性饱和的FFA激活线粒体细胞死亡途径[11]. 事实上，线粒体外膜Bax的激活和寡聚导致线粒体功能障碍，效应caspases 3、6和7的下游激活，最终导致细胞凋亡死亡[91]. FFA诱导的Bax活化受Bim和PUMA调节[11–13]，但溶酶体通透性和蛋白酶的释放，如组织蛋白酶B，也可能导致FFA诱导的线粒体功能障碍[92]. Bax的表达也可能在小鼠实验性脂肪性肝炎期间增加[72]NASH患者的肝组织中，肝细胞凋亡增加，线粒体结构和功能异常[22,93–95].
其他脂质分子
脂细胞增多症不仅限于FFA。当过量存在时，其他脂质，如神经酰胺和胆固醇，也可以触发细胞凋亡过程。虽然这些脂质作为信号分子的机制尚不完全清楚，但一些证据表明，它们也可能促进肝细胞的脂质凋亡。
神经酰胺
神经酰胺在胰岛素抵抗和肥胖中的作用已被充分证明[96,97]. 此外，神经酰胺信号，最重要的是，从头开始神经酰胺的合成在非肝细胞的脂肪凋亡过程中起重要作用[96,98,99]. 神经酰胺是鞘脂代谢中的核心脂质。神经酰胺在细胞内的积累可能是由鞘磷脂酶水解鞘磷脂或从头开始通过丝氨酸棕榈酰转移酶（SPT）和神经酰胺合成酶进行合成。从头开始神经酰胺合成发生在内质网中，脂肪酸部分，通常是棕榈酰辅酶a，与鞘氨醇的氨基结合。SPT是从头开始神经酰胺的生物合成及其活性取决于长链FFA的可用性。因此，饱和FFA处理后肝细胞中神经酰胺浓度增加[15]. 棕榈酸和硬脂酸诱导的细胞凋亡与从头开始小鼠造血细胞系神经酰胺的合成[100]; 饱和FFA诱导的细胞凋亡被以下药物抑制剂减弱从头开始神经酰胺合成。此外，在喂食高脂肪饮食的小鼠中观察到脂肪神经酰胺水平的增加和相关的SPT活性的增加[101]皮下脂肪组织中神经酰胺的积累似乎反映了人类脂肪肝的发展[102]. 脂质组学分析显示，与对照组小鼠相比，遗传性肥胖小鼠肝脏中的甘油三酯积累和神经酰胺水平呈正相关[201]. 然而，饱和脂肪饮食诱导的小鼠肥胖通过广泛的内质网应激激活和肝细胞凋亡导致肝损伤，与神经酰胺生成无关[16]. 饱和FFA诱导的肝细胞凋亡也与神经酰胺无关[15,62]以及饱和FFA诱导Bim表达[12]. 神经酰胺在人类脂肪肝发病机制中的作用尚不清楚。死亡受体Fas的刺激激活鞘磷脂酶，导致神经酰胺的快速积累，这一过程似乎在Fas诱导的细胞凋亡的调节中起着重要作用[103]. NASH患者肝脏中Fas表达增强[22]不能排除神经酰胺可能通过Fas诱导的凋亡信号级联在脂肪细胞凋亡中发挥作用。然而，最近的一项研究表明，与正常患者相比，NAFLD患者的肝脏神经酰胺含量没有变化[104].
胆固醇
众所周知，游离胆固醇具有高度的细胞毒性。脂肪性肝病患者的肝脏脂质成分分析表明，与对照组相比，NAFLD和NASH患者的游离胆固醇逐渐增加[41]尽管游离胆固醇增加，但三组之间的肝胆固醇酯水平没有变化。最近的一项研究表明，喂食高胆固醇饮食的大鼠肝细胞中游离胆固醇负荷增加，形成微泡脂肪变性，并对TNF-α和Fas诱导的肝细胞死亡和炎症敏感[105]. 在这些大鼠中，由于线粒体谷胱甘肽耗竭，线粒体自由胆固醇负荷导致肝细胞对TNF-α的敏感性。脂肪的类型而非数量是肝细胞对Fas和TNF-α易感性的重要决定因素，因为饮食诱导的肝内甘油三酯积累不足以使大鼠对DR介导的毒性敏感[105]. 饮食中补充胆固醇可以增加大鼠脂肪组织中血浆中的总神经酰胺水平，这可能是胆固醇的细胞毒性作用的原因[106]. 动脉粥样硬化巨噬细胞中的游离胆固醇积累导致ER钙储备耗尽，UPR激活和ER应激诱导的凋亡[107,108]. 然而，啮齿动物肝细胞内质网的游离胆固醇负荷不足以诱导内质网应激反应[105]. 因此，游离胆固醇在人类脂肪肝发病机制中的作用尚不清楚，游离胆固醇诱导肝毒性的机制有待进一步研究。
治疗方法
到目前为止，还没有证明对NASH患者有效的治疗方法。治疗的重点是改善疾病的相关条件，如肥胖、糖尿病和高脂血症。超重肝病患者的体重减轻表明肝功能和肝肿大持续改善[109]因此仍然是主要的非药物治疗选择。与减肥不同的是，药物治疗并没有持续有效。一些降低胰岛素抵抗和增加肝脏胰岛素敏感性的药物值得关注。例如，二甲双胍改善了肥胖小鼠的脂肪肝疾病，逆转了肝肿大、脂肪变性和血清丙氨酸氨基转移酶异常[110]. 在人体试验中，二甲双胍改善了NASH患者的胰岛素敏感性并降低了血清丙氨酸氨基转移酶浓度，但这些有益作用是暂时的[111].
因此，新的治疗策略侧重于与NASH的发展和进展有关的分子原因。肝细胞凋亡是NASH的重要特征[22]，抗凋亡治疗的发展可能对该综合征有用。由于可以利用这种凋亡的特异性调节来开发新的药物治疗，本节将对凋亡过程的几个潜在靶点进行综述().
饱和游离脂肪酸诱导肝细胞凋亡的分子机制饱和的FFA积聚在内质网中，导致内质网功能紊乱和内质网应激反应的诱导，由两种内质网受体激酶IRE1α和PERK的磷酸化和激活介导。磷酸化的IRE1 a激活涉及JNK激活的凋亡途径。活性JNK磷酸化转录因子c-Jun，导致促凋亡BH3-only蛋白PUMA的转录上调。PERK的激活导致转录因子CHOP的诱导，CHOP上调促凋亡BH3-only蛋白Bim的表达。Bim与PUMA协同激活促凋亡执行蛋白Bax，导致线粒体功能障碍、效应半胱天冬酶激活和凋亡。CHOP可进一步上调死亡受体的表达，如死亡受体5，使脂肪肝细胞对循环死亡配体（如TNF-相关凋亡诱导配体）敏感。
CHOP：CCAAT/增强子结合同源蛋白；ER：内质网；IRE：需要肌醇的酶；FFA：游离脂肪酸；JNK：c-Jun N末端激酶；P： 磷酸盐；PERK：PKR样内质网激酶；PUFA：多不饱和脂肪酸；PUMA:p53上调凋亡调节剂。
半胱氨酸蛋白酶抑制剂
如前所述，费尔德斯坦等已证明caspase 3激活和肝细胞凋亡是人类NAFLD的显著病理特征，并与疾病严重程度相关[22]. 饱和脂肪酸诱导的肝细胞凋亡依赖于线粒体功能障碍、细胞色素c（c）释放和caspase3/7激活。使用泛酶抑制剂Z-VAD-fmk或IDN-6556抑制半胱氨酸天冬氨酸酶活性，可显著降低用棕榈酸或硬脂酸处理的肝细胞的细胞死亡[11]. 观察到类似的效果体内在实验性脂肪性肝炎小鼠模型中。事实上，在喂食NASH小鼠模型的小鼠中，延长泛酶抑制剂VX-166的治疗时间会降低caspase-3的激活并减少隧道阳性细胞的数量[112]. 尽管肝脂肪变性得到改善，肝纤维化得到改善，但在NASH小鼠模型中，抑制剂不足以完全消除肝细胞死亡，也不降低血清丙氨酸氨基转移酶浓度[112]. 尽管如此，Gilead Sciences，Inc.（CA，USA）开发了一种新型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂GS9450，目前正在NASH患者的IIA期临床试验中进行评估。
组织蛋白酶B抑制剂
一些证据表明，NASH患者肝细胞中观察到的线粒体结构和功能异常[94,95]，参与NAFLD的进展[113]. 饱和FFA诱导原代和转化肝细胞线粒体功能障碍[11,62,92]. 最近的数据表明，在这种情况下线粒体功能受损是由于FFA诱导Bax易位到溶酶体，随后溶酶体通透性和组织蛋白酶B释放所致[62,92]. 因此，肝细胞组织蛋白酶B的遗传和药理学抑制均减少了饱和FFA诱导的线粒体膜通透性和细胞色素c的释放[62,92]; 组织蛋白酶B基因缺失减轻小鼠脂肪性肝炎介导的线粒体功能障碍、肝细胞凋亡和肝损伤[92,114]. 在NAFLD患者的人类肝组织中也观察到溶酶体渗透和组织蛋白酶B释放到胞浆中，并且与炎症活动的程度相关[114]. 因此，抑制组织蛋白酶B酶活性可能是预防NASH相关线粒体功能障碍的潜在策略。
膳食中添加不饱和游离脂肪酸
饱和FFA对肝细胞的毒性大于不饱和FFA[11–17]，而不饱和FFA可以从饱和FFA诱导的caspase激活和凋亡中拯救肝细胞[15,17,18,44,45]. 不饱和脂肪酸的保护作用包括抑制内质网应激的生物标志物，即CHOP诱导和JNK激活，防止内质网应激依赖性的促凋亡BH3蛋白PUMA和Bim的上调，以及减少Bax激活和随后的线粒体功能障碍[45]. 因此，补充n-3多不饱和脂肪酸（PUFA）体内高脂饮食大鼠脂肪肝及肝损伤程度的改善[115].
此外，在NAFLD患者的肝组织中观察到长链n-3 PUFA的缺失[116]并可能促进疾病的发病机制[117]. 饮食中补充n-3 PUFAs可降低NAFLD患者的肝甘油三酯含量和血清丙氨酸氨基转移酶水平，并改善胰岛素抵抗[118,119]. 然而，临床试验尚未证实在NAFLD患者中饮食补充n-3 PUFA的疗效。
JNK抑制剂
慢性或过度激活JNK会导致全身胰岛素抵抗，促进糖尿病和代谢综合征。JNK，仅在NASH患者的肝活检中激活[13,54]有助于NAFLD的发病[11,13,70,71]. 在饱和FFA诱导毒性的细胞模型中，持续的JNK激活介导肝癌细胞和分离的小鼠和人类肝细胞中PUMA和Bim依赖性Bax的激活和凋亡[13]使用JNK抑制剂时，这两种情况都会被阻止[11,13]. 虽然JNK1亚型介导实验性脂肪性肝炎中的促凋亡过程，但JNK2亚型似乎对脂肪细胞凋亡有抗凋亡作用[71]. 事实上JNK2号机组加重高脂饮食诱导的小鼠肝细胞损伤；JNK2的细胞保护功能通过其促进Bim降解和细胞清除的能力介导[71]. 因此，尽管不加区分的JNK抑制可能干扰JNK2亚型的有益抗凋亡作用，但选择性抑制JNK1亚型可能是一种潜在的有效治疗NASH的方法。
化学伴侣
内质网紊乱可能与脂肪毒性有关，在啮齿动物和人类脂肪性肝炎中都检测到内质网应激[16,54]. 饱和FFA激活内质网应激的PERK和IRE1α依赖臂，从而导致各种肝癌细胞中CHOP诱导和JNK激活[15,17,45]. 有趣的是，饱和FFA似乎只调节UPR的选择性成分。事实上，饱和FFA并没有促进参与蛋白质折叠的有益ER反应，例如上调分子伴侣（GRP75和钙网蛋白），以及增强甘露糖苷酶样蛋白[15]. 同样，在饱和FFAs治疗后，主要ER伴侣GRP78的水平没有改变，或只是轻微改变[A卡扎瓦Y等.，U未出版D类ata公司,15]. 鉴于ATF6激活控制GRP78的表达[51,52]，ATF6在脂肪细胞凋亡过程中可能保持沉默，没有研究报道ATF6活化参与饱和FFA介导的细胞凋亡。
由于未激活UPR的保护性反应可能导致脂肪毒性，因此重建ER稳态可能是限制脂肪凋亡的一种新策略。最近的一项研究报告称，向遗传性肥胖小鼠口服化学伴侣（如4-苯基丁酸）或胆汁酸衍生物（如牛磺脱氧胆酸）可降低肝脏内质网应激的生化标记物（如PERK、IRE1α和JNK活化），改善胰岛素敏感性，减少肝脂肪变性并使肝功能酶丙氨酸氨基转移酶正常化[120]. 因此，调节内质网和增加折叠能力的分子制剂在减少与肥胖和NAFLD相关的肝脏损伤方面可能具有治疗潜力。然而，值得注意的是，在人体试验中，熊去氧胆酸未能改善NAFLD[121].
结论
非酒精性脂肪性肝病是发达国家最常见的肝病，与胰岛素抵抗有关，胰岛素抵抗是代谢综合征的一个组成部分，导致脂肪（主要是甘油三酯）在肝脏中积聚。在NAFLD中，肝脏无法应对过多的脂质。虽然肝脂肪变性没有毒性，但在NAFLD（NASH）晚期观察到的高血清FFA浓度可诱导肝细胞凋亡，而脂肪凋亡可能是导致单纯脂肪变性进展为脂肪性肝炎的关键机制。FFA的脂毒性作用是多方面和复杂的，涉及肝细胞细胞器的正常功能受损，如内质网。FFA介导的内质网应激可能在激活导致肝细胞凋亡的众多细胞内过程中发挥关键作用。其中包括JNK和CHOP依赖性的促凋亡BH3蛋白和死亡受体的上调、Bax激活、线粒体通透性和随后的效应半胱天冬酶激活。目前，还没有证明对NASH有效的治疗方法。因此，更好地了解脂肪细胞凋亡的分子机制有助于确定治疗这种疾病的新方法。
未来展望
脂肪毒性现象是与NASH相关的众多事件之一。尽管在过去10年中积累了大量有关脂肪凋亡相关分子因素的信息，但饱和FFA诱导ER应激反应的机制仍不清楚。一个合理的解释是，内质网的饱和脂质含量过多导致内质网形态和功能受损[55]. 然而，无毒的FFA油酸盐未能诱导肝细胞内质网应激[15,17,45]，也被报道会导致胰腺细胞ER扩张[122]. 因此，未来的研究需要集中于揭示饱和FFA导致内质网应激激活的特定上游机制。
此外，饱和FFA似乎只调节UPR的选择性成分。事实上，饱和FFA并没有诱导或仅适度诱导保护性内质网反应，例如内质网伴侣上调[A卡扎瓦Y等.，U未出版D类ata公司,15]以增加蛋白质折叠并重建ER稳态。这一观察结果表明，FFA可能不会诱导完全的ER应激反应，因为选择性ER反应在脂肪凋亡过程中保持沉默。有必要进一步研究脂肪细胞凋亡过程中内质网应激介导的机制。
执行摘要
肝脏脂质
循环FFA主要来源于脂肪组织甘油三酯的脂肪分解，通过脂肪酸转运蛋白5和FAT/CD36转运到肝细胞。在肝细胞内，这些游离脂肪酸可酯化形成中性甘油三酯，导致肝脂肪变性，正如NAFLD患者所观察到的那样。
游离脂肪酸的酯化似乎是一个解毒过程，因为非酯化的游离脂肪酸对肝细胞具有固有的毒性并诱导细胞凋亡。
饱和和不饱和FFA在脂肪凋亡潜能方面存在差异；饱和长链FFA的毒性明显高于不饱和FFA，而不饱和FFAs可以拯救饱和FFA诱导的肝细胞凋亡。
将有毒FFA并入中性甘油三酯的细胞能力受损可能是NASH肝损伤的原因。
脂肪变性和脂肪性肝炎中的肝细胞死亡
肝细胞脂肪凋亡主要是由于内质网（ER）功能的紊乱和两种ER受体激酶（肌醇需要酶（IRE）1α和PKR-like内质网激酶（PERK）的磷酸化和激活介导的ER应激反应的诱导所致。
长期持续的内质网应激触发促凋亡信号，该信号由转录因子CCAAT/增强子结合同源蛋白（CHOP）的PERK依赖性激活和c-Jun N末端激酶（JNK）信号通路的IRE1α依赖性诱导介导。JNK和CHOP分别上调促凋亡BH3-only蛋白、p53上调凋亡调节剂（PUMA）和Bim的表达。
PUMA与Bim协同激活促凋亡执行蛋白Bax，导致线粒体功能障碍和效应半胱天冬酶激活。两者都有助于FFA诱导的细胞凋亡。
在NASH患者中，死亡受体的上调，如TNF-相关凋亡诱导配体受体和/或Fas，也可以使脂肪肝细胞对细胞外凋亡途径敏感。
