通过5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）掺入研究，肝细胞通常处于增殖静止状态，转化率为1/20000~40000细胞。1轻度至中度肝细胞损伤或耗竭时，肝细胞复制增加，提供必要的重新填充细胞质量，而不会引起肝干/祖细胞（HSPC）反应。1–4然而，在严重急性损伤和慢性损伤中，HSPC的参与更为显著。4,5在这种条件下，成熟肝细胞的增殖受到抑制或肝实质严重受损，在啮齿类动物模型中，可以观察到增殖的HSPC，根据其形态称为“卵圆细胞”（OVc）。6,7这些细胞可以表达对应于肝细胞和胆管细胞谱系的标记物，8,9实验证明可以分化为这两种类型的细胞。10–12
历史上，假设有4个解剖HSPC室1：（1）在实质-基质界面复制肝细胞（所谓的“流动肝”假说）13; （2） 胆道树最近端的分支，包括Hering管（CoH），也可能包括胆管14,15; （3） 小叶内胆管的胆管细胞16; （4）门脉周围损伤中可见的导管周“空”细胞（换句话说，缺乏肝细胞和胆道标记物），例如大鼠烯丙醇中毒。17
在许多器官的干/祖细胞中已发现许多其他抗原，如c-kit、Sca-1、Thy-1和CD-34，并已证明在卵巢癌中存在。1然而，这些标记物只突出了具有干细胞样功能的亚群的细胞群富集，而不是专门识别干细胞本身。在目前缺乏唯一的HSPC标记物的情况下，有必要求助于干细胞的功能定义，以鉴定活组织中的干细胞。这一功能定义包括不对称分裂干细胞的缓慢循环，从而自我更新，同时产生快速增殖的多潜能转运扩增群体。目前，基于干细胞这些功能的最新实验方法允许体内上皮干细胞龛的展示，称为“标记保留细胞”（LRC）分析。这些检测已在许多器官中成功且重复地进行。18–21
标准的LRC分析利用了这样一个事实，即在不对称干细胞分裂中，两个子细胞，一个是新的替代干细胞，另一个是转运扩增细胞的祖细胞，都被氚化胸腺嘧啶或BrdU标记。新的替代干细胞在分裂后处于静止状态，因此保留了其合并标签。同时，另一个后代，换句话说，快速分裂的传递放大细胞，很快就会将标记物稀释到器官中无法检测到的水平，并快速频繁地周转（例如皮肤、肠道），或者在器官严重损伤的“追逐”期间耗尽标记物，而不会持续快速地周转。因此，LRC是实验标记的，体内位于该组织干细胞龛中的干细胞。因此，在许多含有上皮细胞的器官中，例如皮肤、，22小肠，23肾，24和前列腺。25然而，由于肝脏循环缓慢，这种LRC实验不可能在成年后无损伤地进行，尽管使用损伤模型可能会刺激肝脏中的干细胞激活，并使肝脏LRC实验成为可能。
对乙酰氨基酚过量服用(N个-乙酰基-第页-氨基酚（APAP）是美国急性暴发性肝衰竭最常见的原因26,27是一种泛特异性、可预测的肝毒素。该化合物通过细胞色素P450混合功能氧化酶代谢为肝毒性代谢物。28,29一旦发生暴发性肝功能衰竭，死亡率极高。30鉴于这种临床重要性和结果的严重性，我们先前定义了APAP毒性的小鼠模型，并特别注意了与OVc增殖的剂量关系。31
为了确定标记保留细胞作为HSPC小生境的功能测定，我们对APAP损伤进行了LRC研究，为BrdU掺入HSPC提供了加载剂量，并“追逐”BrdU在转运扩增OVcs中的冲刷().
“标记染色”细胞分析的实验程序总结。小鼠在服用APAP之前禁食8小时，然后在第-14天以500 mg/kg的剂量腹腔注射APAP，在第0天以750 mg/kg的APAP注射。APAP给药前后均给予含BrdU的水。在第0天、第28天和第56天分别处死三只小鼠进行实验。溴脱氧尿苷；APAP，对乙酰氨基酚。
结果
APAP诱导肝损伤后BrdU的掺入
使用BrdU/PanK双重免疫染色证明一剂APAP后BrdU掺入(). 我们用两种方法评估了BrdU染色的频率：首先，我们尽可能通过计算平均3347±1695个BrdU阳性的肝胆细胞来评估特定细胞类型中BrdU呈阳性的百分比。我们能够充分量化小叶内肝细胞、胆周肝细胞（即与门脉周围的PanK胆道结构直接相邻的肝细胞）和属于CoH的PanK阳性OVc。我们无法以这种方式评估导管周“空细胞”单核细胞，因为如果它们不携带BrdU，则没有特定的形态学或免疫表型标记来可靠地鉴定它们。
BrdU标记细胞在APAP损伤肝脏中的定位。APAP处理的BrdU标记小鼠肝脏对BrdU（棕色）和PanK（红色）进行双重免疫染色。这些图像来自第二次（追踪）剂量APAP后28天的图像，但代表了稍后时间点的变化。（A） BrdU标记OVc；（B） 小叶内胆管BrdU标记的胆管细胞；（C） BrdU标记的导管周“空”细胞；（D） BrdU标记的胆周肝细胞；（E） BrdU标记的胆道周围肝细胞伴微弱的PanK染色。原始放大倍数，×20。OVc，卵圆细胞；溴脱氧尿苷；APAP，对乙酰氨基酚；PanK，胆道细胞角蛋白。
特定单元类型的分布如所示在以500和750 mg/kg的剂量注射APAP后，在整个观察期内，BrdU标记的OVc在所有类型的BrdU标签细胞总数中的百分比均低于初始水平。然而，以最高剂量（1000 mg/kg）注射APAP反而会在给药后12小时内诱导BrdU标记OVc的百分比增加。相反，在所有剂量下，BrdU阳性胆道周围肝细胞的分布迅速减少，并且在2周的观察期间低于初始水平。早期注射500 mg/kg和750 mg/kg APAP后，胆道周围细胞百分比的下降趋势与OVc的下降趋势平行。然而，在1000 mg/kg剂量下注射APAP后，OVc和胆道周围肝细胞之间存在差异。
在损伤后14天（336小时），单次“加载”剂量APAP诱导的肝损伤后BrdU标记细胞的分布占总BrdU标签肝外胆管细胞的百分比。注意，对照组（仅注射PBS的小鼠）卵圆细胞百分比较高，反映了腹腔液体注射后这些细胞的增加，而没有任何肝细胞损伤；因此，与注射APAP的小鼠相比，只有它们的相对数量相当高。OVc，卵圆细胞；APAP，对乙酰氨基酚；PanK，胆道细胞角蛋白。
还应注意的是，对照组（仅注射PBS的小鼠）卵圆细胞的高百分比反映了腹腔液注射后这些细胞的增加，而没有任何肝细胞损伤，正如我们在早期对小鼠APAP损伤的研究中所报告的那样31; 因此，与注射APAP的小鼠相比，只有它们的相对数量相当高。
定量BrdU掺入的第二种方法是评估这三个易于识别的细胞室中的BrdU阳性细胞，并根据总BrdU阳细胞的百分比显示每个细胞室的数据。为此，计算了平均1935±909个OVc，以确定BrdU标记的OVc在总OVc中的百分比。所有剂量的BrdU阳性OVc百分比增加反映了OVc的扩张。在观察期间，BrdU标记的OVc的范围约为2%-14%。在所有剂量的APAP注射后，BrdU标记的OVc的发生率比未注射的对照肝脏增加了大约三到七倍（数据未显示）。
LRC分析
使用BrdU/PanK双重免疫染色法对LRC进行确认和量化(). 在第28天采集的20个连续切片中进行BrdU/PanK的双重免疫抑制。示例如所示导管反应中标记的OVc串似乎与1级的小胆管相连(). 追踪标记保留肝细胞的六个连续切片如图所示需要进行三维分析，以揭示位于远离门静脉道（第5级和第6级）的单个标记阳性肝细胞通常与OVc（第1级和第2级）相邻成串（第1-4级）排列。
连续切片中BrdU（棕色）和PanK（红色）的免疫组织化学。（A） 导管反应中标记保留细胞的连续图像样本。在每个级别上，带有标签的OVc用箭头标记。导管反应中的这些细胞与1级的小胆管相连（箭头）。（B） 追踪标记肝细胞的六个连续切片。BrdU和PanK的双重免疫染色显示，一个远离门脉的单个标记保留细胞（第5和第6级）位于标记保留肝细胞中（第2-4级），并与OVc连接（第1和第2级）。原始放大倍数，×40。OVc，卵圆细胞；溴脱氧尿苷；PanK，胆道细胞角蛋白。
我们检测了20个最小门静脉束中LRC细胞数量的变化。从第0天到第28天，BRDU阳性的胆周肝细胞和小叶肝细胞的密度在统计学上下降(P（P）<0.0001）。这些细胞的数量在第28天到第56天之间从统计学上增加(P（P）<0.0008，以及P（P）分别<0.0231）。同时，第二次APAP注射后56天内，OVc密度没有明显变化，因为急性损伤“追逐”标签被洗掉。
为了研究BrdU标记细胞的分布，对每个病例中的3550±2894个LRC进行计数，将其分为三种细胞类型：OVc、胆周肝细胞和小叶肝细胞().
APAP“追踪”后不同时期“标签阳性”细胞的分布。（A）APAP“追逐”后第0天、第28天和第56天最小门静脉道中标签阳性细胞的密度。前4周内，胆道周围和小叶内的标记阳性肝细胞减少，随后4周内增加。在8周的随访中，标记阳性OVc的密度在统计学上没有变化。（B） APAP“追踪”后第0、28和56天标记阳性细胞的分布。在第28天和第56天之间，标记阳性的小叶内肝细胞的百分比在统计学上有所下降，而在同一时期，标记阴性的胆周肝细胞的比例有所增加。标记的OVc百分比没有统计学差异。这些数据表明，小叶内肝细胞不是“真正的”标记保留细胞，随着时间的推移和正常的肝细胞周转而失去标记。
在第0天和第28天之间，“标记”OVc、胆周肝细胞和小叶肝细胞的分布没有显著差异。然而，从第28天到第56天，胆周肝细胞的百分比显著增加[P（P）= 0.0067; 95%置信区间（CI），−18.80至−8.97），而小叶肝细胞的分布显著减少(P（P）= 0.0069; 95%置信区间8.93–18.94）。在此后期，BrdU标记的OVc的分布没有显著变化（每个样本计数1635±1111）。
讨论
人类急性肝衰竭最常见的原因是故意或意外的APAP损伤。尽管啮齿类动物有许多化学损伤模型，但没有一个显示出与APAP毒性相似的组织学或生理学特征。因此，我们已经开始研究小鼠和人类APAP损伤之间的相似性，以阐明人类的情况。31
由于肝脏中的正常细胞周转率相对较低，必须通过诱导损伤对标记物（加载剂量）的摄取，然后再进行第二次损伤来研究LRC测定，以提供“追逐”。已经确定了APAP损伤以类似于人类肝脏的方式产生OVc的效用，我们使用该模型来完成BrdU标签的摄取和追踪损伤，以揭示标签保留。四个细胞室被鉴定为含有LRC。
LRC：Hering运河
根据先前的研究预测，在APAP给药后的56天内，发现主动脉旁近端胆管树内的BrdU阳性/PanK阳性细胞被BrdU标记保留。因此，这些细胞代表真正的LRC，其循环速度足够慢，在损伤相关的初始细胞分裂后至少持续8周。考虑到肝内HSPC区室在没有明显损伤的情况下可能有助于正常肝细胞周转的罕见性，这些数据支持Hering管是一种肝内干细胞生态位。
LRC：胆周肝细胞
这些BrdU肝细胞通常位于门脉周围，与PanK阳性细胞直接相邻，这是本研究中最令人意外和有趣的发现。在损伤后最早的时间点，这些细胞最常被鉴定为BrdU阳性，而不是中腺泡到中央腺泡的肝细胞，这些肝细胞迅速翻转，代表了对实质性损伤的主要再生反应。但随着时间的推移，这些BrdU实质内肝细胞逐渐减少，而BrdU阳性的胆周肝细胞数量相对增加()这表明，尽管实质内肝细胞分裂时失去了BrdU，但BrdU阳性的胆周肝细胞仍然存在；换句话说，他们也代表了一个真正的LRC群体。从表面上看，这一发现似乎支持古老的“流动肝”假说，该假说稍作修改，以反映我们目前的理解，即肝细胞腺泡并非始于极限板，而是始于肝小管和胆道树之间的界面，即CoH。
然而，对连续切片和CoH-LRC与胆周肝细胞LRC的相对比例的检查表明，胆周肝组织LRC实际上是通过分化过程从CoH-LRC衍生而来的。首先，偶尔胆周肝细胞-LRC显示微弱，明显残留PanK染色(). 二、连续切片检查()显示了从PanK阳性细胞串（即CoH）末端拖出的BrdU-阳性肝细胞的线性阵列，表明其来源于这些结构。第三，第28天和第56天的数据显示，虽然实质性肝细胞BrdU染色减少，但CoH-LRC和胆道周围肝细胞-LRC的组合数量保持稳定，支持前代人群向后代人群的分化。因此，CoH-LRC和胆道周围肝细胞-LRC可能代表相同的细胞群，但处于不同的分化状态。
LRC：导管内胆管细胞
先前的研究表明，人类肝脏小叶间胆管内的HSPC是基于c-kit表达的。16在我们自己对由多种疾病引起的肝硬化患者的人隔内肝细胞“芽”进行的研究中，我们还发现，尽管大多数再生肝细胞结节与CoH有关，但一些似乎直接从小叶间胆管中芽。8因此，我们目前在胆管中发现胆管细胞-LRC并不一定令人惊讶；然而，在这些结构与肝实质本身缺乏直接联系的情况下，很难看出这些结构如何在APAP损伤中作为HSPC促进肝细胞再生。相反，这些可能代表正常胆道系统重新填充流中的标记细胞，或对APAP诱导的实质性塌陷继发的物理损伤的反应，在完全恢复的情况下，这些细胞几乎没有理由分裂。
LRC：胆道周围“空白”细胞
这些细胞特别难以研究，并且通过这组调查还没有向我们透露它们的性质。这些细胞最初被描述为代表由烯丙醇毒性诱导的大鼠肝损伤门脉周围模型中OVcs的一个亚群。17这些是小的导管周细胞，对典型的OVc标记物如α-脂肪蛋白、胆汁型细胞角蛋白（用抗体OV-6染色）、白蛋白呈阴性，对白细胞共同抗原（CD45）和结蛋白也呈阴性。这些空细胞的来源尚不清楚，尽管它们可能来源于胆道外，甚至肝外，是我们自己研究肝移植的线索。考虑到这些细胞的可能来源，我们不仅评估了α-fetoprotein和胆汁细胞角蛋白染色，还评估了以前在OVc上发现的造血类型标记，包括CD34、Sca-1、Thy-1和CD45。我们还评估了波形蛋白和结蛋白的染色。成功的PanK/BrdU双重染色方案使我们能够最终确定这些小的导管周细胞为PanK阴性。然而，我们无法为其他标记物建立可靠的双重染色。在对APAP损伤的肝脏进行单标记染色时，唯一能染色导管外单核细胞的标记是CD45，而CD45很少染色。
因此，我们可以得出结论，这些导管外单核细胞LRC对于所测试的肝胆标志物和所描述的造血标志物以及其他可能被结蛋白或波形蛋白标记的基质细胞来说是“无效的”。它们在门脉周围损伤模型中更为显著的表现，而不是更为典型的小叶中心APAP损伤，表明当Hering干细胞生态位的通道被破坏或闭塞，同时门脉周围肝细胞被破坏时，它们可能在肝胆再生中发挥更重要的作用。
因此，总之，使用APAP损伤模型，我们应用了标准方法来识别体内功能性干细胞生态位位置。我们发现证据部分或全部支持先前假设的四个生态位：肝腺泡开始时的肝细胞（尽管现在被重新定义为那些与CoH相遇的肝细胞，而不是那些直接位于限制板中的门脉基质上的肝细胞）、CoH中的PanK阳性细胞、导管内胆管细胞、，我们的数据表明，随着CoH-LRC分化为肝细胞，从而成为胆周肝细胞-LRC，这两种细胞中的第一种在生理上是相互联系的，这并不奇怪。其他两个细胞区室在肝胆再生中缺乏明确的参与，这可能反映了肝损伤的性质。
然而，很明显，HSPC参与肝脏修复可能比正常快速细胞更新的器官更复杂，并且根据损伤的严重程度、损伤位置和损伤的慢性程度，多个部位可能发挥HSPC生态位的作用。对于了解HSPC的位置和功能，有必要对其他损伤模型进行进一步的LRC研究，并通过从胎儿到成年出生后的正常发育跟踪LRC。此外，需要采用更复杂的转基因方法来鉴定LRC，而不是依赖细胞周期进程来进行初始标记，例如Tumbar等人已经报道的皮肤LRC的方法。32此类模型目前正在我们的实验室中开发，可能会进一步阐明这些重要问题。
