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癌细胞。作者手稿；PMC 2010年3月28日发布。
以最终编辑形式发布为：
癌细胞。2005年3月；7(3): 239–249.
数字对象标识：2016年10月10日/j.ccr.2005.01.027
PMCID公司：项目经理2846360
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院187881
PMID：15766662

雄激素消融减轻对前列腺/前列腺癌限制性抗原的耐受性

查尔斯·德雷克,1,* 艾米·杜迪,2 玛丽安·米哈利奥,2 黄庆泰,1,三 埃林·凯莱赫,1 索米亚·拉维,1 爱德华·L·希普基斯,1 达拉斯B.苍蝇,1 尤金·肯尼迪,1 美晓龙,2 帕特里克·W·麦加里,2 李·科耶尔,2 威廉·纳尔逊,1 德鲁·M·帕多尔,1和亚当·阿德勒2,*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

总结

为了了解T细胞对前列腺癌的反应，我们创建了以前列腺限制模式表达模型抗原的转基因小鼠，并将这些动物与发生自发性前列腺癌的TRAMP小鼠杂交。前列腺特异性CD4 T细胞的过继转移表明，在没有前列腺癌的情况下，前列腺大部分被忽视。肿瘤发生允许T细胞识别前列腺，但这种识别是耐受性的，导致增殖流产，最终导致系统水平的低反应性。雄激素消融术（转移性前列腺癌最常见的治疗方法）能够缓解这种耐受性，使前列腺特异性T细胞在接种疫苗后扩张并发展效应器功能。这些结果表明，雄激素消融术后应用免疫疗法治疗前列腺癌可能是最有效的。

介绍

开发治疗癌症的疫苗策略的主要障碍之一是T细胞室通常对肿瘤抗原产生耐受性(Staveley-O’Carroll等人，1998年;Morgan等人，1998年;Hu等人，1993年). 对于肿瘤和正常组织之间共享的抗原，这种困难可能最为明显，因为免疫系统在肿瘤形成之前很久就可以获得这些抗原。从免疫系统中分离出来的抗原在这方面可能有一些优势，直到肿瘤发生时才被识别。前列腺就是一个潜在的例子，前列腺癌是美国男性最常见的恶性肿瘤(Jemal等人，2003年). 前列腺的非生命特性，再加上专门的前列腺上皮细胞与前列腺肿瘤共享抗原的观察，使得前列腺癌成为一个吸引人的免疫治疗靶点。这一概念得到了实验的证实，实验表明，使用辐照前列腺癌细胞接种疫苗结合CTLA-4阻断剂可导致免疫反应，这种免疫反应仅限于正常和恶性前列腺组织(Hurwitz等人，2000年).

为了了解对前列腺的免疫反应并研究前列腺癌免疫疗法，我们创建了转基因小鼠，在前列腺特异性最小先证基因启动子（Pro-HA）的控制下表达模型抗原流感血凝素(Rennie等人，1993年). 我们发现，原始的前列腺特异性CD4 T细胞对前列腺几乎一无所知，这表明，在没有肿瘤发生的情况下，前列腺特异性耐受可能不会产生。当Pro-HA小鼠与患有自发性前列腺癌的TRAMP小鼠杂交时，原始T细胞能够识别前列腺。然而，这种认识是耐受性的，导致增殖流产，缺乏效应细胞因子的产生，并削弱对疫苗接种的反应性。

雄激素消融是前列腺癌最常见的治疗方法，无法通过手术或放射治疗(Denmeade和Isaacs，2002年). 在没有前列腺癌的小鼠中，我们发现雄激素消融导致前列腺T细胞识别度的短暂增加，然后恢复到基线识别水平。在患有前列腺癌的小鼠中，在雄激素消融后，前列腺的T细胞识别能力逐渐下降。在系统水平上，这种识别能力的下降足以消除CD4 T细胞的耐受性，并允许这些细胞在接种疫苗后发挥效应功能。这些数据表明，在雄激素消融后应用免疫疗法治疗前列腺癌可能是最有效的。

结果

前列腺上皮表达HA转基因小鼠的制备及鉴定

为了产生只在前列腺上皮表达HA的转基因小鼠，最小的大鼠Probasin启动子（−426到+28 bp）(Greenberg等人，1994年,1995;Rennie等人，1993年)用于驱动HA表达。由于前列腺上皮细胞产生大量分泌到前列腺腔中的蛋白质，并且其中许多蛋白质是免疫疗法的潜在靶点，因为它们也在前列腺肿瘤上表达，我们设计了一种分泌型HA（HA）被截断以去除细胞质结构域和跨膜结构域的C末端一半。产生的HA蛋白保留Kd日-限制性表位位于克隆4 TCR转基因CD8细胞识别的跨膜结构域的N末端一半(Morgan等人，1996年)以及I-Ed日-限制性表位位于6.5 TCR转基因CD4细胞识别的胞外结构域(Kirberg等人，1994年) (图1A). 为了验证HA肽是分泌而不是在质膜上表达的，我们采用了两种策略。首先，用表达全长或截短HA序列的重组痘苗病毒感染P815细胞，然后用HA特异性单克隆抗体H-18进行FACS分析(图1B). 染色前的固定和渗透导致细胞内检测到HA wt和HA s肽（尽管HA s肽的水平较低）；然而，未固定和渗透的细胞仅表现出HA wt肽的表面染色。因此，似乎HA肽被翻译，但在细胞表面没有表达。为了验证这种表面表达缺失是分泌的结果，COS-7细胞被瞬时转染含有HA wt和HA s序列的表达载体，代谢标记为35S-甲硫氨酸和溶解的细胞颗粒和培养基上清液在1小时脉冲或3小时追逐期后用H-18mAb进行免疫沉淀(图1C). 脉冲后，HA wt和HA s肽均从细胞颗粒组分中免疫沉淀，而不是从上清液中。随后在追逐期后的上清液中检测到HA（但不是HA wt）肽，证实它是分泌的。

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Pro-HA表达结构

答：Pro-HA转基因，具有上述分泌HA（HAs）蛋白的结构。HA wt蛋白的图谱显示了ER信号序列（SS，氨基酸2-17）的位置，I-Ed日表位（氨基酸110–120，位于细胞外区域[ED]内），Kd日表位（542–550位氨基酸，位于跨膜结构域[TM，539–564]位氨基酸）和细胞质结构域（CD）。HA蛋白的结构由一条粗黑线表示，该黑线表示保留的野生型蛋白部分。

B类：HA wt和HA s蛋白的亚细胞定位。感染所示重组痘苗的P815细胞（或未感染作为背景染色对照[C]）的FACS直方图，直接（表面）或膜固定和渗透后（细胞内）进行HA染色。

抄送：HA wt和HAs蛋白的免疫沉淀。用编码HA wt或HA s结构体或空表达质粒（C）的表达质粒瞬时转染COS-7细胞。48小时后，他们被贴上了[35S] 蛋氨酸1小时（脉冲），然后用过量的冷蛋氨酸培养3小时（chase）。脉冲期和追逐期结束后，收集细胞颗粒（P）和培养基上清液（S），使用抗HA单克隆抗体H-18进行免疫沉淀。样品通过SDS-PAGE进行分析，分子量标准物的位置显示在左侧，HA蛋白的位置用每个放射自显影图右侧的箭头标记。显示了追踪放射自显影的短时间曝光（S）和长时间曝光（L）。

将Pro-HA表达盒显微注射到受精的B10.D2胚胎中，建立了创始系9972并用于后续研究。Southern分析表明整合了单个完整的转基因拷贝（数据未显示），定量RT-PCR分析显示前列腺特异性HA表达(图2A). 采用两种方法评估Pro-HA转基因前列腺是否表达HA蛋白。首先，将Pro-HA前列腺匀浆注射到非转基因（NT）受者的脚垫中，这些受者也接受了6.5克隆型CD4细胞的过继移植。如果匀浆中含有HA蛋白，I-Ed日-限制性HA表位应该由引流腘窝淋巴结中的APC呈递，并且克隆型CD4细胞应该失去其原始表型(Adler等人，1998年). 注射Pro-HA前列腺匀浆五天后，与对照组相比，恢复的克隆型CD4细胞的活化标记CD44表达水平增加。Pro-HA匀浆诱导的CD44表达量与C3-HA转基因前列腺匀浆大致相当(图2B)在包括前列腺在内的多个组织中表达HA(Adler等人，1998年). 为了进一步评估Pro-HA小鼠是否表达足够水平的前列腺HA，以被原位HA特异性T细胞、Pro-HA和NT（对照）Thy1.2识别+接受者收到了天真的Thy1.1的收养转让+HA特异性克隆型CD8 T细胞，同时接种表达HA的重组痘苗病毒（vacc-HA），以启动克隆型CD8T细胞。两周后，用抗Thy1.1抗体对前列腺背叶冰冻切片进行染色，以标记克隆型CD8细胞(图2C). 在Pro-HA前列腺中，但在NT前列腺中，启动的克隆型CD8细胞浸润前列腺导管，与上皮细胞共定位的染色证明了这一点（推测的转基因表达位置[Greenberg等人，1994年,1995]).

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Pro-HA转基因小鼠表达前列腺限制性血凝素

答：使用HA特异性引物和探针对Pro-HA小鼠的指示组织进行定量RT-PCR。相对表达标准化为C3-HA前列腺（100），作为HA表达的阳性对照(Adler等人，1998年,2000). 反应一式三份，重复两次。

B类：Pro-HA小鼠表达前列腺HA蛋白。将所示小鼠的前列腺匀浆注射到前一天接受过6.5克隆型CD4细胞过继移植的NT受体的脚垫中。五天后，用流式细胞仪分析从排出的腘窝淋巴结制备的单细胞悬浮液。门控克隆型CD4细胞上CD44表达的直方图显示了虚线参考线左侧的平均荧光（MF）值。显示的数据代表了几个重复。

抄送：启动的克隆型CD8细胞渗入Pro-HA前列腺。表达Thy1.2同源标记的Pro-HA（右面板）和NT（左面板）小鼠接受了Thy1.1的过继转移+原始克隆4克隆型CD8细胞，同时接种vacc-HA，以激发克隆型CD八细胞。两周后，前列腺背叶冰冻切片用抗Thy1.1单克隆抗体（红色染色）染色，并用苏木精复染。显示的部分代表了几只老鼠。

医生：在Pro-HA转基因小鼠中不会发生克隆型CD4细胞胸腺缺失。分析6.5 TCR单转基因、6.5×C3-HA和6.5×Pro-HA双转基因小鼠CD4单阳性胸腺细胞和成熟脾CD4细胞的克隆型TCR（即6.5）表达。虚线参考线表示背景6.5染色（由NT控件确定）。直方图代表多只小鼠。

Pro-HA小鼠的同源原始CD4细胞忽略了前列腺HA

在“组织特异性”启动子控制下的一些转基因可以在胸腺中低水平表达(Jolicoeur等人，1994年). 事实上，许多“外周”蛋白在胸腺中以低水平表达，这表明胸腺可能产生对某些外周抗原的耐受性(Jolicoeur等人，1994年;Derbinski等人，2001年;Anderson等人，2002年). 为了确定Pro-HA转基因是否诱导HA特异性T细胞的胸腺缺失，我们构建了表达6.5 TCR和Pro-HA基因的双转基因小鼠(图2D). 单转基因6.5小鼠在其大部分CD4单阳性胸腺细胞以及成熟的脾CD4细胞上表达高水平的克隆型TCR。当6.5只小鼠与C3-HA转基因小鼠杂交时，C3-HA在许多组织（包括胸腺）中表达HA[Adler等人，1998年])，频率为6.5+胸腺和脾脏中的CD4细胞均显著减少。相反，6.5×Pro-HA双转基因小鼠中克隆型CD4细胞的胸腺缺失没有发生（与胸腺转基因mRNA表达的缺乏一致[图2A]). 鉴于6.5克隆型TCR与I-E的亲和力相对较高d日-HA肽复合物，对胸腺HA的存在敏感(Jordan等人，2001年)这一结果表明，正常的HA特异性T细胞储备是从Pro-HA转基因小鼠的胸腺中输出的。有趣的是，鉴于在TRAMP转基因小鼠中驱动SV40 T抗原表达的Probasin启动子在胸腺中表达并导致T抗原特异性T细胞的胸腺缺失，Pro-HA小鼠中没有出现HA特异性T淋巴细胞的胸腺删除(Zheng等人，2002年). 由于内源性鼠Probabasin基因在胸腺中也以低水平表达(Zheng等人，2002年)Pro-HA小鼠缺乏缺失可能是由于Pro-HA转基因的偶然整合位点限制了胸腺mRNA表达所致。

为了评估成熟的原始CD4细胞是否识别Pro-HA小鼠外周的前列腺HA，我们使用CFSE标记的HA特异性克隆型CD4 T细胞进行过继转移实验(图3A和3B). 作为抗原识别的阳性对照，我们使用了C3-HA受体，其中克隆型CD4细胞在达到耐受状态之前经历了强烈的增殖反应，以及NT受体感染了vacc-HA，其中克隆性CD4细胞增殖并发展Th1效应器功能(Adler等人，2000年;Higgins等人，2002b). 移植后6天，从Pro-HA受体的前列腺引流主动脉周围淋巴结中恢复的克隆型CD4细胞没有经历显著分裂（即CFSE稀释），也没有在前列腺非引流淋巴器官中分裂，如脾脏、腋窝和肠系膜淋巴结（数据未显示）。因此，前列腺HA的表达(图2B和2C)两者都不诱导胸腺缺失(图2D)也不能被成熟CD4细胞识别(图3A和3B).

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前列腺肿瘤发生改变前列腺上皮抗原的表达

年龄匹配（6个月大）Thy1.2+NT、C3-HA、Pro-HA、TRAMP、Pro-HAx TRAMP和vacc-HA感染的NT（vacc-HA）受体接受了Thy1.1的过继转移+CFSE标记的原始克隆型CD4细胞，6天后从前列腺引流的主动脉旁淋巴结中恢复。

答：克隆型CD4细胞的典型增殖反应（即CFSE溶解）。克隆型CD4细胞百分比（Thy1.1+和6.5+)虚线参考线左侧显示稀释CFSE荧光。

B类：散点图显示肿瘤发生对克隆型CD4细胞增殖的影响。显示了单个小鼠CFSE稀释克隆型CD4细胞的百分比，水平线表示中值。p值采用非配对双尾t检验计算。

抄送：IFN-γ染色的代表性直方图，细胞因子阳性克隆型CD4细胞的百分比，以及这些阳性细胞上的细胞因子表达水平（以平均荧光[MF]表示）分别显示在参考条上方和下方。

前列腺肿瘤发生导致前列腺引流LN对前列腺HA的耐受性识别增加

前列腺透明质酸可能被同源的原始CD4细胞忽略，因为在正常情况下，分泌的透明质酸不直接流向血流或引流淋巴管(惠特摩尔和吉茨，1977年)因此对耐受性APC不可用(Adler等人，1998年;Higgins等人，2002b). 因此，我们分析了肿瘤发生过程中HA特异性T细胞反应，前列腺结构改变和/或转移可能使HA获得引流LN。将Pro-HA小鼠与TRAMP转基因小鼠杂交，这些转基因小鼠在最小的大鼠Probasin启动子的控制下，通过SV40 T抗原的表达，发展为自发性前列腺肿瘤(Greenberg等人，1995年). 在这些双转基因小鼠中，HA和T抗原应在转化过程中共存，因为它们都受同一启动子的控制。与Pro-HA和TRAMP单转基因受体（过继转移CFSE标记的原始克隆型CD4细胞）保持不分离相比，Pro-HA×TRAMP双转基因受体中这些细胞的很大一部分进行了分裂。虽然Pro-HA×TRAMP受体的增殖程度低于C3-HA和vacc-HA感染NT对照受体组，但显著高于Pro-HA或TRAMP单转基因受体(图3A和3B). 这种增加的抗原识别似乎是耐受性的；确实分裂的克隆型CD4细胞只经历了有限数量的分裂，并且与早期分裂相比，后期的细胞频率没有增加，这表明分裂的细胞容易缺失。

为了进一步评估从Pro-HA×TRAMP双转基因受者前列腺引流LNs中回收的分离克隆型CD4细胞的功能能力，我们在用HA肽脉冲APCs体外再刺激后进行了细胞内IFN-γ染色(图3C). 与我们之前的观察结果一致(希金斯等人，2002a,2002年b)在体外再刺激后，接种vacc-HA的NT受体中启动的克隆型CD4细胞表达高水平的IFN-γ，而C3-HA受体中耐受的克隆型细胞没有表达。从Pro-HA×TRAMP受体中回收的分离克隆型CD4细胞的细胞内IFN-γ表达可忽略不计，这与非免疫原性反应一致。此外，这些细胞不表达IL-4或IL-10，这与Th2或调节反应相反（数据未显示）。

雄激素消融可暂时提高对前列腺限制性抗原的免疫识别

去势（即雄激素消融）诱导前列腺上皮细胞凋亡性变性(Sugimura等人，1986年;Furuya等人，1995年). 凋亡细胞可以被吞噬细胞APC清除，这一过程被假设为耐受性APC获得薄壁自身抗原的机制(斯坦曼等人，2000年;刘等人，2002). 为了评估雄激素阻断诱导的前列腺上皮变性是否影响引流LN中抗原识别的数量或质量，在接受CFSE标记的原始克隆型CD4细胞之前，对单个转基因Pro-HA受体进行去势。与完整的单个转基因Pro-HA受体相比，过继移植前1天的去势增加了克隆型CD4细胞的增殖量，但程度低于肿瘤发生(图4A和4B)体外再刺激后，这些分裂细胞表达的IFN-γ水平可以忽略不计(图4C). 当在阉割后3或10天进行过继移植时，产生的CFSE溶解情况接近完整Pro-HA受体，表明雄激素消融只能暂时增加抗原识别（可能是由于HA表达的前列腺上皮细胞丢失或雄激素介导的HA表达降低所致）。类似地，当Pro-HA×TRAMP双转基因受体在过继移植前1天去势时，CD4细胞增殖与完整受体相比略有增强；然而，在过继移植前10天进行去势时，CD4细胞增殖反应明显减弱(图4A和4B). 去势并没有完全消除ProHA×TRAMP小鼠的抗原识别，即使在雄激素消融10天后，ProHA×TRAMP小鼠的CD4 T细胞增殖也明显高于NT对照组(图4B). 评估雄激素消融引起的T细胞反应改变是否是由于雄激素对T细胞功能的直接免疫抑制作用被消除所致(Roden等人，2004年;Viselli等人，1995年)，我们将克隆型CD4细胞过继性转移到完整或去势的NT和C3-HA小鼠，或感染vacc-HA的完整或去雄的NT小鼠。如所示图4D在所有三个受体组中，去势动物和完整动物的HA特异性T细胞分裂几乎相同，这表明雄激素消融对前列腺T细胞识别的影响(图4A–4C)是由抗原识别的数量和/或质量的变化介导的，而不是雄激素对T细胞功能的直接影响。

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雄激素消融短暂增加前列腺上皮抗原的表达

在指定时间点去势的Pro-HA和Pro-HA×TRAMP小鼠接受Thy1.1的过继移植+CFSE标记的原始克隆型CD4细胞，6天后从前列腺引流的主动脉旁淋巴结中恢复。

答：克隆型CD4细胞的典型增殖反应（即CFSE稀释液）。

B类：显示雄激素消融对克隆型CD4细胞增殖影响的散点图如图3B.

抄送：干扰素-γ染色的代表性直方图，细胞因子阳性克隆型CD4细胞的百分比，以及这些阳性细胞上的细胞因子表达水平（表示为平均荧光[MF]），分别显示在参考线上方和下方。

医生：比较从完整和去势NT、vacc-HA感染NT（vacc-HA-感染NT）和C3-HA受体中恢复的克隆型CD4细胞CFSE稀释度。

雄激素消融减轻对前列腺/前列腺肿瘤限制性抗原的系统耐受性

这些结果表明，前列腺癌患者的雄激素消融最终会将耐受诱导环境转变为中性环境。因此，我们质疑这种转化是否会逆转系统水平的耐受过程，从而使HA特异性T细胞在接种后扩增。在允许过继转移的克隆型CD4细胞在不同受体组中停留更长时间（2周）后，我们评估了它们是否可以在vacc-HA激发后在前列腺非引流LN中进行克隆扩增(图5A). 如果NT收件人为1×105原始克隆型CD4细胞受到vacc-HA的攻击，6天后克隆型CD四细胞的频率扩大到约占总淋巴细胞总数的1%（在NT小鼠以及所有其他未接种疫苗的对照组中，如果没有vacc-HA的攻击，该频率低于0.1%[数据未显示]）。作为系统耐受性（即免疫反应性受损）的阳性对照，在C3-HA受体中放置2周的原始克隆型CD4细胞在vacc-HA激发后表现出极大的扩张能力受损。在Pro-HA单转基因受体中，vacc-HA诱导克隆型CD4细胞扩增至略低于NT对照组的水平（尽管没有统计差异），这与Pro-HA单一转基因小鼠中偶尔观察到的HA识别的最低水平一致(图3B). 这些数据进一步证实，在没有肿瘤发生的情况下，前列腺HA大多被忽视。相反，在Pro-HA×TRAMP双转基因中，vacc-HA诱导的克隆型CD4细胞扩增显著减少。由于克隆型CD4细胞的扩增在TRAMP单转基因中没有受损，这些数据表明肿瘤发生促进了HA的系统耐受性，而不是诱导抗原非特异性免疫抑制。去势并没有改变NT或Pro-HA单转基因受体中克隆型CD4细胞的扩增，但能够显著减轻肿瘤发生的耐受性影响(图5A)最有可能是由于接种vacc-HA前2周内耐受性抗原呈现减少(图4B). 细胞内染色显示，来自去势Pro-HA×TRAMP小鼠的克隆型T细胞在vacc-HA攻击后扩增，产生IFN-γ，以响应与对照受体水平相当的体外再刺激，表明去势确实减轻了耐受性(图5B). 在上述实验中，在雄激素消融24小时后过继转移T细胞。在临床疫苗接种环境中，前列腺特异性T细胞很可能在化学去势或手术去势之前处于循环中。为了模拟这种情况，我们在雄激素消融前1周将克隆型CD4细胞移植到12至14周龄的ProHA×TRAMP或NT小鼠。再过一周，通过上述vacc-HA激发评估HA的系统免疫应答。虽然雄激素消融不会显著改变这些动物前列腺特异性T细胞的频率（数据未显示），但它们产生IFN-γ的能力恢复到NT对照动物的水平(图5C). 有趣的是，在18至22周龄患有更严重疾病的动物中，这种耐受性的缓解并不明显（数据未显示）。综上所述，这些数据表明前列腺肿瘤的发生损害了对前列腺特异性疫苗接种的系统性T细胞反应（即促进耐受性），而雄激素消融减轻了这种影响。

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肿瘤发生可诱导前列腺上皮抗原的系统耐受性，而去势可减轻这种影响

答：年龄匹配的（6个月大）NT（n=10），第−1天阉割的NT（n=6），C3-HA（n=10），Pro-HA（n=10），第−1天阉割的Pro-HA（n=10），TRAMP（n=9），Pro-HA×TRAMP（n=12），第−1天阉割的Pro-HA×TRAMP（n=6）Thy12+接受者接受了1×10的收养转移5未标记的Thy1.1+原始克隆型CD4细胞，2周后用1×106vacc-HA的pfu。对照NT小鼠接受T细胞，但不接受vacc-HA（n=7）。六天后，克隆型CD4细胞（识别为CD4）的频率+和Thy1.1+)在前列腺非引流腋窝淋巴结中进行了测量。星号表示组与NT对照组有显著差异（p<0.05，非配对双尾t检验）。

B类：细胞内IFN-γ染色的代表性直方图，显示细胞因子阳性克隆型CD4细胞的百分比。

抄送：12至14周龄NT或ProHA×TRAMP小鼠用1×10过继转移7去势前1周检测克隆型CD4细胞。再过一周，用vacc-HA攻击动物，5天后收获。显示了不相关（全身）淋巴结的克隆型CD4细胞胞内IFN-γ染色的代表性直方图。

讨论

外周血T细胞耐受可通过多种机制介导。而容忍化的积极形式，如删除(Jones等人，1990年)或功能失活（即无能）(Mueller等人，1989年)通常可以观察到，耐受性也可以被动地表现出来，即，原始T细胞可能只是忽略了其同源外周自我抗原的存在(Ohashi等人，1991年;Oldstone等人，1991年). 在某些情况下，无知可能是由于自我抗原表达水平低所致(Kurts等人，1998年). 在我们的Pro-HA系统中，最有可能发生无知，因为HA与引流淋巴管隔离(惠特摩尔和吉茨，1977年)因此，耐受性APC(Adler等人，1998年;希金斯等人，2002a,2002年b). 因此，前列腺肿瘤的发生和阉割都会改变前列腺的结构，从而显著提高同源T细胞对引流LN中明确的HA表位的识别水平。肿瘤发生还可能通过转移的表达HA的肿瘤细胞或通过增加HA的总表达量，将HA直接传递到排出的LN，从而增加T细胞对HA的识别。尽管如此，隔离功能受损可能起着关键作用，因为前列腺引流淋巴结中HA的识别量与原发性前列腺肿瘤的大小或引流淋巴结肿大没有直接关系，而引流淋巴结增大可能预示着转移性肿瘤（数据未显示）。

与前列腺肿瘤发生相关的同源T细胞对前列腺上皮抗原识别增加的功能后果似乎是耐受性；同源的原始CD4细胞经历了一个失败的增殖反应，并且无法发展效应功能（即表达Th1或Th2细胞因子的能力）。尽管耐受性表现似乎仅限于前列腺引流LN，但随着时间的推移，同源CD4细胞在接种疫苗后进行克隆扩增的能力下降，这表明这种表现会导致全身耐受。这可能发生在所有同源CD4细胞都通过前列腺引流LN循环后，正如之前所述，当自我抗原表达仅限于胰腺时(Morgan等人，1999年). 在另一个转基因系统中，胰岛素瘤的发展也增强了肿瘤相关抗原的交叉呈现，但有趣的是，结果不是耐受性(Nguyen等人，2002年). 可移植肿瘤的免疫学特性也存在差异；在某些情况下，这些肿瘤是耐受性的(Staveley-O’Carroll等人，1998年;博根，1996年;Shrikant等人，1999年)以及其他免疫原性(Ochsenbein等人，2001年;Hanson等人，2000年;Spiotto等人，2002年). 这些数据强调了一个观点，即不同类型的肿瘤可能具有不同的免疫学特性。前列腺肿瘤的耐受性可能部分取决于其产生免疫抑制细胞因子TGF-β的能力(兵营，1997年).

前列腺肿瘤发生促进肿瘤相关抗原耐受性的观察对设计治疗前列腺癌的免疫治疗策略具有指导意义。考虑到在肿瘤发生之前似乎不会出现耐受性，以原发肿瘤上也表达的抗原为靶点的疫苗在预防性给药或疾病进展早期可能有效。对于其他类型的肿瘤，靶向肿瘤相关抗原可能会在肿瘤发生之前促进耐受，但这种情况并不一定发生(Morgan等人，1998年;胡等，1993). 在前列腺癌进展的后期，当耐受性变得更加明显时，疫苗的疗效可能会下降。与这种可能性相一致，疫苗阻止TRAMP小鼠疾病进展的能力随着年龄的增长而下降(Hurwitz等人，2000年)尽管存在耐受性以外的因素（例如，建立免疫抑制肿瘤微环境[Radoja等人，2001年])也可能导致这种现象。

因为雄激素阻断是前列腺癌的标准治疗方法(Denmeade和Isaacs，2002年)了解其对耐受性的影响对于设计雄激素阻断与疫苗相结合的治疗策略非常重要。最近的一项研究表明，接受雄激素消融术的前列腺癌患者出现前列腺T细胞浸润，似乎表现出Th1效应表型，这表明雄激素消融诱导T细胞启动前列腺抗原(Mercader等人，2001年). 我们发现，在没有肿瘤发生的情况下，雄激素消融似乎可以诱导前列腺特异性原始CD4细胞进行耐受性分化。这些CD4细胞表现出CFSE溶解特征，表明存在流产的增殖反应，也无法发挥表达效应细胞因子的潜力。这一结果与非感染条件下细胞死亡促进耐受性的研究一致(Hugues等人，2002年;刘等人，2002;Ferguson等人，2002年)以及阉割增强前列腺免疫抑制细胞因子TGF-β表达的观察(基普里亚诺和艾萨克斯，1989年). 尽管如此，雄激素阻断不会导致系统性T细胞耐受，这显然是因为表达HA的前列腺上皮细胞的同步凋亡导致引流LNs中的短暂HA呈现，而这在持续时间上不足以使所有同源CD4细胞遇到HA。

在Pro-HA×TRAMP双转基因小鼠中，雄激素消融诱导的前列腺上皮细胞和肿瘤细胞凋亡似乎也会导致HA识别水平的短暂但不显著的增加。随着时间的推移，同源T细胞对HA的识别率降低，但即使在去势10天后，去势Pro-HA×TRAMP小鼠的T细胞识别率也显著高于非转基因对照组。有趣的是，在这个时间点前后，ProHA×TRAMP肿瘤的系统耐受性显著降低。这些数据表明，系统耐受性的减弱可能不是通过完全消除耐受性抗原介导的，而是通过降低到维持无应答所需的阈值以下，或者可能通过影响抗原识别上下文的其他机制介导的(拉姆斯代尔和福克斯，1992年;Pape等人，1998年).

我们的数据表明，前列腺癌免疫治疗的一种方法可能是采用免疫治疗策略(Yee等人，1997年)其中，在雄激素消融后给予肿瘤反应性效应T细胞。在这种情况下，阉割介导的抗原负荷减少(图4B)可能被证明特别有利，因为效应T细胞对抗原介导的耐受性高度敏感(希金斯等人，2002a;Long等人，2003年;Mihalyo等人，2004年). 对于疫苗方法，我们的数据表明雄激素消融后接种疫苗可能会增强疗效(图5C). 值得注意的是，靶向疫苗方法依赖于肿瘤细胞对靶抗原的充分表达。虽然雄激素消融术后靶抗原表达降低是一个主要问题，但应该注意的是，大多数接受雄激素消融的前列腺癌患者最终复发，PSA升高，PSA是一种典型的雄激素调节转录物(Gretzer和Partin，2003年;普林斯，2000). 在TRAMP小鼠中，也出现了类似的现象：去势动物中进展的肿瘤表达SV40大T抗原，该抗原受雄激素调节的先证素启动子控制(Eng等人，1999年)，并且在Pro-HA×TRAMP小鼠中，去势似乎减少但不消除HA的表达。去势患者和TRAMP小鼠中这些雄激素调节基因的表达很可能部分是由于雄激素受体的表达或活性改变，从而在缺乏正常雄激素水平的情况下激活(塔普林和巴尔克，2004年;Chen等人，2004年;Edwards等人，2003年;Hakimi等人，1996年;赵等，2000). 因此，进展中的肿瘤很可能会继续表达靶抗原，使其可能容易被免疫根除。Pro-HA×TRAMP小鼠的初步数据支持顺序雄激素清除→接种治疗策略（数据未显示）。然而，有必要进行广泛的分析，优化疫苗配方和与雄激素消融相关的给药时机，以最大限度地提高这种联合疗法的临床效益。

实验程序

老鼠

所有小鼠均服用B10.D2（H-2d日)背景。已描述在大鼠C3（1）启动子控制下表达流感HA的C3-HA转基因小鼠（创始系142）(Adler等人，1998年,2000). 6.5 (Kirberg等人，1994年)和克隆4(Morgan等人，1996年)TCR转基因小鼠表达能够识别I-E的克隆型TCRd日-限制性HA表位(110SFERFEIFPKE公司120)或Kd日-限制性HA表位(542IYSTVASSL公司550)和均回交至Thy1.1同源B10.D2背景。TRAMP转基因小鼠(Greenberg等人，1995年)在C57BL/6J背景上回交到B10.D2背景。如前所述进行去势(Eng等人，1999年).

Pro-HA表达盒是通过首先PCR扩增最小的Probasin启动子片段（−426 bp至+28 bp）构建的(Rennie等人，1993年)使用校正酶Pfu聚合酶（Stratagene，La Jolla，CA）和引物5′-ATCCTGAGCTCAAG CTTCCAAAGTGCATTAGC-3′和5′-GAGGATGACCCTCCG-3′从大鼠基因组DNA中提取。纯化产物用SacI消化并连接到pGem3的SacI位点（威斯康星州麦迪逊市普罗米加）。源自流感病毒A/PR/8/34（西奈山株）野生型HA序列的HA基因分泌型(Townsend等人，1984年)利用Pfu聚合酶和引物5′-TTTTCAAGATCTGAGGAAAAAAAAAACACC-3′和5′-AGACCGGATCTACAGTGACTGG CGACAGTTG-3′进行基于PCR的诱变构建，引物引入氨基酸550后的终止密码子。使用StuI和BamHI位点在Probasin启动子下游连接1.6 kb修饰的HA片段。最后，从质粒3xHRE-3中PCR扩增出含有SV40小T抗原3′-非翻译区的1kb片段(Adler等人，1991年)使用Pfu聚合酶和引物5′-CGGGATCACATGTCGCAGAATGC-3′和5′-GAAGATCTGACACTATACATACAAGC-3′，并使用BamHI和BglII位点连接HA下游。整个3.1kb Pro-HA表达盒在用HindIII消化后进行凝胶分离，并微量注射到受精的B10.D2胚胎中（在贝勒医学院转基因核心设施进行）。利用引物5′-GAATGAATAGTCAT CATG-3′和5′-GGTTCCCAAGAGCCATC-3′对从尾部活检中提取的DNA进行PCR分析，鉴定转基因后代。

瞬时转染和免疫沉淀分析

COS-7电池（1×105如前所述，在病毒CMV启动子的控制下，使用DEAE-右旋糖酐方法，在含10%FCS的DME培养基中，提前1天将含有所示HA序列的5μg哺乳动物表达质粒（即pcDNA3）瞬时转染到6孔板中(Adler等人，1993年). 转染48小时后，给细胞接种含有不含蛋氨酸的二甲醚、10%透析的FCS和100μCi的培养基[35S] 蛋氨酸。1小时后，将一组细胞收集到0.5 ml RIPA缓冲液中（40 mM Tris[pH8.0]，1%脱氧胆酸，150 mM NaCl，1%NP40，2 mM EDTA，0.1%SDS，1 mM NaVO4，120μM PMSF，5 ug/ml抑肽酶，1μg/ml胃蛋白酶抑制素和10μg/ml亮氨酸肽）（即脉冲），同时清洗第二组，给含有过量冷蛋氨酸的培养基，并在收获到RIPA缓冲区（即chase）之前再培养3小时。在脉冲和追逐周期结束时也采集了介质样品，并与RIPA缓冲液1:1混合。随后，在4°C的微型离心机中以最高速度旋转细胞裂解物，并在4°C.用50μl蛋白a sepharose（加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物科技公司）预处理上清液10分钟。然后将清除的上清液与抗HA单抗H-18在4°C下孵育2小时，用50μl蛋白A Sepharose免疫沉淀，用含SDS的凝胶负载缓冲液提取，并在含有7.5%丙烯酰胺的SDS-PAGE凝胶上运行。将干燥的凝胶暴露在胶片上进行放射自显影。

重组痘苗病毒

先前制定的协议(厄尔和莫斯，1993年)在HuTK中使用合适的pSC11MCS1载体（其中修改的HA序列置于早期/晚期p7.5启动子的控制下）将HA序列重组到野生型痘苗病毒的TK基因中−细胞。表达野生型HA序列的重组痘苗先前已有描述(Staveley-O’Carroll等人，1998年). 重组痘苗病毒在HuTK-cells中扩增，纯化超过36%蔗糖，并使用HuTK进行滴度−细胞。

痘苗感染细胞的FACS染色

P815细胞在体外感染所示重组痘苗病毒，感染倍数（MOI）为每个细胞5个斑块形成单位（pfu）。16小时后，将样品分离，直接用HA特异性单克隆抗体H-18染色，然后用PE结合的山羊抗鼠Ig二次染色（用于表面HA染色），或在37°下固定在含4%甲醛的PBS中5分钟，然后在FACS缓冲液中渗透（含2%小牛血清和0.1%叠氮化物的PBS）添加0.25%皂苷，然后用H-18和PE结合的山羊抗鼠Ig染色（用于细胞内HA染色）。

定量RT-PCR

使用RNeasy试剂盒（Qiagen，Chatsworth，CA）和DNA酶处理从指定组织中提取RNA。使用SuperScript II系统（Life Technologies，Rockville，MD）转录cDNA，并在ABI 7700仪器（PE Applied Biosystems，Foster City，CA）中的一式三孔中进行PCR反应。在每个反应井中，同时运行18S rRNA特异性引物和VIC标记探针（Applied Biosystems）以使输入cDNA正常化。以C3-HA前列腺的RNA为标准（设为100），使用δ-δCT方法计算HA的相对表达（18）。HA特异性引物为5′-CGCCGGATGCTTG-3′（正向）和5′-ACAATGTAGGACCATGCTCATG-3′（反向）。HA特异性探针为5′-FAM-AAACCAGAATGCGACCCACTGCTT-TAMRA-3′。在没有模板的情况下未检测到扩增。

过继转移和流式细胞术

Thy1.1的收养转让+幼稚克隆型TCR转基因T细胞转化为雄性Thy1.2+CFSE标记的Thy1.1受体和细胞内细胞因子染色+如前所述，在用HA肽进行体外再刺激后，进行克隆型CD4细胞(希金斯等人，2002a,2002年b;Long等人，2003年)，除了用2×10进行再刺激6每孔200μl CTL培养基中的LN细胞位于v型底部96-well板中。

前列腺HA表达生物测定

使用Omni-TH手持式均质器（Omni International，Warrenton，VA）在500μl PBS中均质整个前列腺，并将100μl的均质物（含约60μg蛋白质）注射到1天前接受过6.5克隆型CD4细胞过继移植的NT小鼠的足垫中。五天后，用流式细胞术分析从排出的腘窝淋巴结制备的单细胞悬液，以确定CD44在克隆型CD4细胞上的表达，如前所述(Adler等人，1998年,2000;Higgins等人，2002b).

前列腺浸润克隆型CD8细胞的组织学分析

Thy1.1过继转让后两周+克隆4克隆型CD8细胞和接种vacc-HA（1×107腹腔注射pfu），从指定的Thy1.2中取出前列腺背叶+受体，嵌入Tissue-Tek OCT冷冻复合物（加州托伦斯Sakura Kinetek）中，冷冻于液态N中2。使用低温恒温器切割四个微米切片，放置在聚赖氨酸涂层载玻片上，空气干燥1小时，在4°C的丙酮中固定5分钟，并在室温下风干10分钟。所有后续步骤在室温下执行。干燥切片在PBS中浸泡10分钟，与Peroxo-Block（加利福尼亚州南旧金山的Zymed）孵育45秒，用PBS清洗3倍，依次用亲和素和生物素块（加利福尼亚州伯林盖姆Vector Laboratories，Burlingame，CA）培养15分钟，中间用清洗液（3倍PBS），在结合缓冲液（PBS+5%FCS）中封闭10分钟，用生物素结合抗胸腺1.1（加利福尼亚州圣地亚哥BD Pharmingen）培养（0.5μg/ml在结合缓冲溶液中）用链霉亲和素过氧化物酶（streptavidin peroxidase）和AEC（产生红色斑点）培养30分钟，标记启动的克隆型CD8细胞，然后在安装前用苏木精进行复染（根据制造商说明使用Histomouse-SP试剂盒[Zymed]）。

重要性

2004年，大约30000名男性将死于转移性前列腺癌。虽然雄激素消融有很高的初始反应率，但大多数进展性疾病患者最终死于癌症。为了评估前列腺/前列腺癌特异性免疫反应，我们开发了一种转基因小鼠模型，该模型只在前列腺和自发性前列腺肿瘤中表达特征明确的抗原。使用这种转基因模型，我们表明前列腺癌的免疫治疗可能受到前列腺特异性T细胞快速形成耐受性的倾向的限制。出乎意料的是，我们发现雄激素消融在系统水平上减轻了T细胞耐受性，这表明前列腺癌的免疫治疗在与这种常见干预联合应用时可能会得到增强。

致谢

我们感谢Linda Sherman博士提供克隆4小鼠，以及Norman Greenberg博士和Franco DeMayo博士在生成Pro-HA小鼠方面的帮助。这项工作得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health Grants）CA109339和AI49813以及美国癌症协会（American Cancer Society）研究学者拨款RSG-02-235-01-LIB（发给A.J.A.）、美国国家癌症研究所前列腺SPORE拨款（CA-58236，发给D.M.P和C.G.D.）以及NCI拨款CA096948（发给C.G.D）的支持。C.G.D.是Damon Runyon-Lilly临床研究人员，也是马里兰州卷烟恢复基金（Maryland Cigarette Restitution Fund）教师招募拨款的受益者。

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