Sirt1激活保护小鼠肾髓质免受氧化损伤

Sirt1保护培养的肾髓质间质细胞免受氧化应激。

为了确定髓质内的氧化应激水平，我们对小鼠肾脏进行了氧化应激标记物的免疫组织化学研究。肾髓质中亚硝基酪氨酸和4-羟基壬醛的水平高于肾皮质，主要在肾髓质间质中表达（图​（图2）。2). 髓内间质似乎具有最高水平的两种氧化应激标记物（图​（图2）。2).

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图2

小鼠肾脏中的氧化应激标记物。

使用氧化应激标记物抗亚硝基酪氨酸抗体（左面板）和抗4-羟基壬醛抗体（右面板）的免疫组织化学。底部的面板显示肾内髓质的高倍图像。

由于Sirt1在肾髓质间质细胞中大量表达，并且在肾髓质间质中存在高水平的氧化应激标志物，我们使用原代培养的小鼠肾髓质间质细胞（RMIC）测试了Sirt1在促进细胞对氧化应激的抵抗中的作用。使用携带Sirt1选择性shRNA的慢病毒实现了Sirt1的下调。Sirt1 shRNA将内源性Sirt1蛋白表达降低了85%（图​（图3A，三A、，P（P）< 0.0001). RT-PCR也显示Sirt1 shRNA减少Sirt1（信号1）mRNA表达，而Sirt2号机组和警报器3mRNA表达保持不变（图​（图3B）。三B） ●●●●。RMIC暴露于氧化应激（250μM H₂O（运行）₂，12小时）显著降低细胞存活率，而Sirt1的敲除（图​（图3C，三C、 22%±4%对51%±5%，P（P）< 0.0001). TUNEL阳性细胞凋亡在H₂O（运行）₂治疗（500μM，6小时），并通过击倒Sirt1而进一步增加（图​（图3E，三E、，P（P）< 0.05). H（H）₂O（运行）₂通过切割caspase-3表达的免疫印迹也证实了Sirt1的敲除进一步增加的治疗诱导的凋亡（图​（图3G，三G、 P<0.001）。

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图3

Sirt1保护培养的RMIC免受氧化应激。

(A类和B类)用携带Sirt1选择性shRNA或对照病毒的慢病毒感染原代小鼠RMIC。免疫印迹法检测Sirt1、Sirt2和Sirt3的表达(A类、密度测定法，n个= 4, *P（P）<0.0001）和RT-PCR(B类). (C和D类)对照或Sirt1 shRNA处理的RMIC用或不用Sirt1激活剂白藜芦醇（5μM）预处理，并用H攻击₂O（运行）₂（250μM）培养12小时。用结晶紫染色法检测细胞活力(n个= 6, *P（P）<0.0001与对照病毒处理的H细胞相比₂O（运行）₂;^†P（P）<0.001与对照病毒处理的H细胞相比₂O（运行）₂不含白藜芦醇）。(E类和F类)对照组或Sirt1 shRNA处理的RMIC用或不用Sirt1激活物SRT2183（5μM）进行预处理，并用H₂O（运行）₂（500μM）持续6小时。TUNEL法检测细胞凋亡(n个= 15; *P（P）与对照病毒相比<0.05——用H处理的细胞₂O（运行）₂;^†P（P）<0.001与H细胞相比₂O（运行）₂无SRT2183）。(G公司和H（H）)对照组或Sirt1 shRNA处理的RMIC用或不用Sirt1激活物SRT2183（5μM）进行预处理，并用H₂O（运行）₂（500μM）持续6小时。用免疫印迹法检测细胞凋亡标志物裂解caspase-3的表达(n个=4，密度测定*P（P）<0.001与对照病毒处理的H细胞相比₂O（运行）₂;^†P（P）<0.05，与H细胞相比₂O（运行）₂无SRT2183）。

接下来我们研究了Sirt1激活剂白藜芦醇是否增强了RMIC对氧化应激的抵抗力。白藜芦醇（5μM）显著增强RMIC耐受氧化应激的能力（500μM H₂O（运行）₂，12小时）（图​（图3D，三D、 54%±8%对35%±3%，P（P）< 0.001). 使用shRNA敲除Sirt1可消除这种保护作用（图​（图3D）。三D） ●●●●。SRT2183（5μM）是另一种特异且有效的Sirt1激活剂，对RMIC的治疗也显著减少了H₂O（运行）₂处理（图​（图3F，三F、，P（P）< 0.001). H降低进一步证实了这一点₂O（运行）₂-用SRT2183处理的RMIC中诱导裂解caspase-3水平（图​（图3H，三H、，P（P）< 0.05). 这些观察结果与Sirt1在RMIC中的抗氧化作用一致。

Sirt1缺乏会增加单侧输尿管梗阻损伤，导致凋亡和纤维化。

为了研究Sirt1在肾损伤中的潜在保护作用，我们使用单侧输尿管梗阻（UUO）模型，该模型与氧化应激增加有关(21,22). 尽管纯合Sirt1基因敲除小鼠表现出严重的发育缺陷(23)，杂合Sirt1敲除小鼠发育正常，其肾脏组织学正常（补充图1；本文在线提供的补充材料；doi：2017年10月17日/JCI41563DS1). qRT-PCR（图​（图4A，4A、，P（P）<0.01）和免疫印迹分析（图​（图4B，4B、，P（P）<0.05）证实显著下降Sirt1（信号1）杂合Sirt1基因敲除小鼠肾脏中mRNA和蛋白的表达(Sirt1（信号1）^+/–)老鼠。在第3天，两组梗阻肾中的Sirt1蛋白表达均显著增加Sirt1（信号1）^+/+鼠标（图​（图4C，4C、，P（P）<0.0001）和Sirt1（信号1）^+/–老鼠(P（P）<0.0001）（图​（图4C）。4C） ●●●●。此外，Sirt1在Sirt1（信号1）^+/–比在Sirt1（信号1）^+/+小鼠肾脏（图​（图4C，4C、，P（P）< 0.001).

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图4

杂合Sirt1基因敲除小鼠肾脏中Sirt1表达降低。

(A类)相对Sirt1（信号1）野生型全肾mRNA表达水平(Sirt1（信号1）^+/+)小鼠和杂合Sirt1基因敲除(Sirt1（信号1）^+/–)用qRT-PCR检测小鼠(n个= 4, *P（P）< 0.01). (B类)全肾Sirt1蛋白表达水平Sirt1（信号1）^+/+和Sirt1（信号1）^+/–用免疫印迹法检测小鼠(n个=6，密度测定*P（P）< 0.05). (C)Sirt1在大鼠整个肾脏中的表达Sirt1（信号1）^+/+和Sirt1（信号1）^+/–UUO后3天用免疫印迹法检测小鼠(n个=4，密度测定；^†P（P）<0.0001与对侧肾脏Sirt1（信号1）^+/+老鼠；^‡P（P）<0.0001与对侧肾脏Sirt1（信号1）^+/–小鼠*P（P）<0.001与肾梗阻Sirt1（信号1）^+/+小鼠）。

TUNEL分析显示，UUO（3天）后，肾细胞凋亡主要发生在小鼠的肾髓质中。TUNEL阳性细胞凋亡在肾髓质中显著增加Sirt1（信号1）^+/–老鼠比Sirt1（信号1）^+/+鼠标（图​（图5A，5A、，P（P）< 0.05). 梗阻肾中细胞凋亡增加Sirt1（信号1）^+/–与对照组相比，小鼠的裂解caspase-3表达水平更高Sirt1（信号1）^+/+鼠标（图​（图5B，5B、，P（P）< 0.01). UUO后7天，天狼星红染色（胶原标记物）在梗阻肾组织中更明显Sirt1（信号1）^+/–与Sirt1（信号1）^+/+鼠标（图​（图5C，5C、，P（P）< 0.05). 这一结果得到了梗阻肾中I型胶原（Col1）表达水平升高的证实Sirt1（信号1）^+/–鼠标（图​（图5D，5D、，P（P）< 0.05). 因此，Sirt1缺乏会增加UUO损伤后的肾细胞凋亡和纤维化。

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图5

Sirt1缺乏与输尿管梗阻肾细胞凋亡和纤维化增加有关。

(A类)肾髓质TUNEL阳性细胞凋亡的代表性图片（原始放大倍数，×200）和定量Sirt1（信号1）^+/+小鼠和Sirt1（信号1）^+/–UUO后3天的小鼠(*P（P）< 0.05). (B类)免疫印迹法检测凋亡标记裂解caspase-3在大鼠全肾的表达Sirt1（信号1）^+/+和Sirt1（信号1）^+/–UUO后3天的小鼠(n个=4，密度测定*P（P）<0.01与Sirt1（信号1）^+/+老鼠）。(C)肾脏切片上的代表性图片（原始放大倍数，×200）和天狼星红染色定量Sirt1（信号1）^+/+和Sirt1（信号1）^+/–UUO后7天的小鼠(*P（P）<0.05与肾梗阻Sirt1（信号1）^+/+老鼠）。(D类)全肾Col1蛋白表达水平Sirt1（信号1）^+/+和Sirt1（信号1）^+/–UUO后7天用免疫印迹法检测小鼠(n个=5，密度测定*P（P）<0.05与肾梗阻Sirt1（信号1）^+/+小鼠）。

Sirt1激活可减少UUO损伤诱导的细胞凋亡和纤维化。

与Sirt1缺乏相比，使用Sirt1激活物SRT1720（100 mg/kg/d）治疗野生型小鼠可显著减少UUO（3天）后梗阻肾髓质中TUNEL阳性细胞凋亡（图​（图6A，6A、，P（P）< 0.05). SRT1720治疗组与载体治疗组小鼠梗阻肾中裂解caspase-3表达的降低进一步证实了凋亡的减少（图​（图6B，6B、，P（P）< 0.0001). 此外，SRT1720治疗显著降低了天狼星红染色（图​（图6C，6C、，P（P）<0.05）和Col1在UUO（7天）后梗阻肾中的表达（图​（图6D，6D、，P（P）< 0.05). 因此，增加Sirt1活性可减少UUO损伤后肾细胞凋亡和纤维化，表明Sirt1在梗阻肾中具有保护作用。

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图6

Sirt1激活与输尿管梗阻肾脏的凋亡和纤维化减少相关。

(A类)UUO后3天，经车辆治疗或Sirt1激活剂SRT1720治疗（100 mg/kg/d）的野生型小鼠肾髓质中TUNEL阳性凋亡的代表性图像（原始放大倍数，×200）和量化(*P（P）< 0.05). (B类)UUO后3天，免疫印迹法检测车辆治疗或SRT1720治疗野生型小鼠整个肾脏中裂解caspase-3的表达(n个=4，密度测定*P（P）<0.0001与车辆治疗小鼠的肾脏阻塞相比）。(C)UUO后7天，车辆治疗或SRT1720治疗小鼠肾脏切片上的代表性图像（原始放大倍数，×200）和天狼星红染色定量(*P（P）与车用治疗小鼠的肾脏阻塞相比，<0.05）。(D类)通过免疫印迹法评估UUO后7天，车辆治疗或SRT1720治疗野生型小鼠的整个肾脏中Col1蛋白的表达水平(n个=5，密度测定*P（P）与车用治疗小鼠的肾脏阻塞相比，<0.05）。五、 车辆；SRT、SRT1720。

Sirt1调节RMIC COX2的表达。

Sirt1与COX2在RMIC中共定位，COX2活性是RMIC的重要生存因子(24–26). 为了进一步探讨Sirt1激活保护RMIC免受损伤的机制，我们检测了Sirt1活性是否促进RMIC中COX2的表达。RMIC COX2蛋白和mRNA表达显著增加₂O（运行）₂（500μM，6小时）（图​（图7，7、A和B）。H（H）₂O（运行）₂-Sirt1 shRNA几乎完全消除了诱导的COX2蛋白表达（图​（图7A）。7A） ●●●●。Sirt1 shRNA也显著降低了H₂O（运行）₂-诱导的COX2型mRNA表达（图​（图7B，7B、，P（P）< 0.0001). 此外，Sirt1激活剂SRT2183对RMIC的处理以剂量依赖的方式增加了COX2的表达（图​（图7C）。7C） ●●●●。相反，H都没有₂O（运行）₂也不下调Sirt1改变的COX1表达（图​（图7A），7A） Sirt1激活剂未诱导COX1表达（数据未显示），支持Sirt1对COX2表达的特定作用。此外，高渗应激对COX2的诱导不受Sirt1下调的影响（补充图2），这表明Sirt1特别参与氧化应激后的COX2反应。

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图7

Sirt1调节培养的RMIC中COX2的表达。

(A类)野生型或Sirt1敲除培养的RMIC受到H的攻击₂O（运行）₂（500μM）持续0、3或6小时。免疫印迹法检测Sirt1、COX2和COX1的表达。(B类)用H攻击野生型或Sirt1敲低的RMIC₂O（运行）₂（500μM）持续0或6小时。COX2型通过qRT-PCR评估mRNA表达(n个= 4, *P（P）<0.0001与H的野生型细胞相比₂O（运行）₂). (C)用Sirt1激活剂SRT2183（0、5、10、20μM）处理RMIC 8小时，并用免疫印迹法检测COX2的表达(n个= 4). (D类)在带有H的野生型或Sirt1敲除型RMIC中测量COX2荧光素酶报告活性₂O（运行）₂使用双荧光素酶检测试剂盒（250μM）0或12小时(n个= 12, *P（P）<0.0001与H的野生型细胞相比₂O（运行）₂). (E类)对未处理或H进行ChIP分析₂O（运行）₂-使用抗Sirt1抗体和PCR引物处理（500μM，3小时）RMIC，识别转录起始位点上游的小鼠COX2 5′序列[-712，-396]或[-4166，-3946]。C、 对照组：用正常兔IgG免疫沉淀。数据代表了3个独立实验。

由于Sirt1活性在体外调节COX2的表达，我们进一步研究了Sirt1在体内调节肾脏COX2表达的作用。主要在梗阻肾的肾髓质中观察到大量COX2诱导（红色），但对侧肾没有观察到（图​（图8A）。8A） ●●●●。AQP2染色（绿色）收集管之间的RMIC中COX2的确认表达（红色）（图​（图8A，8A、 右侧）。1个等位基因缺失Sirt1（信号1）UUO后（3天），基因显著降低阻塞肾中COX2的诱导（图​（图8B，8B、，P（P）< 0.05). 此外，使用Sirt1激活剂SRT1720（100 mg/kg/d）治疗野生型小鼠，显著诱导COX2表达（红色），主要在AQP2染色（绿色）集合管之间的RMIC中（图​（图8C）。8C） ●●●●。通过免疫印迹法评估，SRT1720处理的小鼠与载体处理的小鼠相比，肾脏COX2表达增加，进一步证实了这一结果（图​（图8D，8D、，P（P）< 0.05). 总之，这些体内观察结果与体外结果一致，并支持Sirt1在增加RMIC中COX2表达中的重要作用。

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图8

Sirt1调节体内RMIC中COX2的表达。

(A类)典型的免疫荧光图像显示UUO后3天野生型小鼠梗阻肾髓质中COX2诱导（红色）。Costaining进一步显示AQP2阳性（绿色）收集管（右侧面板）之间的RMIC中诱导的COX2（红色）。(B类)免疫印迹法检测COX2在大鼠全肾中的表达Sirt1（信号1）^+/+和Sirt1（信号1）^+/–UUO后3天的小鼠(n个=5，密度测定*P（P）<0.05与肾梗阻Sirt1（信号1）^+/+老鼠）。(C)野生型小鼠用载体或Sirt1激活剂SRT1720（100 mg/kg/d）治疗5天。免疫荧光协同染色显示，SRT1720诱导AQP2阳性（绿色）集合管间RMIC中COX2表达（红色）。(D类)用免疫印迹法检测载体或SRT1720处理小鼠的整个肾脏中COX2的表达(n个=4，密度测定*P（P）<0.05，与车辆处理小鼠相比）。

进一步研究了连接Sirt1和COX2的机制。Sirt1活性似乎在转录水平上调节培养的RMIC COX2表达，因为Sirt1 shRNA显著减弱了H₂O（运行）₂-诱导（250μM，12小时）COX2荧光素酶报告子激活（图​（图7D，7D、，P（P）< 0.0001). 为了确定Sirt1是否与COX2启动子有物理关联，我们对H₂O（运行）₂-处理过的RMIC。用Sirt1抗体免疫沉淀的DNA中存在来自小鼠COX2启动子区的序列（5′序列-712至-396），通过PCR证实（图​（图7E）。7E） ●●●●。在未经处理的细胞和H细胞中均检测到Sirt1相关COX2启动子序列₂O（运行）₂-这表明Sirt1可能与COX2启动子区的转录复合物有关。

化合物。

Sirt1激活剂SRT1720和SRT2183由Christoph Westphal和Jill Milne（Sirtris，一家GSK公司，马萨诸塞州剑桥）提供。对于用于体内研究的1 ml 50 mg/ml储备给药溶液，将50 mg SRT1720添加到400μl PEG400中并旋涡形成均质悬浮液。将吐温-80（5μl）添加到595μl水中并旋转。然后将吐温-80/水添加到SRT1720/PEG400中并旋转直至均匀。大约5-10分钟后，悬浮液变得半透明。最终载体成分为40%PEG400、0.5%吐温-80和59.5%水。根据该公司的建议，每天口服一次SRT1720（100 mg/kg体重）给小鼠。在体外研究中，SRT化合物溶解在二甲基亚砜中。最终浓度为0.5–10μM SRT1720，最终浓度为1–20μM SRT2183。

COX2选择性抑制剂SC58236由Karen Siebert和Peter Isakson（辉瑞/塞尔，纽约州纽约市）提供。在体外研究中，将化合物溶解在二甲基亚砜中。最终浓度为0.5μM或2.5μM。

UUO公司。

用50毫克/千克体重的氯胺酮和100毫克/千克重量的甲苯噻嗪麻醉小鼠（雄性，8周龄）。左输尿管经外侧切口暴露，在肾下极水平用2条缝合线结扎。在手术后第3天或第7天处死小鼠。收集对侧肾脏和梗阻肾脏，并评估其基因表达、凋亡和纤维化。

免疫印迹。

蛋白质浓度采用双钦酸蛋白质测定法（Sigma-Aldrich）测定。将50微克蛋白质装载在10%SDS-PAGE微凝胶的每个泳道中，并在100V下运行。将蛋白质在冰上在100V下转移到PVDF膜上1小时。用TBST（50mM Tris，pH 7.5，150mM NaCl，0.05%吐温-20）洗涤膜3次，在室温下在封闭缓冲液（150mM NaCl，50mM Tris，0.05%吐温-20和5%康乃馨脱脂奶粉，pH 7.5）中孵育1小时，然后在4°C下与一抗在封闭缓冲液中孵育过夜。使用的主要抗体为：抗Sirt1抗体（Millipore兔多克隆，1:1000；Sigma-Aldrich鼠单克隆，1:2000）、抗裂解caspase-3抗体（Cell Signaling兔单克隆，1:100）、抗COX2抗体，抗Col1抗体（MD Biosciences兔多克隆，1:10000）、抗–β-肌动蛋白抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories小鼠单克隆，1:5000）和抗–α-微管蛋白抗体（Sigma-Aldrich鼠单克隆，1:2000）。清洗3次后，将膜在室温下与辣根过氧化物酶结合二级抗体（Jackson Immuno-Research Laboratories，1:5000）孵育1小时，然后用TBST清洗3次。通过添加化学发光试剂（PerkinElmer Life Sciences）、，将膜暴露于柯达XAR-5胶片。由于肾中Sirt1的异质性表达以及梗阻肾的畸形形态，组织取样（从髓质中解剖皮质）很容易在数据中引入伪影。因此，将整个肾脏均质化，并将整个肾脏裂解物用于图中的所有免疫印迹研究​图44–6和​和8。8.

免疫组织化学。

脱蜡的5μm切片用3%的H短暂培养₂O（运行）₂然后用第一抗体孵育60分钟，用含有0.1%吐温-20的Tris缓冲盐水漂洗，并用生物素化的第二抗体孵育30分钟。在PBS中清洗后，用辣根过氧化物酶结合抗生素标记溶液（ABC Elite Kit，Vector）在22°C下培养切片30分钟，然后用3,3-二氨基联苯胺溶液（DAB）清洗和培养。然后在光学显微镜下检查之前进行反染色。使用的主要抗体如下：抗Sirt1抗体（Millipore兔多克隆，1:500）、抗亚硝基酪氨酸抗体和抗4-羟基壬醛抗体（R&D Biosystems小鼠单克隆，1:50）。

免疫荧光染色。

肾组织固定在4%对甲醛中，然后在30%蔗糖中培养过夜。将冷冻切片（5μm）用3%的正常驴血清封闭20分钟，然后在室温下与一级抗体孵育60分钟。在PBS中清洗后，将切片在Cy2-或Cy3-结合抗-IgG二级抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories，1:200）中培养30分钟，并在PBS内清洗5次，然后使用蔡司Axioskop和斑点相机（诊断仪器）或共聚焦显微镜（Zeiss LSM510）进行显微镜检查。用于免疫荧光研究的主要抗体为：抗Sirt1抗体（Millipore兔多克隆，1:500）、抗AQP1抗体（Santa Cruz Biotechnology Inc.小鼠单克隆，1:100）、抗Tamm Horsfall蛋白（THP）抗体（MP生物医学山羊多克隆，1:1000）、，抗AQP2抗体（Santa Cruz Biotechnology Inc.山羊多克隆，1:400）和抗COX2抗体（Cayman rabbit多克隆，1:1500）。

RMIC的文化。

小鼠RMIC的制备如前所述(9,54). 简言之，在无菌条件下从供者C57BL6/J小鼠中切取8个肾脏，切除髓质区，切碎并悬浮在含有10%（v/v）胎牛血清和青霉素/链霉素的DMEM（Invitrogen）中。然后将含有供体小鼠肾髓质组织的混合混悬液注射到同种受体小鼠腹壁的3个或4个不同位置。四天后，处死受体小鼠，取出坚硬的黄色结节并切碎，细胞在37°C的0.05%胰蛋白酶-EDTA中胰蛋白酶化15分钟，清洗并在230℃下造粒克将颗粒重新悬浮并培养在补充有10%胎牛血清和青霉素/链霉素的DMEM中，37°C，95%空气/5%CO₂孵化器。培养的小鼠RMIC含有油红O染色阳性的富含脂质的液滴，这是1型骨髓间质细胞的特征(55).

携带选择性Sirt1 shRNA的慢病毒击倒Sirt1。

利用FuGENE（Roche）将HEK293T细胞与携带Sirt1-选择性shRNA（Sigma-Aldrich MISSION shRNA文库，SHCLNG-NM_019812）、psPAX2包装质粒和pMD2.G包膜质粒的慢病毒pLKO.1质粒共转染。12小时后，取出含有转染试剂的培养基，用新鲜的完整DMEM加上10%FBS和青霉素/链霉素替换。20小时后，从HEK293T细胞中提取含有慢病毒颗粒的培养基，并转移到聚丙烯储存管中。病毒保存在-80°C的小份中。然后用含有适量慢病毒颗粒的培养基感染原代培养的小鼠RMIC。20小时后，去除含病毒培养基并用新鲜培养基替换。感染的小鼠RMIC培养3天，然后进行RT-PCR或免疫印迹检测mRNA或蛋白敲除的效率。对照组包括空的pLKO.1质粒或含有干扰shRNA的pLKO.1质粒。此外，在所有敲除实验中并排使用来自Sigma-Aldrich的2种不同Sirt1-选择性shRNA，它们产生了相似的表型。

逆转录聚合酶链式反应。

使用TRIzol试剂（Invitrogen）从培养的小鼠RMIC中提取总RNA，并使用高容量cDNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems）进行逆转录。PCR所用的引物为Sirt1:sense 5′-GCAACACATCTTGCCTGAT-3′，antisense 5′-GTGTACTCCCACTT-3′；SIRT2：正义5′-CTTCCTGCATGAT-3′，反义5′-ACCTGACTGCATCTAT-3′；SIRT3:正5′-CAGCAACCTTCAGCAGTA-3′，反义5′-CCGTGCATAGCTTA-3′。PCR程序使用了30个周期（94℃，30秒；58℃，30秒钟；72℃，45秒）。

qRT-PCR。

使用TRIzol试剂（Invitrogen）从肾组织或培养的RMIC中提取总RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems）进行逆转录。使用Taqman基因表达分析系统（应用生物系统）进行qRT-PCR。所使用的探针为Mm01168521_m1（小鼠Sirt1）、Mm00478374_m1（小鼠COX2）、Mm00477214_ml（小鼠COX1）、Nm00801666_g1（小鼠Col1a1）和Mm00802372_m1（鼠Col4a1）。真核生物18S rRNA（4319413E）探针用作内源性对照。基因表达值是基于参考文献中详述的比较阈值循环（Ct）方法计算的。56，归一化为18S rRNA的表达值，并显示为相对于对照的折叠诱导。

结晶紫染色。

用结晶紫染色法评估细胞活力(57–59). 首先取出培养基，用PBS冲洗培养板。剩余的活的附着细胞在室温下用0.5%结晶紫在50%甲醇中染色15分钟，然后用水轻轻冲洗并干燥。然后用500μl 0.1 M柠檬酸钠在20%甲醇（pH 5.4）中重新溶解12孔板每个孔中的结晶紫。30分钟后，使用分光光度计读取570 nm处的吸光度。对于对照组，细胞未经处理。然后，将未经处理的对照孔的存活率任意设置为100%，并将处理孔的结晶紫吸光度与对照孔的结晶紫光吸光度进行比较，以获得相对细胞存活率。

隧道。

根据制造商的协议（荧光素原位细胞死亡检测试剂盒，目录11684795910，罗氏）对培养的RMIC进行TUNEL分析。使用了带有DAPI（Vector）的荧光Vectashield安装介质。使用蔡司Axioskop和spot-cam数码相机（诊断仪器）进行免疫荧光显微镜检查。通过计算至少15个随机高倍场上TUNEL阳性细胞与DAPI染色的总细胞核的比率来量化凋亡细胞百分比（HPFs，最终放大倍数×400）。

对于肾切片的TUNEL分析，对5μm厚的石蜡包埋组织切片进行脱蜡和水合处理，并在3%H中淬火₂O（运行）₂去除内源性羟基过氧化物酶活性15分钟，然后进行微波抗原回收和蛋白酶K处理以暴露DNA。将载玻片在室温下的加湿室中，在含有TdT末端转移酶（Fisher）、Bio-14-dATP（Gibco，Invitrogen）和One-Phor-All缓冲液（与TdT终端转移酶一起提供；Fisher的）的反应溶液中培养1小时。在PBS中洗涤两次3分钟，然后在室温下在水中洗涤2%的BSA 10分钟，最后在辣根过氧化物酶-结合抗生素标记溶液（ABC Elite试剂盒，Vector）中培养并用DAB染色，从而终止反应。通过计数一个肾切片的肾髓质（包括外髓质和内髓质）中至少6个随机HPF中的TUNEL阳性细胞来量化凋亡细胞。

天狼星红染色。

通过天狼星红染色测定肾脏切片中的胶原蛋白积累(60)并通过图像分析进行量化。在不了解治疗方案的情况下进行分析。总之，石蜡包埋段被切割成5μm厚的段并脱蜡。将载玻片在苦味酸红溶液（0.5 g天狼星红F3B[C.I.35782，Sigma-Aldrich]在500 ml苦味酸饱和水溶液中）中培养1小时，然后在2次变化的酸化水中清洗（1 l水中5 ml乙酸）。通过剧烈摇晃或用大坝滤纸吸干，从载玻片中物理去除大部分水后，用3次100%乙醇脱水，用二甲苯清除，然后装在树脂介质中。使用蔡司Axioskop和斑点摄像头数码相机（诊断仪器），在最终放大倍数为×200的情况下，每个肾脏切片拍摄15-25个非重叠区域。使用ImageJ进行图像分析，并对先前描述的技术进行修改(61). 数据显示为与天狼星红反应的胶原纤维所占的平均肾小管间质面积，与总面积（%）相比。

双荧光素酶报告分析。

891-bp人COX2启动子驱动的萤火虫荧光素酶报告子构建物由Lee-Hoo Wang（休斯顿德克萨斯大学健康科学中心血液学系）提供(62). COX2报告子萤火虫荧光素酶质粒和含有雷尼利亚使用FuGENE（Roche）将由TK启动子（Promega）驱动的荧光素酶共同转染到原代培养的小鼠RMIC中。双荧光素酶检测试剂盒（Promega）用于测量萤火虫和雷尼利亚转染RMIC的荧光素酶活性（有或无治疗）。相对荧光素酶活性定义为COX2报告萤火虫荧光素酶活性由雷尼利亚荧光素酶活性。与对照组相比，数据显示为折叠诱导。

ChIP测定。

根据制造商的方案（Millipore，ChIP分析试剂盒，目录17-295）进行ChIP分析。用1%甲醛交联培养的小鼠RMIC，并在37°C下孵育10分钟。在使用含有蛋白酶抑制剂的冰冷PBS清洗两次后，将细胞刮入锥形管中，并在640℃下旋转4分钟克温度为4°C。将细胞颗粒重新悬浮在SDS裂解缓冲液中，并在冰上培养10分钟。将裂解产物在冰上进行超声波处理，将DNA剪切到200到1000个碱基对之间的长度，然后在含有蛋白酶抑制剂的ChIP稀释缓冲液中稀释10倍。将免疫沉淀抗体（Millipore rabbit anti-Sirt1，工作浓度5μg/ml）添加到上清液部分，在4°C下旋转培养过夜（对于阴性对照，添加免疫前IgG进行免疫沉淀）。然后将鲑鱼精子DNA/蛋白质A琼脂糖浆液（50μl加入2 ml上清液中）在4°C下旋转培养1小时。琼脂糖通过温和离心（100克温度为4°C，约1分钟）。去除含有未结合的非特异性DNA的上清液。蛋白A琼脂糖复合物在旋转平台上用试剂盒提供的洗涤缓冲液洗涤3-5分钟。通过添加新制备的洗脱缓冲液（1%SDS，0.1 M NaHCO）从抗体中洗脱沉淀络合物_三)，短暂旋涡，在室温下孵育15分钟。然后旋转琼脂糖，将上清液部分（洗脱液）转移到另一个试管中，重复洗脱。合并洗脱液，通过添加5 M NaCl（20μl到500μl）并在65°C下加热4小时，逆转蛋白质-DNA交联。用蛋白酶K进一步处理反交联洗脱液，通过苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀回收DNA。用70%乙醇清洗颗粒并风干。然后将颗粒重新悬浮在适当的缓冲液中进行PCR。所用引物如下：[-712，-396]区，5′-CAGCAGGGAAAAATACCTT-3′，反义5′-CGGGATCTAACT-3′；[–4166，–3946]区，意义5′-GGACTGGCTAGACATTGA-3′，反义5′-AGCAGGGACACATGGA-3′。PCR程序使用了30个周期（94°C，30秒；60°C，1分钟；72°C，一分钟）。

这项工作得到了NIDDK拨款DK071876和DK074116（给C.M.Hao）以及DK44757和DK56942（A.B.Fogo）的支持。R.Zent是NIH拨款DK075594和DK65123的接受者，这是美国心脏协会设立的研究人员奖，也是退伍军人事务部颁发的优秀奖。L.您得到了国际肾脏学会奖学金的支持。