长期使用膜封闭剂预防营养不良犬的严重心脏损伤和心室扩张

GRMD动物体内血液动力学基线。

为了解决心肌细胞顺应性差对心脏整体血流动力学功能的重要性，我们对GRMD犬进行了基于导管的有创血流动力学评估。这些研究中使用了8只成年GRMD犬和10只野生型犬（表​（表1）。1). 对动物进行麻醉，并抽取基线血样。与未麻醉的野生型犬相比，GRMD犬在麻醉诱导后即刻的血清心肌肌钙蛋白I（cTnI）水平显著升高（图​（图2A）。2A） ●●●●。休息时，GRMD动物的血清cTnI水平正常（见下文），这表明单独全身麻醉会对GRMD引起显著的心脏损伤，但对正常狗则不会。麻醉对升高的血清肌酸激酶（CK）水平没有显著影响（图​（图2B2B及以下）。相比之下中密度纤维板DMD小鼠模型(30)，营养不良的狗心脏舒张末期容积没有明显减少（图​（图3），三)舒张末期压力也没有升高（表​（表2）。2).

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图2

GRMD动物麻醉诱导后血清cTnI升高。

全麻诱导后几分钟内采集的血清样本显示心脏损伤生物标志物显著升高(A类). (B类)GRMD犬血清CK显著升高。数值显示为平均值±SEM；n个= 8–10.^‡P（P）<0.05 byt吨测试。

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图3

GRMD动物的基线血流动力学功能。

(A类和B类)野生型下腔静脉阻塞时典型的左室压力描记(A类)和GRMD(B类)红心。(C类和D类)舒张末期容积总结(C类)和冲程容积(D类)休息时（黑条）和多巴酚丁胺反应时（白条）。平均舒张末期容积（EDV）变化总结(E类)和收缩末期容积（ESV）(F类)多巴酚丁胺引起的反应。数值显示为平均值±SEM*P（P）与野生型相比，<0.05。

表1

GRMD和野生型犬的初始年龄、体重、选定的基线血流动力学参数和随机治疗组

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表2

基线和急性多巴酚丁胺输注期间预处理血液动力学和心电图参数总结

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与野生型犬相比，GRMD犬有明显的高血压，心室和股动脉收缩压增加（表​（表2）。2). 动脉弹性和总外周阻力增加（表​（表2），2)这表明营养不良犬的系统血管系统存在差异。动脉功能的差异也可以解释最大松弛率（dP/dt）的增加_最小值)在没有其他舒张功能改善指标的情况下（τ和90%松弛时间；表​表2）。2). 冠状血管的充盈有助于心室压力的早期放松，动脉顺应性差会增加收缩压脉冲向心脏的反射。反射压力脉冲的增加增加了冠状血管的压力，进而增加了早期心室舒张的速率(32).

基线测量后，注射多巴酚丁胺（15μg/kg/min），直到观察到峰值效应，此时停止注射多巴酚丁胺。在对多巴酚丁胺的反应中，营养不良犬表现出显著的心脏储备功能，收缩和舒张参数增加，与野生型犬相似（图​（图3三和表​表2）。2). 多巴酚丁胺输注后，在野生型犬中观察到心室容积的动态变化；然而，这些变化在营养不良的狗中显著减弱（图​（图3，三、E和F）。

GRMD动物的膜密封剂急性输注。

在最初的血液动力学方案中，静脉注射急性剂量的P188（460 mg/kg）15分钟，总容量为3 ml/kg。该剂量足以使舒张末期容积正常化中密度纤维板鼠标(30). 在GRMD心脏中，该剂量的P188对舒张末期容积没有明显的急性影响（图​（图4A）。4A） ●●●●。在注射同等剂量P188的野生型动物中，未观察到舒张末期容积的显著变化。未参与慢性研究的1岁GRMD犬的心脏切片组织学检查显示，当天狼星红染色时，存在广泛的纤维化。这种纤维化有两种形式：与病变心肌相关的大病变和相对正常心肌周围纤维化程度增加（图​（图4B）。4B） ●●●●。对野生型切片的分析显示，心肌层之间只有少量胶原蛋白（图​（图4C）。4C） ●●●●。

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图4

GRMD犬先前存在的纤维化病变和心室容积。

(A类)GRMD犬和野生型犬急性输注P188前后舒张末期容积的评估。数值显示为平均值±SEM(B类)未经治疗的成年GRMD动物的典型天狼星红染色组织病理切片。在亮场图像中（左），胶原蛋白呈红色；在偏振光下，天狼星红色染色的胶原蛋白表现出双折射，使其可视为绿色光线（右）。上面的图像显示一个大的病变，伴有广泛的纤维化和退化的心肌细胞。下图显示了穿过相对正常心肌区域的胶原链（箭头所示）。(C类)野生型心肌的相同染色。比例尺：100μm。

我们通过测定血管功能的几种指标来探讨P188对血管系统的潜在急性影响。急性服用P188不会改变大动脉的弹性特性（补充图1；本文在线提供补充材料；doi：10.1172/JCI41329DS1号机组). 同样，P188对总外周阻力和外周血压没有影响（补充图1）。这些数据与P188对营养不良心肌细胞膜的选择性作用一致。

在血液动力学测试期间，心律失常事件在野生型和GRMD犬之间并不常见，也没有差异。与野生型犬相比，营养不良犬的基线心率显著增加，P-R间期缩短，服用多巴酚丁胺后两者均无差异（表​（表2）。2). 营养不良狗的Q波与R波振幅之比显著升高，但急性多巴酚丁胺并未改变这种影响（表​（表2）。2). 急性输注P188对野生型或营养不良犬的心电图测量没有显著影响（补充图2）。

慢性输注泊洛沙姆治疗GRMD动物。

在成年GRMD动物中开始持续血管内输注P188或盐水载体对照。将动物随机分为治疗组。在长期输注P188或生理盐水之前，各组的基线血流动力学功能相似（表​（表1）。1). 在最初的血液动力学评估后，在侧翼植入一个血管入口，并连接到一个留置的颈静脉导管。修复颈动脉，关闭所有切口，让动物从麻醉中恢复。第二天，两组均开始输注0.9%生理盐水（0.4 ml/kg/h），持续1周。P188在狗体内的血清半衰期为18小时(33); 因此，1周足以清除急性给药后剩余的P188。在冲洗和手术恢复期结束后，生理盐水组继续以0.4 ml/kg/h的速率接受0.9%NaCl，P188治疗组开始以相同的速率（0.4 ml/kg/h）接受60 mg/kg/h的0.9%NaCl中的P188，共治疗8周（图​（图5A）。5A） ●●●●。

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图5

GRMD动物长期服用P188期间的疾病生物标志物总结。

(A类)P188慢性给药研究设计大纲(n个=4）或盐水(n个=4）在GRMD动物中。(B类–E类)慢性输液期间每两周采集一次样本的血清化学数据；显示的是(B类)cTnI（虚线表示野生型犬只值）(C类)CK公司(D类)天冬氨酸转移酶（AST）和碱性磷酸酶（ALP），以及(E类)血尿素氮（BUN）和肌酐。数值显示为平均值±SEM；每组4-8只动物*P（P）<0.05，双向方差分析显示治疗效果显著。

在8周的慢性输液期间，定期采集血液样本以监测心脏损伤生物标记物。盐处理的GRMD动物血清cTnI浓度显著升高，这是心脏损伤的证据。相反，P188治疗的GRMD动物的血清cTnI水平完全正常（图​（图5B；5B类；P（P）与生理盐水相比<0.05）。P188输注后血清CK水平没有变化（图​（图5C）。5C） ●●●●。评估P188对肾脏和肝脏系统的安全性。图​图5，5D和E表明，在8周输注过程中，接受P188的狗的肝酶没有变化，也没有氮质血症的迹象。这些结果表明，给予60 mg/kg/h的P188 8周不会导致GRMD动物的肾脏或肝脏损伤。

心肌纤维化在DMD患者和GRMD犬中是一致的发现（图​（图44和参考文献。5,25,34,35). 纤维化损伤被认为是由心肌细胞坏死和随后的炎症反应引起的。这些纤维化损伤可能会增加邻近心肌细胞的机械应变，随着时间的推移，导致心肌细胞进一步坏死和随后的纤维化。为了评估长期服用P188限制纤维化的能力，我们用天狼星红染色心脏组织，以确定成熟的纤维化病变。量化纤维化区域后，接受P188的GRMD动物(P（P）<0.05）纤维化程度高于GRMD组（图​（图6，6、A和B）。虽然P188减弱了GRMD动物的损伤形成，但它并没有将心肌损伤含量恢复到野生型水平（图​（图6B）。6B） ●●●●。成年GRMD动物的慢性P188给药确实完全阻断了心力衰竭生物标志物BNP的增加（图​（图6C；6C类；P（P）< 0.05).

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图6

慢性P188治疗限制了GRMD动物的心肌纤维化并阻断了BNP升高。

(A类)心肌切片的天狼星红染色显示GRMD心脏广泛纤维化。胶原蛋白在亮场图像中呈红色，在偏振图像中呈黄绿色。比例尺：400μm。(B类)每组4只狗的16-24个切片中胶原蛋白含量的定量。(C类)慢性输液方案之前（GRMD-Pre）和之后的血清BNP水平。数值显示为平均值±SEM；每组4-8只动物*P（P）与野生型相比<0.05；^‡P（P）与GRMD（生理盐水）组相比，<0.05。所有数据均采用单因素方差分析和Bonferroni多重比较事后检验进行分析。

在为慢性研究随机分组之前，GRMD盐水组与P188治疗组动物的左室几何结构没有显著差异（表​（表11和图​图7，7、A和C）。在8周输液期后，对营养不良的狗进行第二次血流动力学检查。在8周的输注期内，接受盐水的GRMD犬出现显著的LV扩张(P（P）< 0.05; 图​图7）。7). 引人注目的是，接受P188基因治疗的GRMD动物左室构型没有改变，也没有向扩张的心脏表型发展。在整个血液动力学测试方案中，生理盐水和P188处理的GRMD动物之间的左室几何结构差异明显（图​（图7C）7C） 在服用多巴酚丁胺后尤为明显（图​（图7，7，C–F）。生理盐水GRMD组心室几何结构的扩张与持续的心脏损伤和坏死/纤维化相一致。血流动力学数据还显示，与盐处理的GRMD动物相比，P188处理的GRMD动物的等容舒张功能显著增强（图​（图7D）。7D） ●●●●。慢性P188介导舒张功能改善的机制尚不清楚，但其测定可能对DMD患者有进一步的益处，因为舒张功能障碍是心脏病的早期标志(36).

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图7

八周的P188给药可防止GRMD动物的LV重塑。

基于导管的心室内记录显示接受盐水输注的GRMD犬的心室重构显著。(A类和B类)处理前压力-体积回路的代表性轨迹(A类)以及在慢性输液方案之后(B类). (C类)在最终血流动力学方案期间监测左室舒张末期容积。最左边的偏移是慢性输液前初始血液动力学方案的基线数据*P（P）<0.05（见方法）。(D类–F类)多巴酚丁胺反应峰值期间（输注后约10分钟）的血流动力学数据比较；左心室压力τ(D类)，舒张末期容积(E类)和收缩末期容积(F类). 每组由3-4只狗组成。^‡P（P）<0.05 byt吨测试。对于C类–F类，值显示为平均值±SEM。

输注P188或生理盐水后，从营养不良犬身上分离出的肌细胞在钙处理方面表现出一些显著差异。从接受慢性P188输注的GRMD犬分离的心肌细胞中，钙释放幅度和松弛动力学均得到改善（补充图3）。这些钙处理的改善是由于P188治疗组的心肌细胞健康得到改善，而不是P188的直接作用，后者在心肌细胞分离过程中被清除。

为了确定慢性P188给药对肌营养不良蛋白缺乏心肌细胞原发性细胞缺陷的影响，我们在输注方案结束时检查了分离心肌细胞的被动张力延伸特性（图​（图8A）。8A） ●●●●。如未经治疗的GRMD犬的心肌细胞所示（图​（图1），1)，从接受生理盐水的GRMD动物中分离的单个肌细胞对即使是很小的长度延伸也高度敏感。除了表现出较差的肌细胞顺应性外，输注生理盐水的GRMD肌细胞在轻度肌节伸展后极易发生末端挛缩（图​（图8，8、A和C）。从接受慢性P188的GRMD犬分离出的肌细胞，但在分离过程中P188被洗掉，其被动伸展特性与未经治疗的动物的营养不良肌细胞相似（图​（图8A），8A） ，证明P188活性很容易被逆转。然而，无论之前的治疗如何，对分离的GRMD心肌细胞急性给予P188都会将被动张力-伸展关系纠正为与肌营养不良蛋白充满犬心肌细胞水平相似（图​（图8，8、B和C）。这些数据表明，GRMD心肌细胞的被动伸展张力关系严重减弱，继发于膜撕裂的形成，在P188的存在下得到纠正。

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图8

慢性输注后完整GRMD心肌细胞的体外被动张力-伸展关系。

输注8周后，从P188（红色）和盐水（蓝色）GRMD和野生型犬中分离出心肌细胞。缺乏营养不良心肌细胞的被动张力-伸展关系(A类)和存在(B类)μM P188的急性应用。黑色曲线B类来源于野生型心肌细胞数据A类并作为参考。SL，肌节长度。(C类)各组之间最大稳定肌节长度（Max SL）的比较*P（P）与野生型相比<0.05；^†P（P）与慢性盐水GRMD组相比<0.05；^‡P（P）与慢性P188 GRMD组相比<0.05。数值显示为平均值±SEM。所有点均来自4-5只狗的5-7个心肌细胞。所有数据均采用单因素方差分析和Bonferroni的多重比较事后检验进行分析。总经理、总经理。

GRMD动物心脏病严重程度的机制。

唯一发表的关于膜封闭剂和DMD心肌病的研究集中于泊洛沙姆单剂量急性应用于中密度纤维板鼠标(30). 这个中密度纤维板DMD小鼠模型在阐明疾病机制和测试新的实验疗法方面仍然很有价值。然而，这些研究面临的一个挑战是中密度纤维板小鼠与严重受影响的GRMD动物进行比较。此外，细胞内钙²⁺小鼠心脏的处理与狗心脏的处理明显不同，狗心脏与人类心肌具有高度可比性(43). 这是一个重要的考虑因素，因为中密度纤维板小鼠在被动细胞膨胀导致短暂钙释放期间，肌膜内出现微耳²⁺条目。这导致被动张力延伸特性的提高中密度纤维板肌细胞(30). 因为已知GRMD动物有明显的心肌病(25,28,29,44)为了与最近在中密度纤维板肌细胞(30). 此处的结果表明，与中密度纤维板肌细胞（图​（图1）1) (30). 即使与基线肌节长度相比有很小的长度偏移（>1.8μm），GRMD肌细胞也有异常高的被动张力，这是以前在中密度纤维板或野生型心肌细胞。营养不良狗和小鼠分离的心肌细胞之间顺应性缺陷的数量差异表明，这些模型中的细胞结构/功能存在重要的机制性差异。本研究的另一个重要新发现是，来自GRMD犬的膜完整心肌细胞缺乏关键的细胞适应中密度纤维板肌营养不良蛋白同源物utrophin上调对心肌的影响(37,38). Utrophin与dystrophin高度同源，共享许多相同的结构域(45). 在野生型小鼠中，utrophin在心脏中表达很少。在中密度纤维板在缺乏肌营养不良蛋白的小鼠中，utrophin蛋白的表达显著增加，并局限于肌膜，在肌膜中通常可以发现dystrophin(37,38). 此外，营养不良蛋白缺乏肌肉中utrophin的转基因表达可预防病理并恢复正常功能(46,47). Utrophin被认为是肌营养不良蛋白的替代物，为肌营养不良素缺乏的细胞膜提供了增强的结构完整性，减少了细胞膜撕裂的发生率，并限制了心肌细胞的丢失。在这种情况下，我们的新发现是，与对照组相比，GRMD心肌中utrophin的表达没有增加，这为解释GRMD的机械硬度和损伤敏感性增加提供了一种机制中密度纤维板心肌。

这些营养不良的心肌细胞结构-功能结果构成了模型的核心，有助于解释GRMD动物中显著的器官级疾病严重程度（图​（图10）。10). 此处和其他地方的发现(28,30)显示肌细胞被动扩张，通常发生在心室舒张充盈期间，在肌营养不良蛋白缺乏时明显向左移位（图​（图10A），10A） ，表示膜完整细胞的显著刚度。在模型系统中，营养不良蛋白缺乏伴随着营养不良蛋白的上调（例如。，中密度纤维板)，心肌细胞顺应性部分恢复正常（图​（图1B1B和图​图10B）。10B） ●●●●。细胞顺应性缺陷严重程度的差异反过来可以解释GRMD的纤维化程度大于中密度纤维板心肌细胞丢失增加导致的心脏病。本文获得的结果表明，在GRMD肌细胞中缺乏utrophin的上调会导致显著的膜不稳定，限制细胞膜的完整性，从而限制顺应性，最终导致器官水平病理恶化（图​（图10B）。10B） ●●●●。

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图10

GRMD动物严重心肌病的细胞基础模型。

(A类)膜接触心肌细胞被动张力-延伸曲线示意图。在肌营养不良蛋白存在的情况下，心肌细胞在整个工作肌节长度范围内（黑线）表现出顺应性。如GRMD心肌细胞所示，在缺乏肌营养不良蛋白的情况下，心肌细胞变得非常不顺从，对被动伸展（灰线）具有抵抗力。营养素上调部分恢复肌营养不良蛋白缺陷肌细胞的被动伸展张力特性（虚线），如图中密度纤维板肌细胞。(B类)描述野生型动物中肌营养不良蛋白（蓝色）正常机械稳定功能的细胞模型。在野生型心肌细胞中，在被动细胞延伸（下图）时，肌营养不良蛋白保护细胞膜免受损伤。在中密度纤维板肌细胞，肌营养不良蛋白缺失，但utrophin（红色）上调，部分取代了肌营养不良素的机械缓冲特性。这提供了一些但不是完全保护膜免受机械损坏。因此，随着细胞的延伸，会出现一些膜损伤。在肌营养不良蛋白缺乏的狗心肌细胞（GRMD）中，utrophin没有上调。因此，随着细胞的延伸，细胞膜受到更多的损伤。

血管入口位置和血流动力学。

用药前包括吗啡（1 mg/kg；静脉注射）和咪唑安定（0.3 mg/kg；腹腔注射）；一些野生型犬需要补充剂量的乙丙嗪（0.05毫克/公斤；静脉注射）。用静脉注射丙泊酚（4 mg/kg）诱导麻醉，并用异氟醚或七氟醚维持在手术麻醉平面上。放置股动脉导管后，分离左颈静脉和颈动脉。将一个6英寸的法式导引器插入左颈动脉，并用一条缝线固定。在透视引导下，将5个法国10电极压力-容积导管（SPR-554-11，Millar Instruments）通过主动脉瓣插入左心室腔，并定位以在所有7个节段和适当的压力-容积环路中发出强信号。该导管与MPVS Ultra信号调节装置（Millar Instruments）接口，数据由DAQ-16采集装置和Ponemah软件包（DSI）采集。在最初的血液动力学方案中，在基线、输注多巴酚丁胺（15μg/kg/min）、恢复基线值、输注P188（460 mg/kg）和第二次输注多巴酚丁胺后进行测量。在进行血液动力学研究的同时，放置了一根肺动脉导管，通过观察肺动脉压力描记来验证其位置。还植入了一个不锈钢血管接入口（VAP；CP4AC-5IS-SS，access Technologies）。VAP植入肩胛骨脊柱尾部约5 cm处，距离背中线约10 cm处。将22号直角Huber针引入VAP，并用2-0 Prolene固定。将一根5根法式硅胶导管经皮下穿刺至颈部切口。血液动力学方案完成后，将10%氯化钠直接注入肺循环，以校准电导体积。取下肺动脉导管后，将连接VAP的肝素冲洗导管引入颈静脉，使其尖端靠近右心房。血流动力学方案完成后，修复颈动脉，关闭所有皮肤切口，让动物恢复。平均诱导拔管时间约为6小时。一旦完全康复，动物就会被放在保护VAP现场的贴身夹克（Lomir Biomedical）中。

慢性输液方案。

将门诊输液泵（Ambit，Sorenson Medical）插入夹克口袋，将500毫升静脉输液袋放入第二个口袋。总的来说，导管架、泵和一整袋液体的重量略大于1公斤（体重的6%–9%）。VAP植入后第二天早上开始进行盐水输注，持续7天，此时采集基线血样，P188治疗组的狗开始接受P188输注。BASF提供了国家处方级P188。

肌细胞分离。

在结束血液动力学研究后，用过量巴比妥对动物实施安乐死，通过侧开胸迅速打开胸部，取出心脏并放入冰镇克雷布斯溶液中。将心肌切片切成5 mm的立方体，并在含有标称钙、2型胶原酶（250–300 U/ml；沃辛顿生化公司）和透明质酸酶（250-500 U/ml，H3506，Sigma-Aldrich）的溶液中消化。在初步消化后，轻轻研磨心脏切片，以进一步分散分离的细胞。逐步重新引入钙；然后利用耐钙心肌细胞。将心肌的其他代表性部分置于福尔马林中，并包埋在石蜡中进行切片。

图像采集和分析。

切片组织的图像是在倒置的Axio Observer Z-1上获得的，该Z-1带有机动舞台（蔡司）。蒙太奇图像由AxioVision软件（蔡司）收集并缝合。使用MatLab（R2008a，MathWorks），通过定制的边缘检测程序分析合成图像。

蛋白质印迹。

如前所述，制备KCl洗涤的粗微粒体(24,53). 使用4%-20%梯度（Bio-Rad）通过SDS-PAGE分离膜蛋白（20μg）。然后通过Towbin等人的程序将蛋白质转移到硝化纤维(54). 使用1:1000的多克隆抗肌营养不良蛋白（Abcam）或单克隆抗营养不良素（MANCHO3；DSHB）检测转移蛋白。G.E.Morris开发的MANCHO3(55)来自美国国家儿童健康与人类发展研究所赞助开发的发育研究杂交瘤库，由爱荷华大学生物系维护。通过Odyssey扫描仪（LiCor）定量条带强度，并且二级抗体是与Alexa Fluor 680（Invitrogen）或IRDye 800（Rockland Immunocchemicals）缀合的山羊抗小鼠IgG。

这项研究得到了国家卫生研究院和根除杜兴基金会向J.M.Metzger和MDA向D.Townsend提供的资金支持。我们感谢埃里克·德瓦尼（Eric Devaney）在制定手术程序方面提供的帮助；约翰·康奈特提供统计援助；Guadalupe Guerrero-Serna技术援助；Janet和Dan Bogan负责GRMD犬的护理和运输；和明尼苏达大学利勒海心脏研究所寻求支持。