制造胚泡：老鼠的经验教训

压实和极化。

早期的卵裂分裂产生了一个八细胞胚胎，随后细胞间的粘附增加，称为致密化，导致所有细胞的形态更加扁平（图​（图1）。1). 这种压实过程对于后来的形态发生事件和三个胚胎谱系的适当分离至关重要。在小鼠中，致密化与粘附物的形成有关，随后与细胞之间的紧密连接有关。E-cadherin是粘附连接的主要成分，在八细胞期局限于细胞与细胞接触的区域(9)以及通过清除钙来破坏E-cadherin介导的细胞粘附²⁺离子或向胚胎培养基中添加E-cadherin特异性抗体，抑制压实(10–12). E-钙粘蛋白-敲除胚胎在八细胞期正常压实，因为存在从卵子遗传的E-钙粘蛋白，但它们无法保持适当的细胞粘附到胚泡期(7,8). 相反，缺乏E-cadherin母体供应的胚胎在八细胞期不能致密化，但它们可以通过父系等位基因的合子表达挽救，并在16细胞期致密化(13).

目前尚不清楚压实过程是如何启动的。E-cadherin或其胞内结合伙伴α-和β-连环蛋白表达水平的简单增加不能解释这种变化，因为从受精开始，所有这些都存在于小鼠胚胎中(9,14). 事实上，即使mRNA合成从早期的四细胞期开始受阻，也会发生致密化(15)实际上是通过在蛋白质合成抑制剂存在下培养四细胞期胚胎而过早诱导的(16). 这表明，在胚胎达到早期四细胞阶段时，压实所需的所有成分都已合成。值得注意的是，用激活PKC的小分子培养胚胎也会导致过早致密化(17,18). 这表明翻译后机制在诱导致密化中起着重要作用，可能是通过保持E-cadherin复合体处于非活性状态，尽管这可能是如何发生的尚待阐明。为了支持这一理论，E-cadherin和β-catenin在压实时都被磷酸化(19,20). Rho家族GTPases也在这一过程中发挥作用(21,22). 在培养细胞中，含有IQ基序的GTPase激活蛋白1（IQGAP1）可以通过阻止α-连环蛋白与β-连环素和E-cadherin的结合，破坏钙粘蛋白/连环蛋白复合物，直到其被Rho家族GTPases Rac1和Cdc42结合并失活(23). 紧实前后IQGAP1和Rac1蛋白亚细胞分布的变化表明，植入前小鼠胚胎中也存在类似的关系(22). 这导致了这样一种假设，即IQGAP1可以防止过早压实，直到激活Rac1和Cdc42的八世纪阶段，尽管这还没有经过实验测试(24).

在致密化之前，胚泡没有显示出任何细胞内极性的迹象，但在这一阶段，随着细胞粘附力的增加，所有细胞沿着垂直于细胞接触的轴迅速极化，使得外向（顶端）区域与内向（基底外侧）区域不同（图​（图2）。2). 细胞质重组：细胞核基外侧移动(25)而先前随机分布的内体则位于顶端(26). 肌动蛋白像大多数微管一样在顶部聚集，尽管少数更稳定的乙酰化微管在基底外侧局限(27,28). 压实前均匀分布在细胞表面的微绒毛在顶端堆积，并几乎完全被基底侧消除(29). 与其他极化细胞类型一样，膜蛋白ezrin(30)、极性蛋白Par3和Par6(31,32)和非典型PKC（aPKC）(33)所有这些都定位于顶端结构域，而极性蛋白Par1和致死性巨幼虫同源物（Lgl）则在基外侧积累(32).

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图2

小鼠植入前胚胎的极性。

(A类)在八世纪阶段，所有卵裂球沿细胞接触轴极化，形成外向、顶端结构域和向内的基底外侧结构域。(B类)当胚胎从8个细胞生长到16个细胞时，平行于内外轴分裂的卵裂球产生两个外侧极性细胞。垂直于内外轴分裂的胚泡产生一个外极子细胞和一个内非极子细胞。这会产生两种细胞群：极性细胞外群和非极性细胞内群。当胚胎从16个细胞生长到32个细胞时，这两种类型的细胞分裂也会发生。

目前尚不清楚极化是如何在八世纪阶段从头开始的。基于致密化和极化之间紧密的时间联系，一种假设是细胞接触对建立顶端和基底外侧结构域具有某种重要意义。多项研究表明，细胞间的相互作用与极性方向的确定有关，因为极点往往形成在尽可能远离细胞接触位置的位置(34,35). 然而，在与细胞接触隔离或不能紧密结合的卵裂球中可能发生极化，尽管其频率比平时低(36,37). 因此，细胞接触似乎是极性形成的部分原因，但还涉及其他机制，其中之一依赖于核-微管-皮层的相互作用(32,36). 无论极性是如何建立的，它很可能像在其他系统中一样，通过包含各种PAR蛋白、aPKC和Lgl的顶端和基底蛋白复合物的相互拮抗而维持(38).

对称细胞分裂与非对称细胞分裂直至32细胞期。

一旦八个细胞的胚胎压实并极化，它将经历两轮进一步的分裂，从八个细胞生长到16个，从16个细胞生长至32个。在这些分裂过程中，极化状态的遗传受到卵裂球卵裂平面方向的影响（图​（图2）。2). 如果一个细胞以垂直于其极性轴（即平行于其内外轴）的角度进行有丝分裂，则其两个子细胞都将是极性的，并将保持在胚胎的外部。然而，细胞也可以平行于其极性轴分裂，产生一个极化的外部子细胞和一个位于胚胎内部的非极性细胞(39,40). 通过这种方式，先前由均匀细胞群组成的植入前胚胎现在产生了两组独立的细胞：无极细胞内的细胞和极性细胞外的细胞。细胞极性和细胞位置在定义这两个种群时都很重要，因为通过实验操纵胚胎中细胞的位置可以改变其极性(41–43)而改变电池的极性反过来又会影响其位置(31). 从32细胞期开始，这两个细胞群体具有不同的发育命运：胚胎外部的细胞有助于TE谱系，而内部细胞则有助于内细胞团（ICM），这组细胞进一步分化为EPI和PE谱系（见下文）。

除小鼠外，哺乳动物物种的致密化、极化和不对称分裂过程尚未得到很好的研究。对体外发育的人类植入前胚胎的研究表明，它们的发育在大体形态上与小鼠胚胎的发育非常相似。一个值得注意的例外是观察到，在人类胚胎中，致密化通常发生在比小鼠晚的16细胞阶段(44–46)尽管也有报道称，在一些胚胎的4至8世纪阶段，它开始得更早(47). 目前尚不清楚压实的不同时间如何影响人类胚胎中的极化和不对称细胞分裂。

转录因子控制TE/ICM分离。

TE和ICM谱系分离受少数转录因子控制。具体来说，TE发育需要Cdx2，而多能性标记八聚体3/4（Oct4）、Nanog和含有基因2的SRY-box（Sox2）参与了ICM命运的确定。在鼠标中，Cdx2从八细胞期开始，在所有胚泡中都有不同程度的表达，但在胚泡形成之前，它仅限于外部的、未来的TE细胞（图​（图1）1) (72,73). 八细胞期单个卵裂球之间Cdx2水平的这种差异可能是导致这一阶段卵裂分裂的顺序和方向不同的结果(71). 胚胎缺失Cdx2最初确实会形成囊胚，但这些胚胎中的TE失去其上皮完整性，无法进一步分化，导致植入时死亡(74).10月4日,纳克、和Sox2系统表达模式与Cdx2-它们最初也无处不在，但在胚泡形成后局限于内部未来的ICM细胞(75–78).Cdx2之前受到空间限制10月4日,纳克、和Sox2系统这表明可能需要下调外部细胞中的这三种转录因子。为了支持这一观点，10月4日和纳克未能被适当限制Cdx2^–/–胚胎，在胚泡期外周细胞中表达(74). 在它们建立后，这些表达模式被后来的相互抑制所加强Cdx210月4日，Nanog和Sox2(79,80)，伴随着10月4日和Cdx2(81,82).

因此，TE和ICM血统的建立始于对Cdx2在细胞外，随后它下调10月4日,纳克、和Sox2系统在这些相同的细胞中。是什么导致了Cdx2? 答案似乎在于最近发现的与TE规范有关的另外两个转录因子，即TEA结构域家族成员4（Tead4）(83,84)和Yes相关蛋白1（Yap1；本文称为Yap）(85).Tead4公司^–/–胚胎表现出比Cdx2^–/–胚胎不能形成任何囊胚腔，并且不表达Cdx2。这表明Tead4公司作用于的上游Cdx2在TE规范中。然而，Tead4不能单独行动；它需要作为转录激活物的Yap的额外存在来诱导Cdx2表达式(85). 尽管Tead4蛋白在胚胎的所有细胞中分布相似(83)，Yap仅定位于外细胞的细胞核；它被磷酸化，从八世纪后开始被排除在细胞内的细胞核之外(85). 因此，在外部细胞中，Yap和Tead4可以协同激活Cdx2表达，但在细胞核中不存在Yap的内部细胞中，Tead4是不活跃的Cdx2表达式被静默。

PE/EPI规范的转录因子控制。

两种转录因子，紧密相关的Gata家族成员Gata4和Gata6，已被证明对小鼠PE谱系的规范化很重要。在小鼠胚胎中，任何一种的突变Gata4型或Gata6公司，PE确实形成，但后来的PE衍生物，内脏内胚层，却没有形成(97,98). 这些胚胎形成PE的能力可能是由于Gata4和Gata6之间的某些功能冗余或母体Gata蛋白的持久性。在由任何一种材料制成的胚状体中Gata4公司^–/–或Gata6公司^–/–ES细胞、PE-like细胞无法在外表面形成(98,99). 最后，当ICM的细胞被注入一种显性负性形式的Gata6时，与野生型情况相比，它们对PE的贡献要小得多(96). 相反，任何一种基因的过表达都足以将ES细胞转化为PE细胞(100)和过度表达Gata6公司使ICM细胞在以下情况下对PE做出更大贡献Wnt9A（重量9A）在相同的细胞中也过度表达(96). 在EPI谱系中，一个重要的转录因子是多能促进蛋白Nanog。最初认为纳克^–/–小鼠胚胎缺乏EPI，但能够形成PE(77). 最近的研究表明，这些突变体实际上缺乏EPI和PE，但观察到它们含有少量Gata4阳性细胞，这导致了这样一种假设，即PE最初确实形成，但如果没有相邻EPI的支持，PE就无法生存，而相邻EPI根本就不会形成(101). 因此，看起来Gata4公司和Gata6公司要求促进PE命运并抑制EPI命运，而相反纳克.

在E3.5的小鼠ICM中，大约对应于32细胞期Gata6公司和纳克表达是互斥的，因此大多数细胞表达Gata6公司或纳克但很少表达两者（图​（图4）4) (95,102). 这与大多数细胞在这个阶段致力于一个或另一个谱系的想法是一致的。值得注意的是，这两个转录因子以随机的“盐和胡椒”模式表达，似乎与细胞位置无关，这表明细胞可能倾向于EPI或PE命运，然后将其分类到适当的位置。

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图4

小鼠胚胎EPI/PE分离模型。

(A类)在位置依赖模型中，E3.5处的小鼠ICM由均匀的双电位细胞群组成，并且那些位于ICM外表面的细胞由于某种形式的位置信息而变成PE。(B类)在Fgf/MAPK依赖模型中，ICM细胞最初是双电位的，但Fgf信号的差异导致它们成为纳克-或Gata6公司-E3.5为阳性。这些细胞在ICM中随机分布，细胞分选与凋亡相结合导致E4.5形成有组织的PE和EPI层。

最近的工作为我们理解PE/EPI分离提供了更多细节。首先，在小鼠中E3.5之前，ICM的许多细胞似乎同时表达纳克和Gata6公司随着ICM的成熟，逐渐将其表达限制在一种或另一种转录因子上(102). 转录因子表达的这种变化可能反映了ICM细胞对PE或EPI命运的承诺。表达第二个PE标记Pdgfrα的细胞的时间推移成像表明，在囊胚早期开始于ICM内部的PE细胞经历了大量运动，到囊胚晚期结束于PE细胞的外单层(102). 此外，在囊胚晚期未正确分类到PE单层的Pdgfrα表达细胞发生凋亡(102). 另一组研究表明，除了将内部细胞移动到外部位置外，细胞还可以从ICM的外表面移动到内部位置(96). 这种细胞分类可能依赖于PE和EPI细胞粘附特性的差异，尽管相关分子尚未确定。最后，虽然预先提交细胞的分类可能在PE和EPI的分离中起主要作用，但ICM发育的计算机模型表明，正如最初假设的那样，位置诱导也可能在这一过程中起作用(96).

我们感谢Peter Rugg-Gunn对手稿的批判性阅读。罗桑特实验室的工作得到了加拿大卫生研究院的支持。