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《美国病理学杂志》。2010年4月；176(4): 1600–1606.
数字对象标识：10.2353/ajpath.2010.090406
预防性维修识别码：项目经理2843451
PMID：20150433

阿尔茨海默病患者脑内皮细胞合成神经毒性凝血酶

尹香玲,吉尔·赖特,特雷弗墙、和保拉·格拉马斯
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

阿尔茨海默病（AD）的特征是神经元死亡；因此，确定神经毒性蛋白及其来源是理解和治疗AD的核心。多功能蛋白酶凝血酶具有神经毒性，存在于AD老年斑块中。本研究的目的是确定大脑内皮细胞是否能够合成凝血酶，从而成为AD大脑中这种神经毒素的来源。从AD患者大脑和年龄匹配的对照组中分离出微血管。逆转录-PCR显示，凝血酶信息在AD脑微血管中高度表达，但在对照血管中未检测到。同样，微血管的Western blot分析表明，凝血酶蛋白在AD衍生微血管中高表达，但在对照衍生微血管内不表达。此外，从AD患者而非对照组患者获得的脑脊液中检测到高水平的凝血酶，并且AD大脑切片显示出对血管壁中凝血酶抗体的反应性，但在对照组的血管中没有。最后，我们检测了培养的脑内皮细胞合成凝血酶的能力，并表明氧化应激或细胞信号干扰导致这些细胞中凝血酶mRNA的表达增加。研究结果首次证明，脑内皮细胞可以合成凝血酶，并表明以血管稳定为靶点的新型治疗方法可以预防或减少凝血酶的释放，这可能被证明对治疗这种神经退行性疾病有用。

尽管阿尔茨海默病（AD）传统上被归类为无脑血管病变的神经退行性痴呆，但目前的流行病学、病理学、实验和影像学研究表明，这种分类已不再成立。1,2许多血管危险因素，如高血压、高胆固醇血症、肥胖、同型半胱氨酸血症、载脂蛋白E4基因型和糖尿病，已被证明会增加AD的风险。三,4,5,6,7,8,9人类和动物模型的脑成像研究的最新数据表明，脑血管功能障碍可能先于AD和AD模型的认知功能下降和神经退行性改变。10内皮细胞对功能失调状态的表型调节被认为是动脉粥样硬化等心血管疾病的发病机制之一。11内皮功能障碍也越来越多地与AD等神经退行性疾病的发展有关。12,13,14,15

激活的内皮细胞阐述粘附分子、细胞因子和趋化因子、生长因子、血管活性分子、主要组织相容性复合物分子、促凝血和抗凝部分，以及具有生物活性的各种其他基因产物。16活化的内皮细胞通过产生至少20种作用于邻近细胞的旁分泌因子发挥直接的局部作用。17中枢神经系统微血管内皮细胞的扰动与多种神经炎症、神经感染和神经退行性疾病状态的病理生理学密切相关，包括多发性硬化、艾滋病毒相关脑病和AD。18由于内皮细胞高度合成，产生多种可溶性因子，因此受损/改变的脑内皮细胞可能释放对神经元有害或有毒的因子。这与以神经细胞死亡为特征的AD等疾病特别相关。在这方面，我们实验室的工作为以下观点提供了支持：在AD中，大脑微血管发生生化改变，功能紊乱，并且有丰富的可溶性因子，这些可溶性因子会影响大脑中的神经元和其他细胞。12我们已经证明，AD脑微血管中释放出许多炎症和/或神经毒性蛋白，包括肿瘤坏死因子α、转化生长因子-β、白细胞介素（IL）IL-1β、IL-6、IL-8、基质金属蛋白酶和凝血酶。19,20,21

多功能蛋白凝血酶的血管释放与AD特别相关，因为凝血酶已被证明具有神经毒性在体外和体内原代神经元培养物或神经元细胞系暴露于凝血酶会导致显著的细胞凋亡。22在AD的老年斑块中有凝血酶积聚的记录。23此外，神经元暴露于高凝血酶水平的创伤性脑损伤与AD发病率增加有关。24,25一些神经系统疾病，如AD和帕金森氏病，其特点是凝血酶和凝血酶受体蛋白酶激活受体（PAR）-1水平升高。26,27受体PAR-1的激活或过度表达已被证明可诱导运动神经元变性。28我们以前曾发表过将凝血酶直接注入大鼠大脑会导致神经细胞死亡、胶质瘢痕形成和认知缺陷。29

脑内皮细胞能否合成凝血酶尚未见报道。我们已经证明AD中的脑微血管释放凝血酶，30但这可能反映了隔离的凝血酶的释放，因为内皮细胞可以很容易地结合和内化凝血酶。同样，我们已经报道了培养的脑内皮细胞在应激条件下释放凝血酶31; 但这是否涉及合成或释放尚不清楚。

本研究的目的是确定大脑内皮细胞是否能够合成凝血酶，以及血管系统是否是AD大脑中这种神经毒素的来源。

材料和方法

大鼠脑内皮细胞的培养与治疗

如前所述，从大鼠脑微血管中获得大鼠脑内皮细胞。32使用内皮细胞表面抗原因子VIII抗体确认这些培养物的内皮特性。本研究中使用的内皮细胞（第8代至第12代）保存在添加了10%胎牛血清、1%谷氨酰胺和1%抗生素的Dulbecco改良Eagle's培养基中，并将其置于5%湿化CO中237°C培养箱。对于实验，将大鼠内皮细胞以每孔300000个细胞的密度铺板到6孔板上。细胞用Hanks平衡盐溶液洗涤三次，培养基改为无血清Dulbecco改良Eagle培养基加0.1%牛血清白蛋白。用含100μmol/L H的无血清培养基处理内皮细胞培养物2O（运行）2或含有1μmol/L蛋白激酶C（PKC）抑制剂双吲哚马来酰亚胺的培养基24小时。

人微血管分离与人脑脊液

大脑取自AD患者（69.6±5.5岁）和年龄匹配的对照组（69.8±3.61岁）。从对照组（尸检时间：14.5、14、14、20、19；15.4±2.02小时）和AD（9、10、21、12、15；13.4±2.16小时）尸检标本的右侧大脑半球分离出微血管，并在使用前储存在−80°C下。对左大脑半球进行组织学处理，以进行诊断和形态计量学研究，用于临床诊断原发性退行性AD痴呆。按照美国国立卫生研究院神经病理学小组的建议，对每个病例进行了神经炎斑块和神经纤维缠结的检查，每个病例都符合AD的严格形态计量标准。33,34此外，还收集了来自年龄匹配但没有神经病理学证据和类似尸检间隔的患者的对照样本。正如我们之前描述的那样，从颞叶、顶叶和额叶皮层的集合中分离出微血管。35简单地说，脑微血管通过210μm筛过滤，并收集在53μm筛上，再悬浮在含有10%胎牛血清和二甲基亚砜的Dulbecco改良Eagle's培养基中，并在液氮中冷冻保存，直至使用。这一过程从15克人类皮层中产生约6至10毫克微血管蛋白。从每个人脑中分离出单独的微血管制剂。微血管制剂以前的特点是大部分是毛细血管（>85%），相对来说没有非血管污染物。微血管制剂的纯度通过相差显微镜进行评估。AD-衍生血管和对照衍生血管的分离血管制剂的形态具有可比性。

将冷冻脑脊液（CSF）快速溶解，与样品缓冲液（25 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8,1%十二烷基硫酸钠，10%甘油，2%β-巯基乙醇和0.02%溴酚蓝）混合，并按照Western blot部分所述进行处理。

逆转录PCR

根据制造商协议，使用TRI试剂RT（俄亥俄州辛辛那提市分子研究中心公司）从培养的大鼠脑内皮细胞和分离的人类微血管中制备RNA。对于逆转录（RT）-PCR协议（德国罗氏应用科学公司），使用随机六聚体引物逆转录4μg总RNA，使用RT-PCR反应中的3μl cDNA进行PCR反应。PCR条件为：95°C 15分钟，94°C 38次循环30秒，57°C 30秒，72°C 60秒，最后在72°C下延长10分钟。β-肌动蛋白和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内部标记物。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中通过电泳分离，并在紫外光下检测。人类凝血酶PCR产物由德克萨斯理工大学核心设施测序，并通过NCBI BLAST比对进行确认。PCR的特定基因引物如所示表1.

表1

RT-PCR用底漆

基因RefSeq加入顺序放大器
人类
 凝血酶NM_000506号前5′-GAGTGCCACTATGGAG-3′388个基点
版次5′-GCTGCACAGCTGAGTTGAAG-3′
 GAPDH公司NM_002046号前5′-GAGTCACGGATTGTGT-3′288个基点
版次5′-TTGATTTGGAGGGATCTCG-3′
老鼠
 凝血酶NM_022924号前部5′-TGGGAGAGAGACCATGAC-3′339个碱基
版次5′-AGGGTGGTACAGAATGAG-3′
 β-肌动蛋白NM_031144号前5′-TGTCACCAACTGGGACGATA-3′391个基点
版次5′-TCTCAGCTGTGGTGGTGAAG-3′

西部印记

使用含有150 mmol/L氯化钠、50 mmol/L-Tris、1%NP-40和2 mmol/L-苯甲基磺酰氟的裂解缓冲液从人类微血管中提取蛋白质。也使用了没有宏观血液污染的脑脊液。将蛋白质样品与样品缓冲液（25 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8，1%SDS，10%甘油，2%β-巯基乙醇和0.02%溴酚蓝）混合煮沸5分钟，在10%SDS-聚丙烯酰胺电泳微凝胶中溶解并转移到聚偏二氟乙烯膜。转移后，将膜在室温下封闭在含有0.25%吐温-20（TBST）和4%脱脂奶粉的Tris缓冲盐水中2小时，随后与凝血酶（1:200，分类号：HYB 109–04，Antibody Shop，Denmark）、GAPDH（1:1000，分类号：MAB374，Millipore，Billerica，MA）、，或人血清白蛋白（1:2500，分类号：ab10241，Abcam，Cambridge，MA），用TBST加2%脱脂奶粉在4°C下稀释过夜。使用与辣根过氧化物酶结合的山羊抗鼠IgG检测结合抗体（分类号：170-6516，加利福尼亚州Hercules Bio-Rad实验室），并用化学发光法进行开发。

脑组织切片的免疫定位

如前所述，对人脑组织切片进行免疫定位处理。36脑组织切片（5μm）在冰镇丙酮中固定30分钟，在室温丙酮中固定10分钟，然后在TBST中清洗，并在室温下用10%驴血清在TBS中封闭2小时。切片在4°C下与一级抗体孵育过夜：亲和纯化的山羊多克隆凝血酶抗体（1:50，分类号：Sc-16972，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）或兔抗Von Willebrand因子多克隆（1:500，分类号为ab6994，Abcam），在含有2.5%驴血清的TBS中于4°C过夜。然后在TBST中清洗切片，在室温下用0.3%过氧化氢酶封闭溶液培养15分钟，在TBST内清洗并用二级抗体（1:400，Alexa Fluor 488驴抗羊IgG（H+L），Cat）培养。编号：A-11055；Alexa Flour 546驴抗兔IgG，猫。编号A-10040；Invitrogen，Carlsbad，CA）在室温下放置1小时并清洗。为了观察细胞核，在室温下用IHC-Tek DAPI溶液（目录号：IW-1404，IHC World，Woodstock，MD）培养切片25分钟，并使用奥林巴斯IX71 Meta Imaging系列7.1显微镜观察。

结果

用无血清培养基、H2O（运行）2或蛋白酶抑制剂双吲哚马来酰亚胺（1μmol/L）24小时。收集细胞，分离mRNA，并使用大鼠凝血酶引物进行RT-PCR（表1）数据表明，未经处理的内皮细胞在培养物中表达基本水平的凝血酶（图1）.用H治疗2O（运行）2或PKC抑制剂导致(P（P）<0.01）凝血酶RNA表达增加（图1）.

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将培养的大鼠脑内皮细胞暴露于含有0.1%牛血清白蛋白（对照）的无血清培养基和100μmol/L H2O（运行）2或培养基加1μmol/L PKC抑制剂双吲哚马来酰亚胺（BIM）24小时。提取RNA，逆转录，并使用大鼠凝血酶和看家基因β-actin的特异性引物进行扩增。条带的强度图示于RT-PCR条带下方。实验进行了三次，并显示了具有代表性的RT-PCR**P（P）与对照组相比<0.01。

通过Western blot和RT-PCR分别分析从AD脑和年龄匹配的非强化对照组分离的微血管凝血酶蛋白和信息的表达。四个对照组和四个AD脑的蛋白质印迹（图2A）结果表明，凝血酶蛋白在AD微血管中高度表达，而在对照组中几乎检测不到。同样，RT-PCR分析显示凝血酶在AD微血管中有稳定表达，而在对照血管中没有检测到表达（图2B）我们还通过Western blot检测了患者脑脊液中凝血酶的存在，发现AD患者的脑脊液样本中表达凝血酶，而对照脑的脑脊膜样本中未检测到凝血酶（图2C）.使用GAPDH或白蛋白监测所有样品的装载当量（图2）.

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答：通过SDS-PAGE分离来自对照（C）和AD衍生的微血管裂解物的蛋白质，转移到聚偏二氟乙烯膜上，并对人凝血酶（37kDa）进行免疫印迹。使用GAPDH确认负载等效性；n个= 4.B类：提取对照（C）和AD-衍生微血管的RNA，逆转录，并使用人类凝血酶和看家基因GAPDH的特异性引物进行扩增；n个= 4.抄送：通过SDS-PAGE分离来自对照组（C）和AD-衍生脑脊液的蛋白质，转移到聚偏二氟乙烯膜上，并对人类凝血酶（37kDa）进行免疫印迹。使用白蛋白确认负载等效性；n个= 4.

用免疫荧光法检测AD和对照脑切片中是否存在内皮细胞标记物Von Willebrand因子和凝血酶（图3）两种AD的血管均显示Von Willebrand因子染色（图3B）和控制（图3F）组织。此外，核的4,6-二氨基-2-苯基吲哚染色在两种AD中具有可比性（图3C）和控制（图3G）部分。相反，绿色免疫荧光的存在表明血管壁对凝血酶抗体的反应性在AD中大量表达（图3A）但在控制中几乎检测不到（图3E）部分。类似地，血管的黄/白染色反映了Von Willebrand和凝血酶染色的合并图像，在AD切片中强烈存在（图3D）但在控制中无法识别（图3H）.

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阿尔茨海默病(A类–D类)和控制(E类–H（H）)用免疫荧光法检测脑切片中是否存在内皮细胞标记物Von Willebrand因子和凝血酶（×20）。4,6-二脒基-2-苯基吲哚染色在两种AD的细胞核中具有可比性(C类)和控制(G公司)部分。Von Willebrand因子染色在两种AD中都可以检测到(B类)和控制(F类)组织。相反，AD患者对凝血酶抗体（绿色免疫荧光）的反应明显(A类)但在控制中几乎检测不到(E类)船只。类似地，黄色/白色免疫荧光在AD切片中表现强烈，反映了Von Willebrand和凝血酶染色的合并图像(D类)但在控制中无法识别(H（H）). 比例尺=15μm。

讨论

阿尔茨海默病以神经元死亡为特征；因此，确定神经毒性蛋白及其来源对于理解和治疗这种疾病至关重要。多功能蛋白酶凝血酶似乎参与了创伤性脑损伤和中风后的神经退行性过程。26虽然凝血酶是一种蛋白酶，但其非蛋白水解功能已被很好地描述。28,37,38凝血酶通过切割和激活G蛋白偶联蛋白酶激活受体（PARs 1至4）来调节细胞信号传导，以揭开栓系受体触发配体的面纱。凝血酶激活PAR可根据激动剂的振幅和持续时间介导脑内细胞死亡或存活；高凝血酶水平触发细胞凋亡。22,37在目前的研究中，我们发现，在AD大脑中，凝血酶在脑脊液和脑微血管中升高，但在年龄匹配的对照大脑中没有升高。我们的数据表明，脑内皮细胞可以合成凝血酶，因此可能是迄今为止尚未被识别的这种神经毒性蛋白的来源。我们的结果与主要脑凝血酶抑制剂蛋白酶连接蛋白-1在AD脑血管周围的免疫反应性显著降低的观察结果相一致，表明血管释放凝血酶。39

阿尔茨海默病的特点是活性凝血酶和PAR-1水平增加，这表明凝血酶及其受体参与了正在进行的神经退行性过程。26,27凝血酶是一种与AD相关的神经毒素，因为它可以影响导致神经细胞死亡的多种机制。凝血酶可以通过激活细胞周期途径直接损伤神经元，从而引发神经元细胞凋亡。40凝血酶还可通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶介导的氧化应激诱导神经毒性。41凝血酶可通过激活胶质细胞间接导致神经细胞死亡，进而增加氧化应激和神经炎症。42,43,44凝血酶可增加脑内载脂蛋白E水平，载脂蛋白E的22-kDa N末端凝血酶裂解片段可诱发潜在的神经毒性，45因此，凝血酶也可以通过作用于载脂蛋白E蛋白而导致神经细胞损伤和死亡。

凝血酶也可能通过与aβ的相互作用在AD发病机制中发挥作用。血小板中Aβ的释放受凝血酶调节。46凝血酶在体外可以刺激淀粉样前体蛋白（APP）的产生，并将APP裂解为AD大脑淀粉样斑块中的片段。47,48在内皮细胞中，凝血酶通过PKC依赖机制诱导APP的表面表达和细胞内分泌。48用凝血酶处理培养的大鼠海马神经元会导致aβ的剂量依赖性增加和APP的重新分布。49此外，在这些培养物中，Aβ的毒性通过与凝血酶共孵育而显著增强，并通过与凝血酶抑制剂蛋白酶nexin-1孵育而减弱。Aβ诱导细胞内钙和过氧化物的增加，凝血酶和减少的蛋白酶nexin-1增强了这种增加。49最后，因为Aβ导致内皮细胞中炎症基因和蛋白的表达50炎症蛋白增加内皮细胞凝血酶的表达，31血管系统可能是这两种神经毒性蛋白相互作用的重要纽带。

凝血酶对微管相关蛋白tau（神经纤维缠结的主要成分）的蛋白水解过程也很重要。51纳米摩尔浓度的凝血酶通过PAR在小鼠海马神经元中诱导快速tau过度磷酸化和聚集，随后是延迟的突触素减少和神经元凋亡。52通过蛋白酶激活的受体4持续的凝血酶信号传导和下游p44/42丝裂原激活的蛋白激酶激活延长似乎介导了这种效应。凝血酶可能是有助于AD脑中形成高磷酸化、不溶性τ的过程。

血管源性凝血酶可能是AD脑内事件的关键调节器，因为它能够调节其他炎症和生物活性蛋白的表达。在这方面，凝血酶引起内皮细胞活化，并增强许多促炎蛋白的表达和/或释放，包括单核细胞趋化蛋白-1、细胞间粘附分子-1、IL-1、IL-6和IL-853,54,55,56,57; 这些炎症蛋白在AD的脑微血管中均上调。19,20,21此外，凝血酶和基质金属蛋白酶-9在AD脑血管中均升高。血管系统中多种因子的合成和释放表明，这些蛋白质可能协同作用，并产生局部强烈的神经毒性损伤。结果表明在体外神经毒性以及体内当凝血酶或基质金属蛋白酶-9同时存在时，两者引起的脑出血细胞死亡显著增加。58我们证明内皮细胞可以产生凝血酶，数据表明脑内皮细胞具有功能活性凝血酶（PAR-1和PAR-3）受体59提示凝血酶可能作为一种自分泌因子，刺激有害的前馈循环。此外，内皮细胞释放的凝血酶的旁分泌作用也很重要，因为凝血酶能够激活其他中枢神经系统细胞，如小胶质细胞和星形胶质细胞。

小胶质细胞、星形胶质细胞和微血管内皮细胞在神经组织中共存，它们在健康中的稳态相互作用以及对损伤的协调反应，导致了这样一个概念，即它们构成了功能性“神经血管单元”的基本元素60因此，一种细胞类型的分泌产物会深刻影响相邻细胞的行为。凝血酶对小胶质细胞和星形胶质细胞的促炎作用已被证实。黑质内注射凝血酶通过凝血酶诱导的小胶质细胞活化和一氧化氮释放损伤黑质多巴胺能神经元。42凝血酶已被证明可以刺激JAK2-STAT3信号通路，并增加小胶质细胞中炎症相关基因肿瘤坏死因子α和诱导型一氧化氮合酶的转录。43在星形胶质细胞中，凝血酶激活PAR-1通过调节Erk1/2导致基质金属蛋白酶-9表达增加。44因此，血管源性凝血酶可能通过激活小胶质细胞和星形胶质细胞直接损伤神经元或间接影响神经元活性。

导致脑内皮细胞产生凝血酶的病理生理信号是什么？我们的数据表明，在培养过程中，暴露于氧化应激源H均可诱导应激2O（运行）2或通过抑制PKC导致内皮细胞产生凝血酶。氧化应激和血管信号级联的扰动与AD相关。

大量证据表明，氧化应激是导致AD的复杂事件链中的重要触发因素。61,62在AD中，包括脂质、DNA和蛋白质氧化在内的一长串氧化应激替代标记物升高。63,64AD患者的脑微血管释放高水平的活性氧和一氧化氮，并表达高水平的氧化蛋白。65缺氧和氧化应激是相互关联的过程，两者都有助于AD发病。66当缺氧损伤时，大脑微血管会释放活性氧。67我们已经表明，AD患者的脑微血管表达较高水平的转录因子低氧诱导因子1-α。30有趣的是，用凝血酶处理培养的脑内皮细胞会导致低氧诱导因子1-α的表达增加。30

关于PKC，我们之前已经记录了脑微血管中信号通路的异常，包括AD中PKC活性的明显抑制。68目前的数据表明，由活性氧引起的广泛细胞应激或特定信号机制的扰动都会导致内皮细胞的病理性激活和凝血酶的产生。脑中的凝血酶可能对创伤性脑损伤具有严重危害，其中大量通过被破坏的血脑屏障进入大脑。另外，在神经退行性疾病中，如AD凝血酶及其引发的级联介质，可能会长期有害，导致数年内神经元损伤死亡。对脑内皮细胞作为神经毒素凝血酶来源的鉴定表明，以血管稳定为靶点的新疗法可以防止或减少凝血酶的释放，这可能被证明对治疗这种神经退行性疾病有用。

致谢

我们感谢Terri Stahl的秘书协助和Janet Dertien的技术协助。

脚注

向德克萨斯理工大学健康科学中心加里森老龄研究所Paula Grammas博士提出转载请求4第个德克萨斯州卢伯克街9424号，邮编79430。电子邮件：ude.cshutt@sammarg.aluap.

部分由美国国立卫生研究院资助（AG15964、AG020569和AG028367）。人体组织由德克萨斯理工大学健康科学中心加里森老龄脑库研究所、印第安纳大学脑库和哥伦比亚大学纽约脑库提供。CSF由哥伦比亚大学纽约智库提供。格拉马斯博士是雪莉和米尔德丽德·加里森衰老讲座的接受者。

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文章来自美国病理学杂志由以下人员提供美国病理研究学会