树突状细胞靶向HIV gag蛋白疫苗为DNA疫苗提供了帮助，包括动员保护性CD8⁺T细胞

补充蛋白引物-DNA增强疫苗后T细胞提供保护。

为了评估T细胞对保护性免疫的贡献，我们用大鼠IgG对照单克隆抗体或消耗CD4和CD8单克隆抗体治疗小鼠，然后用重组痘苗病毒进行i.n.攻击。我们验证了这些单克隆抗体选择性缺失CD4⁺和CD8⁺CD3（CD3）⁺T细胞。此外，我们发现，用对照单克隆抗体治疗小鼠，不会干扰观察到的补充初免增强疫苗对牛痘呕吐的保护作用(图2A类 左上，深蓝色条）。然而，CD4的缺失⁺或CD8⁺T细胞显著降低了接种DEC-gag初级DNA增强方案的小鼠的保护作用（10-30倍），但没有完全消除保护作用(图2A类，两个右栏）。然后，我们用对照Ig或CD4和CD8单克隆抗体组合对接种过疫苗的小鼠进行治疗(图2B类,左侧和赖特). 两个CD4的耗尽⁺和CD8⁺激发前的T细胞消除了减肥保护(图S1C类和D类)肺病毒滴度增加(图2B类，比较中的深蓝色条左侧和赖特). 因此，对互补初级增强的卓越保护需要CD4和CD4⁺和CD8⁺T细胞。

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图2。

CD4细胞⁺和CD8⁺蛋白-时间DNA-增强疫苗后，T细胞可保护小鼠。(A类)按照x轴和图1在使用重组痘苗病毒进行呼吸道攻击前的−3、−2和−1天，用对照大鼠Ig或消耗CD4或CD8抗体进行治疗（两个实验的平均值）。(B类)如中所示(A类)，用对照大鼠IgG治疗小鼠(左侧)或两个CD4都耗尽⁺和CD8⁺T细胞(赖特)在用痘苗gag攻击和测量痘苗病毒滴度（PFU/肺）之前。

蛋白质启动改善CD8⁺DNA疫苗的T细胞免疫。

为了评估接种DEC靶向gag蛋白引物和gag DNA增强后的T细胞免疫，我们测量了CD4⁺和CD8⁺，在单细胞水平上抑制特异性T细胞。一剂量DNA诱导弱CD4⁺和CD8⁺豁免权(图3A类–C类，红色第二行数据），而两个剂量诱导更强的反应（橙色，第三行数据）。先前的数据表明，一剂DEC靶向gag蛋白疫苗与polyIC一起诱导弱CD4⁺T细胞免疫，而两个剂量导致强大但主要是CD4⁺T细胞免疫(5)（见下文）。在三个实验中，用一剂DC靶向蛋白疫苗而非非靶向对照Ig-gag疫苗启动，可产生强联合CD4⁺和CD8⁺T细胞对单剂DNA疫苗的免疫力(图3A类–C类，比较第四排和第五排，蓝绿色和深蓝色）。CD4产生IFN-γ⁺补充初始增强后的T细胞也显著高于两种剂量的DNA[图3, ** (P（P）< 0.01)]. 对于以两种剂量的DNA或互补性初级增强剂为引物的小鼠，gag-specific CD8⁺T细胞也能增殖成HIV抗体(图3D类, *). 然而，CD4⁺用互补原辅增强法免疫的T细胞的扩增明显好于CD4⁺用两种剂量的DNA免疫T细胞[图3D类，*，开放栏(P（P）< 0.05)]. gag特异性CD4⁺和CD8⁺在两个长期实验中，T细胞在增强后至少持续4个月(图3E类，深蓝色）。因此，补充的主要增强提供了改善和长寿命的CD4⁺和CD8⁺一剂DNA疫苗的T细胞免疫。

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图3。

互补蛋白原DNA增强疫苗诱导联合持久的CD4⁺和CD8⁺T细胞免疫。(A类)内螺纹CxB6 F₁小鼠接种疫苗图1。DNA增强30天后，对大量脾细胞进行T细胞免疫评估。(A类和B类)用未反应肽或HIV gag肽混合物重新刺激脾细胞，6小时后通过CD4细胞内细胞因子染色评估对肽的反应产生IFN-γ⁺(A类)或CD8⁺(B类)CD3（CD3）⁺T细胞。(C类)HIV gag-specific CD8⁺通过结合gag四聚体计数T细胞。(D类)在用gag特异性肽（或非特异性对照肽）重新刺激4天的CFSE标记的脾细胞中，测量HIV gag依赖性T细胞增殖和IFN-γ产生，然后在CFSE低CD4中对IFN-γ进行细胞内染色⁺和CD8⁺T细胞。所有数据均为三个实验的平均值±SD，每个实验涉及五个F₁每组只小鼠。(E类)两个实验的方法，以跟踪120天接种疫苗小鼠免疫反应的寿命。

互补蛋白Prime-DNA Boost可更快速地累积CD8⁺T细胞到感染挑战部位。

因为上述研究没有揭示CD8的主要数量差异⁺两剂量DNA诱导的T细胞（“同源”启动子）与互补启动子相比，我们询问DEC gag疫苗启动子是否提高了CD8的质量⁺通过检测gag特异性CD8的快速性来检测T细胞反应⁺将T细胞动员到感染部位。在接种疫苗120天后的三个实验中，我们用重组痘苗疫苗接种小鼠，然后在4天和7天后检查激发感染部位、肺部以及脾脏。先用DEC-gag p41加polyIC启动，然后用一剂量的DNA增强，CD8的积累更好⁺T细胞到肺部(P（P）=0.05）比一剂或两剂DNA疫苗(图4A类，比较箭头处肺部第4天的数据）。确定gag反应CD8的积累⁺肺部的T细胞对疫苗抗原具有特异性，我们发现当小鼠受到牛痘疫苗gag而非牛痘OVA的攻击时，gag反应细胞会积聚(图4B类). 因此，补充的初次强化免疫接种会导致CD8的更快积累⁺T细胞受到痘苗gag的挑战，这是gag抗原依赖性，而不是痘苗“炎症”或感染依赖性。

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图4。

互补蛋白原DNA增强疫苗可使CD8更快速积累⁺T细胞到达感染挑战部位。如中所示图3，只小鼠接种了疫苗(年axis）和注射致命剂量的牛痘疫苗后90天，在第4天和第7天，分离肺部以计数HIV gag特异性四聚体结合细胞。(A类)特异性CD8的快速积累⁺DC靶向蛋白原-DNA增强疫苗后肺部的T细胞。FACS数据如下图所示图S3.箭头指向快速累积的特定于gag的CD8⁺在接受两剂DNA疫苗或补充原辅疫苗后，小鼠早期（第4天）的T细胞受到攻击。显示了两个实验的平均值。(B类)在HIV gag-疫苗小鼠中，gag特异性CD8⁺当小鼠受到牛痘塞的攻击时，T细胞会积聚(左侧)但不是痘苗-OVA(赖特).

CD4限制性HIV gag肽为HIV gag DNA疫苗提供帮助。

为了测试用DEC gag p41蛋白启动是否可以被先前定义的被启动的CD4识别的gag肽取代⁺T细胞(4)，我们合成了三种肽（C57BL/6池1，肽#6，氨基酸145-159，QAISPRTLNAWVKVV；B6池4，肽#8，氨基酸297-311，VDRFYKTLRAEQASQ；Balb/C池3，肽#10，氨基酸257-271，PVGEIYKRWIILGLN），并用它们来启动和提高CxB6 F₁老鼠。同时，我们用单一肽（GHQAAMQMLKETINE，氨基酸193-207）给小鼠引物，该肽包括一个被gag特异性CD8识别的纳米肽⁺H-2上的T细胞（AMQMLKETI）^d日，以及来自不同蛋白质的CD4限制性肽，来自鼠疫耶尔森菌如前所述(13). 正如预期的那样，这些肽以一种特定的方式启动了小鼠；即，CD4阴性T细胞被引诱至CD8-限制性gag肽(图S2，箭头第二行），而CD4⁺T细胞被选择性地引诱至LcrV或gag CD4限制性肽(图S2，箭头，第三和第四行）。

在三个实验中，我们再次观察到强CD8⁺用DEC-gag p41蛋白疫苗和polyIC启动的小鼠对DNA增强的反应，但不控制Ig-gag p41+polyIC(图5A类; 比较绿松石和深蓝色）。重要的是，当我们用肽取代蛋白疫苗时，只有辅助肽被CD4识别⁺T细胞，而不是gag特异性CD8识别的肽⁺T细胞能够激发出强CD8⁺T细胞对DNA gag疫苗的反应(图5A类，下两行）。因此，启动CD4⁺含有肽的T细胞可以产生更好的CD8⁺T细胞对单剂量DNA疫苗的反应。接下来，评估CD4提供的帮助的特异性⁺T细胞，我们免疫了CxB6 F₁携带HIV gag-或LCRV CD4限制性肽并用上述HIV gag-DNA增强的小鼠。仅gag CD4限制性肽增强CD8⁺T细胞对gag DNA疫苗的反应(P（P）< 0.03) (图5B类; 比较第五行和第六行，**和*）。这表明向CD8提供了帮助⁺T细胞具有同源抗原依赖性。

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图5。

帮助HIV gag肽改善CD8 T细胞对DNA疫苗的反应。CxB6 F的两个实验₁小鼠接种疫苗图2和​和3，三，但我们添加了几组用CD4识别的HIV gag肽引物的小鼠⁺和CD8⁺T细胞或LcrV CD4限制性肽与DEC-gag p41蛋白疫苗的比较(年轴）。DNA疫苗增强30天后，我们检测了HIV gag特异性IFN-γ产生CD4⁺和CD8⁺分泌IFN-γ的T细胞和四聚体结合CD8⁺T细胞。显示了两个实验的平均值。

抗体。

CD3、CD4、CD8α和细胞因子（IFN-γ、IL-2和TNF-α）的抗体购自BD Biosciences-Pharmingen。

融合HIV gag单克隆抗体。

这些是按照描述生成的(4,5). 使用HRP-anti-p24（免疫诊断）的蛋白质印迹来确定gag融合构建体的特异性。利用PE-结合山羊抗鼠IgG（Jackson ImmunoResearch）或FITC-结合抗p24（Coulter KC57-FITC），通过FACS在稳定转染小鼠DEC-205的CHO细胞上验证了mAb结合。在鲎阿米巴细胞裂解物试验（QCL-1000；Cambrex）中，所有单克隆抗体均无内毒素。

免疫接种。

雌性CXB6 F₁小鼠腹腔注射一次融合单抗和polyIC（50μg；Invivogen）作为佐剂。八周后，用10μg HIV gag p41 DNA刺激小鼠。静脉注射100毫克多肽（含或不含聚IC）。最后一次肽注射四周后，用10μg HIV gag p41 DNA增强小鼠。

HIV-特异性免疫T细胞检测。

为了检测HIV gag特异性T细胞反应，用跨越整个gag p41序列的肽重新刺激大量脾细胞(4,5,12)或由HIV gag p17池1组成的阴性未反应对照肽混合物，在2μg/mL抗CD28（克隆37.51）存在下持续6小时，在最后4小时内添加10μg/mL brefeldin a（Sigma-Aldrich）以积累细胞内细胞因子。重叠（交错4 aa）跨越LcrV的15肽(13)和HIV gag p41，即HIV gag p17和HIV gag p24(4)-由蛋白质组资源中心（洛克菲勒大学）合成。将90-member gag p41文库在100%二甲基亚砜中以每种肽1 mg/mL的速度重新悬浮。对于FACS，使用LIVE/dead固定染色试剂盒（Aqua LIVE/DAED；Invitrogen）排除死细胞。阻断Fcγ受体后，在37°C下用CD3-太平洋蓝、CD4-percp、CD8-alexa-750和Aqua LIVE/DEAD染色抗体对细胞进行20分钟染色。细胞在室温下清洗、固定（Cytofix/Cytoperm；BD Biosciences）、用Permwash渗透并用IFN-γ（IFN-γ-alexa-700）、IL-2（IL-2-FITC）和TNF-α（TNF-a-PE-CY7）抗体染色15分钟。所有抗体均来自eBioscience，HIV gag CD8四聚体（AMQMLKETI）是Beckman Coulter的H-2Kd PE。我们使用BD Biosciences LSRII在FlowJo（Tree Star）中进行数据分析。

疫苗防堵试验。

用10只戊巴比妥钠麻醉小鼠进行静脉注射⁵在35μL PBS中加入Mg/Ca的小鼠重组痘苗病毒PFU。阴性对照为痘苗-OVA病毒。在激发后7天内，每天测定动物体重（每组5只）。然后，对小鼠实施安乐死，采集其肺部，在运输介质（PBS中的0.1%明胶）中均质，并在病毒滴定之前在-80°C下保存两份。通过CV-1细胞单层上的斑块试验测定各组小鼠的肺病毒滴度(4,5,12).

我们感谢J.Kuroiwa耗尽CD4和CD8抗体，H.Zebroski（洛克菲勒大学蛋白质组学设施）合成肽，B.Moltedo和C.B.Lopez（西奈山医学院微生物系）疫苗病毒，R.Bernard和D.Hannaman（伊科医疗系统）电穿孔设备和建议，和J.Adams寻求图形方面的帮助。这项工作得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health Grants）的支持AI40045型; 和AI40874型以及比尔和梅琳达·盖茨艾滋病疫苗发现基金会中心。