美国生理学杂志胃肠病学肝病生理学。2010年3月；298（3）：G364–G374。
脂联素SIRT1-AMPK信号通路参与罗格列酮对小鼠酒精性脂肪肝的保护作用
佛罗里达州坦帕市南佛罗里达大学健康科学中心分子药理学和生理学系
通讯作者。转载请求和其他通信地址：M.You，医学院基础生物医学科学学院分子药理学和生理学系，佛罗里达州坦帕Bruce B.Downs大道12901号南佛罗里达大学8号信箱，邮编：33612（电子邮件：ude.fsu.htlaeh@uoym). 2009年11月5日收到；2009年12月7日接受。
摘要
酒精性脂肪肝的发生与动物体内脂肪细胞衍生脂联素水平降低、肝脂联素受体降低和肝脂联蛋白信号传导紊乱有关。过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）在脂肪组织中脂联素的调节中起着关键作用。本研究的目的是测试罗格列酮（一种已知的PPAR-γ激动剂）逆转乙醇对脂联素表达及其肝信号传导的抑制作用的能力，以及减轻小鼠酒精性肝脂肪变性的能力。给小鼠喂食改良的Lieber-DeCarli含乙醇液体饲料4周，或喂食配对对照饲料。四组小鼠被给予3或10 mg·kg体重的剂量−1·天−1在喂食研究的最后2周，在他们的饮食中添加或不添加罗格列酮和乙醇。罗格列酮和乙醇联合用药增加了小鼠脂联素的表达和循环水平，并增强了肝脏脂联素受体（AdipoRs）的表达。这些增加与肝脏sirtuin 1（SIRT1）-AMP活化激酶（AMPK）信号系统的激活密切相关。与刺激的SIRT1-AMPK信号传导一致，罗格列酮给药增强了脂肪酸氧化酶的表达，使脂蛋白1表达正常化，并阻止了脂肪生成酶基因的高表达，这反过来导致脂肪酸氧化增加，脂肪生成减少，减轻乙醇喂养小鼠肝脏脂肪变性。增强的肝脏脂联素SIRT1-AMPK信号至少在一定程度上有助于罗格列酮对小鼠酒精性脂肪肝的保护作用。
关键词：脂质代谢、信号转导、转录调节、乙酰化
酒精性脂肪肝是长期过量饮酒最早和最常见的后果之一，可导致人类更严重的肝损伤，如脂肪性肝炎、肝纤维化和肝硬化(27,40). 因此，制定有效的酒精性脂肪肝治疗策略至关重要。近年来，出现了一些与酒精性脂肪肝发展有关的新机制，为治疗提供了重要线索(27,40). 几种动物模型中的慢性乙醇给药与肝sirtuin 1（SIRT1）-AMP活化激酶（AMPK）轴受损有关，后者是控制脂质代谢途径的中枢信号系统(2,18,38,39).
研究发现，包括肝脏在内的几个代谢组织中SIRT1-AMPK信号的激活，通过分别通过去乙酰化和磷酸化调节PPAR-γ辅活化因子-α（PGC-1α）/PPARα或SREBP-1的活性，从而增加脂肪酸氧化速率，并在很大程度上抑制脂肪生成(6,7,22,32,38). 有趣的是，SIRT1-AMPK轴已成为调节脂联素信号传导和脂联素降脂作用的主要信号系统(27,40).
脂联素是一种30-kDa蛋白，主要由脂肪组织表达和分泌，随后在血清中循环(27,40). 脂联素以三种低聚物形式存在于血清中：即高分子量、中分子量和低分子量形式。越来越多的证据表明，脂联素以寡核苷酸依赖的方式发挥其生物活性。两种主要的脂联素受体（AdipoR1和-R2）作为脂联素介导的信号传导器，导致包括肝脏在内的几个器官中脂肪酸氧化增加和脂肪积累减少(27,40).
大量证据表明脂联素在酒精性脂肪肝的发展中起着关键作用(27,40). 脂联素和肝脏AdipoR1/R2表达的失调可导致酒精性肝脂肪变性动物模型的肝脏脂肪堆积(8,9,11,31,33,35,37). 在酒精性和非酒精性脂肪性肝病小鼠模型中，应用重组脂联素可以改善肝脏脂肪变性(35). 在慢性乙醇喂养的动物中，通过饮食或药物补充诱导脂联素或激活脂多糖R1/R2可减轻肝脏脂肪变性和损伤(9,11,31,37). 虽然乙醇失调脂联素表达的确切细胞和分子机制尚待确定，但有人认为过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）可能与此有关(4,27,40).
PPAR-γ是一种已知的转录因子，参与调节脂质代谢和能量稳态，并参与调节脂肪组织中脂联素基因的表达(4,40). 一组被称为噻唑烷二酮类（TZDs）的选择性化合物激活PPAR-γ已被证明会导致脂肪组织脂联素的转录、翻译和分泌增加，导致血清中蛋白质水平升高，尤其是HMW亚型。(4,19). 吡格列酮是TZD之一，已被证明可以预防大鼠酒精诱导的肝损伤。PPAR-γ激活脂联素可能有助于这些肝脏保护作用(34).
一些证据表明，另一种TZD，罗格列酮，可以改善非酒精性脂肪性肝病患者和某些啮齿动物模型的脂肪变性并使肝酶水平正常化(4). 这种效应的分子机制似乎涉及脂肪组织中脂联素的上调(4,19). 然而，罗格列酮对肝损伤的益处仍有争议。一项研究表明，罗格列酮治疗可部分通过激活肝脏PPAR-γ，显著增加ob/ob小鼠的肝脏脂肪变性(14).
在本研究中，我们检测了罗格列酮治疗对小鼠酒精性脂肪肝发育的影响，并探讨了脂联素SIRT1-AMPK信号在罗格列汀作用中的参与。
材料和方法
动物研究。
本研究中使用的乙醇进料模型已在前面描述过(2,37). 雄性C57BL/6J小鼠（6至8周龄）购自Jackson Laboratory（ME Bar Harbor）。液体饮食基于Lieber-DeCarli配方，提供1 kcal/ml（宾夕法尼亚州伯利恒Dyets）(11). 将小鼠分为六个饮食组，以测试两种剂量罗格列酮的效果：1)多不饱和脂肪双喂控制饮食（PUFA，40%的热量来自脂肪，主要来自玉米油）；2)PUFA饮食加3 mg·kg体重−1·天−1罗格列酮（R3）；三)PUFA加10 mg·kg体重−1·天−1罗格列酮（R10）；4)PUFA饮食加乙醇[E；与对照PUFA膳食相同，但添加的乙醇占总热量的29%，并去除碳水化合物（麦芽糖-糊精）的热量当量]；5)PUFA饮食加乙醇和3 mg·kg体重−1·天−1罗格列酮（E+R3），以及6)PUFA饮食加乙醇和10 mg·kg体重−1·天−1罗格列酮（E+R10）。在后两组中，罗格列酮（Cayman Chemical，Ann Arbor，MI）被添加到研究最后2周的饮食中。乙醇逐渐被引入液体饮食中。对于食用含乙醇饮食的小鼠，将动物笼放在加热垫上以保持体温，以补偿潜在的乙醇诱导的体温过低。液体饮食喂养4周后，对动物实施安乐死，然后收集血液、肝组织和脂肪组织。这些研究得到了南佛罗里达大学动物护理使用委员会的批准。
病理和生化分析。
如前所述，肝脏切片用苏木精和伊红染色(2). 如前所述测量肝脏甘油三酯水平(2,37). 通过使用来自BioVision（Mountain View，CA）的商业试剂盒对肝组织进行脱蛋白，并测定乳酸盐和丙酮酸盐的浓度。使用Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）的试剂盒测定血清丙氨酸氨基转移酶水平。血浆β-羟基丁酸（β-OHB）通过β-羟基丁酸液比色程序（德克萨斯州博恩SanBio实验室）进行测量。使用Sigma Diagnostics甘油三酯和Infinity胆固醇试剂测定血浆甘油三酸酯水平。
血清总或HMW形式脂联素水平的测量。
使用来自R&D Systems（明尼阿波利斯，明尼苏达州）的商业ELISA试剂盒测定血清总脂联素水平。使用BioVendor（Candler，NC）的试剂盒测量HMW型脂联素的血清水平。
总RNA分离和qRT-PCR。
使用RNEasy Total RNA试剂盒（Qiagen）从小鼠肝脏或脂肪组织中制备总RNA。实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）按照描述进行(2). 以下引物组购自SuperArray Bioscience（Frederick，MD）：SIRT1（PPM05054A）、甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPAT1；PPM33295A）、ACCα（PPM0.5109E）、中链酰基辅酶A脱氢酶（MCAD；PPM25604A）、肉碱棕榈酰转移酶1a（CPT1a；PPM25930B）、PGC-1α（PPM 03360E）、脂联素（PPM 05260A）、，AdipoR1（PPM 35710A）、AdipoR2（PPM 38032E）、TNF-α（PPM 03113E）、PPAR-γ（PPM 05108B）、UCP2（PPM03034B）和GAPDH（PPM02946E）。根据比较周期阈值（C吨)标准化靶mRNA C的方法吨对于GAPDH而言。
蛋白质印迹分析。
用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的细胞提取物或冷冻肝脏样品进行免疫印迹分析，并转移到硝化纤维过滤器中。用圣克鲁斯的抗体观察SIRT1和脂蛋白1。用抗体（Cell Signaling Technology，Danvers，MA）观察AMPKα、磷酸-AMPKα、AMPKβ、磷酸-AMPKβ和磷酸-ACC。使用多克隆兔抗肌动蛋白β抗体（Sigma）对肝总蛋白提取物获得的信号进行标准化。
PGC-1α和FoxO1乙酰化分析。
用抗PGC-1α抗体从新鲜肝脏样品中分离的核提取物中免疫沉淀PGC-1蛋白（加州圣地亚哥Calbiochem）。使用PGC-1α和乙酰赖氨酸（细胞信号）的特异性抗体检测PGC-1β和乙酰化水平。乙酰和总叉头转录因子O1（FoxO1）抗体来自圣克鲁斯。
大鼠H4IIEC3肝癌细胞和小干扰RNA转染的研究。
SIRT1（SIRT1 shRNA）和AMPKα（AMPK alpha shRNA）的小沉默RNA购自Santa Cruz Biotechnology（加州圣克鲁斯）。使用大鼠H4IIEC3肝癌细胞进行小干扰RNA转染试验，如下所述(38).
数据分析。
数据以平均值±SE表示。所有数据均采用双向方差分析，然后采用Tukey的多重比较程序进行分析P（P）<0.05视为显著。
结果
罗格列酮可减轻小鼠酒精性肝脂肪变性，并使血清转氨酶水平正常化。
根据配对喂养方案，雄性C57BL/6J小鼠被喂食改良的Lieber-DeCarli液体饮食和高PUFA饮食以及乙醇（总热量的29%）4周(39). 四组小鼠被给予3 mg·kg体重的剂量−1·天−1（R3）或10 mg·kg体重−1·天−1喂食研究最后2周的饮食中添加或不添加罗格列酮（R10）。摄入4周的乙醇对小鼠的健康状况没有明显影响，在喂食期结束时，所有六组小鼠的体重平均增加了3克。乙醇喂养并没有导致肝体重比显著增加。过去2周的罗格列酮治疗并未显著影响小鼠的平均食物摄入量、肥胖或血液酒精水平（数据未显示）。
如所示组织病理学分析显示，慢性乙醇喂养导致小鼠肝脏脂肪滴堆积，包括微泡和大泡脂肪变性。当乙醇喂养小鼠同时服用罗格列酮时，肝脏组织学显示肝脂滴的积聚减弱。与成对喂养的对照小鼠相比，乙醇喂养使肝脏甘油三酯水平增加了约三倍(). 罗格列酮对乙醇喂养小鼠的治疗显著降低了肝脏甘油三酯含量，接近对照水平(). 此外，乙醇喂养小鼠的血浆丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶（两种肝损伤指标）显著升高，但通过联合服用罗格列酮可降至对照水平(,C类和D类). 总的来说，数据表明罗格列酮治疗可以减轻小鼠酒精性肝脂肪变性。
罗格列酮减轻小鼠酒精性脂肪肝。肝切片苏木精伊红染色（原始放大倍数×20）(A类)、肝甘油三酯（TG）含量(B类)，血浆天冬氨酸转氨酶（AST）水平(C类)和血浆丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平(D类)喂食多不饱和脂肪酸（PUFA）控制饮食（C）、PUFA饮食加3 mg·kg−1·天−1罗格列酮（R3），PUFA饮食加10 mg·kg−1·天−1罗格列酮（R10），或不含罗格列汀（E）的PUFA加乙醇饮食或罗格列酮加（E+R3，E+R10）。所有数据均表示为平均值±SD；n个=6-8只动物。没有共同字母的意思不同，P（P）<0.05。
罗格列酮上调了乙醇喂养小鼠的脂联素水平，并使脂联素HMW形式正常化。
与配对喂养的对照小鼠相比，乙醇喂养可显著降低循环脂联素～15%(). 虽然与对照组相比，罗格列酮单独治疗显著增加了血清脂联素浓度，但向乙醇喂养的小鼠补充罗格列汀也显著增加了循环脂联素水平。乙醇喂养也显著减少了循环中HMW的数量（～14%）(). 通过补充罗格列酮的乙醇饮食，HMW脂联素水平恢复到对照水平().
罗格列酮增加了乙醇喂养小鼠的循环脂联素和正常化的血浆高分子量（HMW）形式的脂联素。循环脂联素浓度(A类)、血浆HMW脂联素水平(B类)以及脂联素、TNF-α、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）、sirtuin 1（SIRT1）和解偶联蛋白2（UCP2）的相对脂肪mRNA水平(C类)喂食中所述食物的小鼠.所有数据均表示为平均值±SD；n个=6-8只动物。没有共同字母的意思不同，P（P）<0.05。
接下来我们检测了小鼠内脏脂肪组织中脂联素基因的表达。乙醇喂养显著抑制脂联素mRNA表达，罗格列酮治疗可恢复脂联素的mRNA表达(). 各组脂肪组织中脂联素的基因表达水平与TNF-α的mRNA水平呈负相关().
虽然脂肪PPAR-γmRNA的表达不受单用乙醇喂养的影响，但乙醇与罗格列酮联合使用可显著提高脂肪PPAR/γmRNA水平。这表明，当罗格列酮被添加到含乙醇的饮食中时，PPAR-γ可能参与脂肪细胞中脂联素的上调(). 此外，SIRT1和解偶联蛋白-2（UCP2）这两种脂联素基因表达的已知调节因子的mRNA水平在乙醇喂养中均显著降低，而在乙醇饮食中补充罗格列酮则保持在对照水平().
罗格列酮增加了乙醇喂养小鼠肝脏脂联素受体的mRNA表达水平。
我们检测了罗格列酮对乙醇喂养小鼠肝脏中AdipoR1和AdipoR2的影响。如所示乙醇喂养可选择性降低小鼠肝脏AdipoR2的mRNA表达。与对照组相比，乙醇饮食中补充罗格列酮后，AdipoR1和AdipoR2的mRNA水平大约增加了一倍，而罗格列酮类单独治疗导致了适度的增加(). 此外，如所示,B类和C类，不仅乙醇喂养显著增加肝脏PPAR-γmRNA和蛋白水平，罗格列酮治疗也显著增加，无论是否使用乙醇。
罗格列酮增加了乙醇喂养小鼠肝脏脂联素受体的mRNA表达水平。脂联素受体AdipoR1和AdipoR2在肝脏中的相对mRNA水平(A类)，相对肝脏mRNA(B类)和核蛋白(C类)喂食以下食物的小鼠的PPAR-γ水平.所有数据均表示为平均值±SD；n个=6-8只动物。没有共同字母的意思不同，P（P）<0.05。
罗格列酮给药刺激了乙醇喂养小鼠的肝脏SIRT1-AMPK信号系统。
我们确定脂联素浓度和肝脏AdipoR1/R2的变化是否导致乙醇喂养小鼠肝脏中SIRT1-AMPK信号的改变。如所示,A类和B类与对照动物相比，乙醇喂养显著降低了肝脏SIRT1的mRNA和蛋白水平。罗格列酮单独治疗并不影响SIRT1的表达水平。然而，当给乙醇喂养小鼠服用罗格列酮时，SIRT1的mRNA和蛋白水平增加到或高于对照水平(,A类和B类).
罗格列酮给药激活了乙醇喂养小鼠的肝脏SIRT1活性。肝脏SIRT1 mRNA(A类)、SIRT1蛋白水平(B类)，PPAR-γ辅活化因子-α（PGC-1α）或叉头转录因子O 1（FoxO1）的乙酰化(C类)和相对PGC-1α或FoxO1乙酰化(D类)喂食不同饮食的小鼠从肝脏提取物中免疫沉淀PGC-1α，然后用抗乙酰化赖氨酸（Ac-Lys）抗体进行免疫印迹，以确定PGC-1 a乙酰化的程度。使用抗乙酰化FoxO1（Ac-FoxO1）抗体测定FoxOl的乙酰化水平。所有数据均表示为平均值±SD；n个=6-8只动物。没有共同字母的意思不同，P（P）< 0.05. IP，免疫沉淀；IB，免疫印迹。
此外，在乙醇喂养小鼠的肝脏中，罗格列酮消除了乙醇诱导的PGC-1α和FoxO1的超乙酰化，这是SIRT1的两个已知靶点，表明肝脏SIRT1酶活性通过乙醇喂养受到抑制，通过罗格列汀治疗恢复(,C类和D类).
关于肝脏AMPK的水平和活性，与对照小鼠的肝脏相比，乙醇喂养小鼠的肝脏显示AMPKα的磷酸化和总蛋白水平降低(). 在乙醇喂养的小鼠中，补充罗格列酮可以减弱乙醇介导的对AMPKα磷酸化和总蛋白水平的抑制以及对乙酰辅酶a羧化酶（ACC）磷酸化的抑制，ACC是AMPK的一个已知下游靶点().
罗格列酮刺激乙醇喂养小鼠的肝脏AMP-activated kinase（AMPK）活性。A类：通过使用来自喂食不同饮食的小鼠肝提取物的抗磷酸化AMPKα（抗p-AMPKβ）、抗AMPKγ和抗磷酸化乙酰辅酶A羧化酶（p-ACC）抗体进行蛋白质印迹，如β-肌动蛋白带用于确认等负荷并使数据正常化。B类：p-AMPKα、AMPKβ和p-ACC的相对水平。蛋白质印迹通过PhosphorImager和MultiAnalyst（Bio-Rad）软件分析定量。所有数据均表示为平均值±SD；n个=6-8只动物。没有共同字母的意思不同，P（P）<0.05。
我们进一步检查了肝脏乳酸和丙酮酸水平是否代表NAD的比率+乙醇或罗格列酮改变NADH浓度。虽然乙醇喂养可显著提高肝脏乳酸水平，但罗格列酮联合用药可使乙醇喂养小鼠的乳酸水平降低80%(). 所有组的肝脏丙酮酸水平均无变化（数据未显示）。
表1。
| 参数 | 控制 | R3级 | 10兰特 | 乙醇 | 电子+R3 | E+R10 |
|---|
| 血浆甘油三酯，mg/dl | 78 ± 13b条 | 59 ± 6b条 | 69 ± 17b条 | 139 ± 38一 | 64±11b条 | 74 ± 17b条 |
| 血浆胆固醇，mg/dl | 84 ± 16 | 86 ± 19 | 78 ± 11 | 70 ± 12 | 77 ± 4 | 69 ± 9 |
| 血浆β-OHB，mg/dl | 3.8 ± 1.6c（c） | 5.8 ± 2.1b条 | 5.1 ± 1.5b条 | 6.2 ± 1.7b条 | 12.4 ± 2.1一 | 16.4 ± 3.3一 |
| 肝乳酸，nmol/mg | 7.3 ± 1.5b条 | 5.9 ± 1.3c（c） | 4.9 ± 1.2c（c） | 9.8 ± 2.3一 | 3.8 ± 1.7天 | 2.2 ± 1.3天 |
罗格列酮恢复了乙醇喂养小鼠肝脏中PGC-1α和RXRα的活性，并增强了参与脂肪酸氧化的基因的表达。
SIRT1-AMPK轴刺激肝脏PGC-1α信号(40). 如所示乙醇喂养确实显著抑制了PGC-1α和维甲酸X受体α（RXRα）的mRNA水平，这两种已知的PPARα辅激活物通过联合使用罗格列酮恢复到控制水平。然而，乙醇和罗格列酮均未改变小鼠肝脏PPARα基因或蛋白质水平（数据未显示）。
罗格列酮诱导了乙醇喂养小鼠脂肪酸氧化酶编码基因的表达，并阻断了脂肪酸氧化酶基因的表达。PGC-1α、维甲酸X受体α（RXRα）和PPARα信号调节脂肪酸氧化酶的相对mRNA水平(A类)、乙酰-活塞H3-Lys9（Ac-活塞H3-Lys9）和组蛋白H3水平(B类)和脂肪生成酶的相对mRNA水平(C类)在喂食不同食物的小鼠肝脏中，如ACCα，乙酰辅酶A羧化酶α；中链酰基辅酶A脱氢酶；CPTI，肉碱棕榈酰转移酶I。所有数据均表示为平均值±SD；n个=5-8只动物。没有共同字母的意思不同，P（P）<0.05。
因此，虽然乙醇喂养组线粒体MCAD和CPT1a的mRNAs没有变化，但向乙醇喂养小鼠补充罗格列酮后，MCAD和CP T1a的RNA水平高于对照组或乙醇喂养小鼠(). 这些发现与一项研究一致，该研究表明，长期乙醇喂养会损害PPARα的DNA结合和转录活性，而不会影响乙醇喂养小鼠肝脏中PPARαmRNA或蛋白的水平(12).
与对照组相比，补充罗格列酮的乙醇喂养小鼠的血清β-OHB水平显著升高近四倍，与乙醇喂养小鼠相比显著升高两倍以上，表明罗格列酮类治疗结合乙醇喂养能够诱导肝脂肪酸氧化().
罗格列酮可抑制赖氨酸9（Lys9）处肝组蛋白H3的高乙酰化，并减弱乙醇喂养小鼠中编码脂肪生成酶的基因的表达增加。
乙醇介导组蛋白H3-Lys 9乙酰化的增加与几种脂肪酶的转录诱导有关(38). 此外，染色质免疫沉淀分析证实，与配对喂养的对照小鼠相比，乙醇喂养小鼠肝脏中乙酰化组蛋白H3-Lys9与线粒体GPAT1启动子的关联性增加(36). 如所示组蛋白H3-Lys9的乙酰化水平通过乙醇喂养而提高。在乙醇喂养小鼠中，罗格列酮治疗完全阻断了乙醇诱导的组蛋白H3-Lys9乙酰化(). 组蛋白H3蛋白水平在所有组中保持不变().
虽然喂食乙醇会显著增加小鼠肝脏中编码ACCα和GPAT1的mRNA的表达，但向喂食乙醇的小鼠补充罗格列酮会将这些基因产物恢复到控制水平(). 有趣的是，罗格列酮治疗并未改变乙醇喂养小鼠肝脏中固醇调节元件结合蛋白1（SREBP-1）的mRNA或活性核形式的水平（数据未显示）。这可能是由于核SREBP-1蛋白的蛋白酶体快速降解所致。
罗格列酮使乙醇喂养小鼠肝脏和脂肪组织中的脂蛋白1表达水平正常化。
脂蛋白1最近被确定为脂代谢的关键调节因子(25). 如所示虽然乙醇摄入显著增加了肝脏脂质1的mRNA表达水平，但乙醇喂养小鼠补充罗格列酮后，肝脏脂质1基因表达恢复到了正常水平。相反，与配对喂养的对照小鼠相比，接受乙醇饮食的小鼠内脏脂肪组织中的脂蛋白1 mRNA表达水平显著降低，而罗格列酮和乙醇的联合用药使脂蛋白1恢复到对照水平().
罗格列酮使乙醇喂养小鼠肝脏和脂肪组织中的脂蛋白1表达水平正常化。A类：肝脏或脂肪脂质1 mRNA。B类：喂食不同饮食的小鼠的肝细胞溶质脂质1蛋白水平，如.所有数据均表示为平均值±SD；n个=5-8只动物。没有共同字母的意思不同，P（P）<0.05。
与对照组小鼠相比，乙醇喂养小鼠的肝细胞溶质脂质1蛋白水平升高(). 乙醇喂养小鼠补充低剂量（R3）和高剂量（R10）罗格列酮后，肝脂蛋白1蛋白表达正常化和降低（分别）(). 罗格列酮单独治疗并不影响脂蛋白1水平（数据未显示）。
脂联素刺激大鼠肝癌细胞中的SIRT1-AMPK信号。
在选择合适的模型系统来研究肝脏发生的分子机制方面，大鼠肝癌细胞系H4IIEC3表达足够水平的SIRT1和AMPK基因和蛋白(38,39). 此外，这些细胞能够通过乙醇脱氢酶和醛脱氢酶的活性代谢乙醇(38,39).
为了确定SIRT1-AMPK信号系统是否是脂联素作用的直接靶点，通过用不同浓度的小鼠全长重组脂联素（flAcrp）处理肝癌H4IIEC3细胞24小时来测试脂联素对SIRT1蛋白表达的影响。flAcrp治疗显著增加了SIRT1蛋白水平，最大效应为0.5μg/ml(). SIRT1的增加与磷酸化AMPKα的显著增加相一致().
脂联素上调大鼠H4IIEC3细胞的SIRT1并刺激AMPK活性。A类：H4IIEC3细胞在无血清DMEM中饥饿过夜，并以指定浓度添加全长小鼠重组脂联素（flAcrp）18小时。B类：用flAcrp（1μg/ml）处理转染AdipoR1小沉默RNA（shRNA）或AdipoR2 shRNA质粒的H4IIEC3细胞18小时。C类：用flAcrp（1μg/ml）处理转染AMPKαshRNA质粒的H4IIEC3细胞18 h。D类：用flAcrp（1μg/ml）处理转染SIRT1 shRNA的H4IIEC3细胞18小时。E类：H4IIEC3细胞在无血清DMEM中饥饿过夜，并用flAcrp（1μg/ml）预处理，然后加入乙醇（63mM）18小时。分别用抗SIRT1和抗p-AMPKα抗体通过Western印迹检测SIRT1蛋白水平或磷酸化AMPKα（p-AMPKα）。数据表示至少3次复制。
尽管敲除AdipoR1或AdipoR2只能部分减弱脂联素诱导的SIRT1蛋白增加，但敲除AdipoR1和AdipoR2完全阻断了H4IIEC3细胞中脂联素诱发的SIRTI蛋白增加(). 请注意，Western blot分析证实，在H4IIEC3细胞中，通过分别转染AdipoR1 shRNA和AdipoR2 shRNA，AdipoR 1和Adipo R2表达受到抑制（数据未显示）。
我们进一步研究了在脂联素存在的情况下SIRT1和AMPKα是如何相互调节活性的。用AMPKαshRNA敲除AMPK a对脂联素诱导的SIRT1蛋白升高的影响可以忽略不计(). 相反，用SIRT1 shRNA敲低SIRT1显著降低脂联素增加磷酸化AMPK（p-AMPK）水平的能力(). 这些数据表明，在培养的肝细胞中，脂联素可能通过上调SIRT1间接激活AMPK信号。注意，在没有flAcrp的情况下，用AMPK shRNA或SIRT1 shRNA转染H4IIEC3细胞对SIRT1或AMPK表达水平没有明显影响（数据未显示）。
添加flAcrp后，乙醇（63 mM）对SIRT1的抑制和AMPKα的磷酸化作用在很大程度上被逆转().
讨论
在目前的研究中，我们已经证明脂联素信号在罗格列酮减轻小鼠酒精性肝脂肪变性的能力中发挥作用(). 在慢性乙醇喂养小鼠中，罗格列酮合用可显著提高循环总脂联素、HMW脂联素和肝脏AdipoR1/R2的mRNA表达。相关地，在乙醇喂养小鼠的肝脏中，罗格列酮治疗刺激SIRT1-AMPK信号系统，激活PPARα信号，抑制组蛋白H3-Lys9高乙酰化，增加脂肪酸氧化速率，减少脂质合成，减轻肝脏脂肪变性。更重要的是，我们的研究首次证明，据我们所知，脂质1是一种重要的脂质调节剂，在慢性乙醇喂养小鼠的肝脏和脂肪组织中显示出基因表达的相互模式，而罗格列酮治疗乙醇喂养小鼠可恢复两个组织中的脂质1表达。
脂联素SIRT1-AMPK信号在罗格列酮对小鼠酒精性肝脂肪变性的保护作用中的作用。乙酰化赖氨酸9下的Ac-histone H3-Lys9、组蛋白H3；FA，游离脂肪酸；PAP1，磷酸酯酶-1型。
我们目前的研究结果表明，乙醇喂养只引起小鼠循环总脂联素或HMW脂联素蛋白的适度下降。然而，脂联素通过肝脏中的AdipoR1和-R2传递其信号。慢性乙醇喂养可选择性抑制小鼠肝脏AdipoR2 mRNA的表达(2). 因此，血清总脂联素或HMW脂联素水平的适度降低和肝脏AdipoR2的下调可能导致乙醇喂养小鼠肝脏脂联素信号的显著降低和脂质代谢受损。可以想象，罗格列酮治疗通过上调循环总HMW脂联素和肝脏脂联素R1/R2，协同逆转乙醇喂养小鼠的肝脏脂质代谢异常。
PPAR-γ是调节脂肪细胞脂联素基因表达系统的主要成分(4,27,40). 我们的结果表明，乙醇喂养小鼠脂肪组织中脂联素基因表达的罗格列酮依赖性上调部分是通过脂肪PPAR-γ上调介导的。以前的研究和现在的研究一致表明，慢性乙醇喂养不会改变小鼠或小型猪体内PPAR-γ的脂肪mRNA表达(11). 然而，PPAR-γ转录活性可能被乙醇抑制(27). 因此，有理由推测，尽管PPAR-γ基因本身的转录不受影响，但乙醇可能通过某种方式抑制PPAR-β转录活性来抑制脂肪组织中脂联素基因的表达。除PPAR-γ外，其他因子如TNF-α、SIRT1和UCP2也可能调节脂肪组织中乙醇或罗格列酮介导的脂联素表达(三,10,27,40,23).
酒精性和非酒精性脂肪肝中肝脏PPAR-γ的激活与肝脏脂质积聚相关(2,24). 此外，罗格列酮介导的ob/ob小鼠肝脏脂肪变性的增加与肝脏PPAR-γ蛋白表达的增加密切相关(14). 有趣的是，我们目前的研究表明，乙醇和/或罗格列酮治疗显著增加小鼠肝脏PPAR-γmRNA和蛋白水平。这一发现表明肝脏PPAR-γ介导的效应可能与罗格列酮对小鼠酒精性脂肪肝的保护作用无关。
除了激活肝脏脂联素SIRT1-AMPK信号外，其他非脂联素介导的机制可能与罗格列酮对酒精性脂肪肝的保护作用有关。例如，吡格列酮已被证明通过上调c-Met信号通路来预防大鼠酒精性肝脂肪变性(34). 此外，在脂联素不太可能参与的培养肌肉细胞中，罗格列酮治疗导致AMPK活性显著增加(13). 此外，我们的数据显示，罗格列酮降低了乙醇喂养小鼠的肝乳酸水平。乳酸下调SIRT1(26). 这些研究表明，罗格列酮的一些有益作用可能是通过其直接激活肝脏AMPK和通过抑制乙醇喂养小鼠的肝乳酸水平间接上调肝脏SIRT1介导的。通过使用各种动物模型，如脂肪特异性脂联素敲除或肝脏特异性脂联素受体或SIRT1缺失小鼠，可以进一步研究罗格列酮作用的确切机制。我们预测罗格列酮对酒精性肝脂肪变性的保护作用在每种敲除小鼠模型中都会部分减弱。
有趣的是，给小鼠喂食乙醇对肝脏和脂肪组织中的脂蛋白1基因表达有相反的影响。在脂肪组织中，脂蛋白1是诱导两个重要的成脂基因PPAR-γ和CAAT增强子结合蛋白α（C/EBPα）所必需的(21,25). PPAR-γ和C/EBPα都是脂联素基因表达的主要转录调节因子，TZDs能够诱导脂肪细胞中脂蛋白1的表达(16,20,25). 因此，很容易假设脂蛋白1-PPAR-γ或脂蛋白1-C/EBPα信号可能参与罗格列酮介导的脂肪细胞脂联素上调。
在肝脏中，脂蛋白1在脂质代谢的调节中起着两种不同的作用(25). 它可以兼作镁2+-依赖性磷酸酯酶1型（PAP1），也是一种转录调节因子。PAP1催化磷脂转化为甘油三酯和磷脂的直接前体二酰甘油。事实上，在人类酗酒者和狒狒的肝脏中，PAP1活性被证明增加，而酒精暴露对PAP1的激活与肝脏脂肪变性的发展有关(5,28,30). 因此，在乙醇喂养小鼠中，肝脏脂质1 mRNA和蛋白质水平的增加可能在很大程度上有助于增强肝脏PAP1活性。
研究已经证明脂联素信号传导在培养细胞系统中上调SIRT1的能力(29,40). 更重要的是，我们在这里表明，脂联素介导的SIRT1上调需要AdipoR1和AdipoR2，进一步支持SIRT1是脂联素信号的下游靶点。脂联素引起SIRT1蛋白水平改变的确切事件尚不清楚。研究表明，脂联素可降低库普弗细胞中LPS或乙醇等刺激物诱导的NADPH-氧化酶依赖性活性氧（ROS）的生成(40). ROS下调SIRT1(1). 脂联素介导的SIRT1蛋白水平升高可能是ROS降低的结果。然而，我们在巨噬细胞和肝癌细胞中的结果表明，脂联素在没有任何ROS刺激物的情况下增加SIRT1蛋白水平，这意味着可能涉及ROS依赖性机制。
越来越多的证据表明SIRT1和AMPK相互调节对方的活动(6,7,15,17,32,40). 我们目前的研究结果表明，在肝癌细胞中，敲低SIRT1可完全减弱脂联素刺激的p-AMPK水平升高，而敲低AMPKα并不能抵消脂联素介导的SIRT1升高。这些结果强烈表明脂联素-SIRT1轴位于AMPK信号的上游().
总之，我们目前的研究表明，罗格列酮对小鼠酒精性脂肪肝的保护作用是通过刺激一个重要的肝脏信号系统脂联素-SIRT1-AMPK轴介导的，至少部分是通过这种途径介导的。我们认为脂联素SIRT1-AMPK信号的营养或药理调节可以治疗酒精性脂肪肝患者。
赠款
本研究得到了国家酒精中毒和酒精滥用研究所拨款AA-015951和AA-013623（致M.You）的支持。
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