Semin免疫学。作者手稿；PMC 2011年4月1日提供。
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美国国立卫生研究院：美国国立卫生研究院157469
CD1d限制性自然杀伤T细胞的脂质和糖脂抗原
一和a、，b、，*
Manjunatha M.Venkataswamy先生
一美国纽约州布朗克斯阿尔伯特·爱因斯坦医学院微生物与免疫学系，邮编：10461
史蒂文·波塞利
一美国纽约州布朗克斯阿尔伯特·爱因斯坦医学院微生物与免疫学系，邮编：10461
b条美国纽约州布朗克斯阿尔伯特·爱因斯坦医学院医学系，邮编：10461
一阿尔伯特·爱因斯坦医学院微生物学和免疫学系，美国纽约州布朗克斯10461
b条美国纽约州布朗克斯阿尔伯特·爱因斯坦医学院医学系，邮编：10461
摘要
尽管CD1d-限制性NKT细胞的抗原受体库相对有限，但其识别的脂质和糖脂抗原范围却惊人地不同。最近对天然和合成CD1d呈递抗原的研究提供了越来越详细的信息，说明这些脂质和糖脂的特定结构特征如何影响其呈递给NKT细胞并刺激其不同免疫功能的能力。特别是对于α-半乳糖基神经酰胺的合成类似物（这是最近密集研究的重点），越来越清楚的是，设计能够精确控制NKT细胞特定免疫活性的糖脂抗原可能是可行的。NKT细胞抗原结构-活性关系机制的新细节将大大有助于设计和生产免疫调节剂，以精确操纵NKT淋巴细胞及其影响的免疫系统的许多其他成分。
关键词：天然杀伤T细胞、CD1d、α-半乳糖神经酰胺、糖脂、抗原呈递
1.简介
自然杀伤T细胞（NKT细胞）是一类主要的先天性T淋巴细胞，具有广泛的功能，可能与宿主抵抗微生物感染有关[1]、维持免疫耐受[2]以及消除或控制恶性肿瘤[三]. 最初定义为共同表达αβT细胞抗原受体（TCR）和自然杀伤（NK）细胞特征标记物（如NK1.1（CD161））的细胞，最近它们被细分为至少三个亚群[4]. 其中，最丰富和研究最深入的被称为1型NKT细胞，也被称为不变NKT（iNKT）细胞，因为它们表达了不变TCRα链重排（人类中Vα24与Jα18，或小鼠中Vα14与Jα19）[5]. 不变的NKT细胞依赖于非多态性MHC类I样CD1d分子进行胸腺的选择和发育，并识别由该抗原呈递分子向其TCR呈递的各种脂质和糖脂抗原[5,6]. 第二种被称为II型NKT细胞的人群具有不同的TCR，并且对CD1d呈现的假定为性质上的脂质的抗原也有反应。第三种被称为III型NKT细胞的群体和其他群体共享一些表型特性，但不依赖CD1d。
iNKT细胞的一个特征是，它们以独特的部分激活状态循环并分布在脾脏和肝脏等器官中。典型的表现是，它们类似于传统的效应记忆T细胞，具有高表面水平的活化标记物，如CD44和CD69，以及低表达CD62L[6,7]. 它们表现出类似于抗原经历的T细胞在外周生存的稳态维持要求[8]但与经典的MHC限制性记忆T细胞相比，iNKT细胞活性状态不需要预先识别外来抗原。相反，这似乎是一种受控制的自我活动天生的程序[9]. 这种天生的自我活动可能是iNKT细胞维持免疫耐受的稳态功能的基础[10,11]. iNKT细胞促进免疫耐受的能力被认为至少部分与它们产生多种抗炎或调节性细胞因子有关，包括高水平的几种T helper-2（Th2）型细胞因子，如IL-4、IL-5和IL-13[12,13].
在微生物感染或可能对肿瘤引起的炎症作出反应的情况下，iNKT细胞可被急性激活以释放IFNγ和其他促炎细胞因子。这可以通过TCR介导的对特定微生物配体的识别来实现，也可以通过结合自我认知和炎症细胞因子（如IL-12）传递的信号来实现[14]. 与效应记忆T细胞一样，iNKT细胞在TCR参与后不需要经典的共刺激信号来分泌细胞因子[15]以及iNKT细胞细胞质中预先形成的细胞因子编码mRNA转录物的组成性表达与它们产生极快效应反应的能力有关[16]. 这也与激活包括NK细胞和树突状细胞（DC）在内的多种其他白细胞表达其效应器功能有关。通过这些和其他活动的结合，iNKT细胞可以对肿瘤和多种感染性病原体的早期和延迟适应性免疫发挥重要作用[1,17]. 此外，NKT细胞激活糖脂被用作佐剂，以提高小鼠对疫苗的抗原特异性免疫反应，对抗多种传染病[18–21].
与iNKT细胞相关的各种不同功能活动以及小鼠和人类之间对该T细胞亚群的强烈保护，使得人们对探索通过调节iNKT细胞反应而获得的治疗益处产生了极大的兴趣。据信，这可能是通过发现或设计特异性脂质抗原来实现的，这些脂质抗原可以精确激活iNKT细胞的不同功能。在这里，我们回顾了近年来在识别iNKT细胞和其他CD1d依赖性T细胞群（即II型NKT淋巴细胞）识别的天然和合成脂质抗原方面取得的实质性进展。还讨论了配体结构如何控制不同iNKT细胞功能的表达，以及这可能如何有助于在多种不同人类疾病的预防或治疗中使用iNKT细胞激活剂。
2、CD1d呈现的天然脂质
小鼠和人类iNKT细胞的一个特征是它们可以被刺激在体外通过与表达CD1d的抗原提呈细胞共同培养，即使不添加外源性脂质抗原[22,23]. 这种明显的CD1d限制性自身反应性被认为是由于细胞脂质的识别，这些脂质通常与细胞内CD1d蛋白相关，随后出现在细胞表面以供iNKT细胞TCR识别。CD1d自身反应活性被认为是成熟iNKT细胞的标志，可能反映了它们对胸腺中CD1d依赖性阳性选择的需求，这很可能也涉及自身脂质配体的识别[24]. 广泛的研究工作致力于发现参与iNKT细胞胸腺选择和外周激活的特异性自身脂质，以及在较小程度上参与II型NKT的细胞。尽管已经取得了重大进展，但这一领域在很大程度上仍缺乏明确的定义，许多与鉴定候选天然脂质配体有关的争议尚未解决，如下所述。
2.1. 自身磷脂抗原
细胞糖基磷脂酰肌醇（GPI）通过其磷脂酰肌糖醇膜脂锚与CD1d高亲和力结合，被认为是iNKT细胞潜在的天然自噬体[25]. 这一想法主要源于从细胞中纯化的CD1d蛋白含有结合的糖脂，通过质谱和代谢放射性标记的结合可以显示出最有可能是GPI。然而，另一项最近使用类似方法的研究未能证实大量磷脂酰肌醇（PI）或GPI是从细胞中提取的CD1d蛋白的结合天然配体，但相反，发现主要是磷脂酰胆碱（PC）和鞘磷脂是CD1d相关的主要细胞配体[26]. 其他使用功能方法定义小鼠iNKT细胞杂交瘤识别的自身脂质的研究也发现，从细胞中提取的极性脂质在与板结合重组mCD1d孵育时可以激活小鼠iNKT杂交瘤细胞[27]. 这种刺激活性局限于糖脂和磷脂富集组分，对一系列常见细胞脂质的测试表明，纯化或合成形式的PI、PC、磷脂酰甘油（PG）和磷脂酰乙醇胺（PE）可以以CD1d依赖性方式激活大量iNKT杂交瘤[27]. 此外，PE酰基链的结构修饰表明，NKT细胞杂交瘤的活化程度受酰基链不饱和度的影响，因为具有多个双键的PE形式与CD1d的结合增强，并且与具有一个双键者相比，iNKT淋巴细胞对其的识别更好[28]. 从这些研究中，有人认为，由大多数细胞膜脂质组成的自脂蛋白可能对CD1分子的折叠和稳定至关重要，也可能构成iNKT细胞自我活性的靶点。
最近，通过对多发性骨髓瘤患者血浆中提取的脂质进行生化分析，已确定溶血磷脂酰胆碱（LPC）是NKT细胞的天然磷脂配体。这种单酰基形式的PC在过敏性和自身免疫性炎症、哮喘和人类癌症（如多发性骨髓瘤）中升高，可能代表细胞应激或损伤的一种内源性信号。已证明II型NKT细胞识别LPC，可直接显示为Vα24的群体−Vβ11−人类血液中结合LPC-载CD1d二聚体的T细胞[29]. 对从培养细胞中纯化的与人CD1d蛋白相关的细胞脂质的分析也确定溶血磷脂是结合的天然脂质配体之一[26].
2.2. 自身鞘糖脂抗原
一些细胞鞘糖脂可能是iNKT细胞的自配体。一份初步报告显示，β-葡萄糖基神经酰胺合成酶突变细胞系在iNKT细胞刺激中有缺陷，这表明NKT的天然配体可能包括溶酶体鞘糖脂[30]. 对在各种鞘糖脂合成或降解途径中存在缺陷的小鼠突变体的详细后续分析表明，异球三己糖神经酰胺（iGb3）是小鼠和人类iNKT细胞的假定自身糖脂抗原[31]. 为了支持这种可能性，研究表明，小鼠和人类iNKT细胞对纯化或合成的iGb3都产生了适度的CD1d-限制性反应在体外此外，由于iGb3可以通过溶酶体己糖胺酶处理异球蛋白四己糖神经酰胺（iGb4）生成，缺乏β-己糖胺酸酶B的小鼠在iNKT细胞发育中有明显缺陷的发现支持了iGb3是iNKT细胞主要选择配体的假设体内[31].
一些使用合成方法的研究进一步详细介绍了iGb3的CD1d呈现和iNKT细胞刺激特性。iGb3结构类似物与iNKT细胞杂交瘤之间的构效关系研究表明，末端半乳糖特定位置（2'和3'）的羟基对iNKT细胞识别iGb3起到关键作用，而其他位置（4'和6'）没有发现对这一认可如此重要[32]. 在哺乳动物细胞膜的鞘糖脂提取物中，iGb3以微量的形式存在，其异构体globotrihexosylceramide（Gb3）以大量的形式存在。最近基于透甲基化和离子阱质谱的改良质谱法的发展，使在有限的生物样品中存在异构体成分的情况下对异球三糖神经酰胺进行灵敏定量变得可行[33]. 神经酰胺和近端糖之间糖苷键立体化学的影响，在天然iGb3中为β构型，也已使用合成方法进行了评估[34]. 这表明合成的iGb3和Gb3α-单体作为iNKT细胞配体具有活性，并刺激iNKT细胞反应在体外比含有beta链接的天然iGb3具有更大的效力。据报道，与CD1d结合的iGb3的晶体结构，为这种假定的自身抗原的可能识别模式提供了详细的结构见解[35].
然而，尽管有大量证据表明iGb3可以作为iNKT细胞反应的刺激配体在体外最近的几项研究挑战了iGb3作为iNKT细胞天然选择配体的相关性体内对具有除溶酶体己糖胺酶以外的各种不同酶缺陷的小鼠进行分析，这些酶缺陷都会导致溶酶体鞘糖脂的积累，结果表明这些酶缺陷几乎都会导致iNKT细胞发育缺陷[36]. 这表明，最初在己糖胺酶B缺陷小鼠中观察到的缺陷可能反映了脂质沉积病导致的内胚体功能的普遍失调，而不是iGb3的特定丢失。此外，在iGb3合成酶缺陷小鼠中观察到iNKT细胞的发育及其在各器官中的分布正常[37]. 虽然在许多小鼠组织中检测到了iGb3合成酶mRNA，但据报道，人类和小鼠胸腺中没有iGb3[38]. 在小鼠和人类的胸腺或树突细胞中，使用基于高效液相色谱的高灵敏度测定法无法检测到iGb3，这一发现进一步强化了这样一个结论，即这种糖脂可能不是正常NKT细胞发育的生理选择配体[38].
除iGb3外，还研究了其他一些鞘糖脂作为iNKT细胞的潜在天然配体，特别是在癌症或其他疾病中。神经节苷脂GD3在神经外胚层来源的肿瘤中高度表达，已被确定为小鼠iNKT细胞的潜在天然配体。CD1d-限制性iNKT细胞在GD3+将携带这种脂质的人类黑色素瘤或同基因APC注射到小鼠体内[39]. 糖鞘脂也可能在自身免疫性疾病中发挥抗原靶点的作用，如多发性硬化症和格林-巴利综合征，其中可能发生自身脂质反应性CD1限制性T细胞[40]. 特别是，作为存在于神经系统髓磷脂中的主要糖脂的硫苷（或3'-磺基半乳糖神经酰胺）已被CD1d-限制型II NKT细胞识别。在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）期间，中枢神经系统中可检测到大量的硫酸酯特异性NKT细胞，而用硫酸酯治疗小鼠可以抑制EAE[41]. 当分析具有不同脂肪酸链长（C16–C24）的硫苷合成类似物时，发现顺-四碳烯醇（C24:1，单不饱和脂肪酸）是最活跃的物种，因此可能是免疫优势的硫苷物种[42].
3.激活NKT细胞的微生物糖脂
多项研究支持这样的观点，即iNKT细胞对微生物糖脂具有广泛的抗原特异性，其中包括基于神经酰胺的脂质以及基于二酰甘油的微生物衍生抗原。报道的第一个天然iNKT细胞微生物抗原是一种四甘露糖基形式的磷脂酰肌醇，从牛分枝杆菌卡介苗[43]. 这种化合物，称为PIM4结果显示，只激活一小部分产生IFNγ但很少或没有IL-4的iNKT细胞，并显示出细胞溶解活性[43]. 类似地，来源于螺旋体的非磷酸化二酰基甘油糖脂伯氏疏螺旋体（αMGalD）被一部分小鼠I型NKT细胞和人类I型NK细胞系识别。iNKT细胞对该抗原的反应也以IFNγ而非IL-4的优先刺激为特征[44].
最近发现的α-甘露糖醛酸神经酰胺，包括α-半乳糖醛酸和α-葡萄糖醛酸神经胺鞘脂单胞菌属种细菌作为CD1d呈现iNKT细胞抗原，进一步证明了iNKT细胞在抗菌防御中的重要作用[45–47]. α-葡萄糖醛酸神经酰胺是由鞘氨醇或埃立克体属细菌表达的6-羧基化α-糖基神经酰胺。CD1d分子结合这些糖脂并将其呈现给iNKT细胞。研究发现，在小鼠中，一部分iNKT细胞对α-葡萄糖醛酸神经酰胺产生反应，所有接受测试的人类NKT淋巴细胞系都能识别这种抗原。这些抗原在人和小鼠NKT细胞中都能诱导强烈的IFNγ和IL-4分泌。鞘氨醇糖脂的出现似乎有可能显著调节感染结果，因为野生型小鼠的高剂量鞘氨醇感染会导致由活化的iNKT细胞快速释放的炎性细胞因子引起的感染性休克。另一方面，缺乏iNKT细胞的小鼠感染可能与细菌清除延迟有关[44,47]. 对鞘氨醇单胞菌科的鞘糖脂合成形式的评估表明，在单、二、三和四甘醇神经酰胺（GSL-1到GSL4）中，只有GSL-1是iNKT细胞的有效刺激物[48]. 这可以通过观察到寡糖基神经酰胺在溶酶体中没有被截断为GSL-1来解释，可能是因为这些高阶GSL是溶酶体酰基转移酶的不良底物[49].
据报道，小鼠iNKT细胞能够识别来自原生动物病原体的脂多糖（LPG或LD1S）多诺瓦尼利什曼原虫一小部分iNKT细胞识别LD1S，这些细胞产生IFNγ，但不产生IL-4[50]. 最近研究表明，iNKT细胞对小鼠阿米巴肝脓肿的预防至关重要。细胞膜脂肽磷酸聚糖（EhLPPG）溶组织内阿米巴被鉴定为激活iNKT细胞的天然配体，从而产生保护性免疫[51].
4.α-半乳糖神经酰胺的合成类似物
α-半乳糖基神经酰胺具有显著的iNKT细胞激活特性，这一发现使该淋巴细胞群的研究取得了重大进展。最初被鉴定为海洋海绵提取物中存在的免疫激活剂毛里求斯阿吉拉斯α-半乳糖神经酰胺（αGalCer）的合成形式KRN7000[（2S，3S，4R）-1-O-（α-D-吡喃半乳糖基）-2-（N-六糖胺基）-1,3,4-十八烷三醇]的开发首次提供了一种特征明确的配体，可用于识别和激活几乎所有iNKT细胞() [52]. KRN7000含有C18植物鞘氨醇碱和完全饱和的C26 N-连接脂肪酰基链，在患有黑色素瘤和其他类型癌症的小鼠中显示出显著的抗肿瘤活性[53]. 尽管大多数哺乳动物的神经酰胺糖脂含有β-异聚体形式的近端糖，但KRN7000并不常见，因为糖部分与α-异聚物结构相连。当CD1d呈递时，这种糖脂对大多数iNKT细胞的TCR产生高亲和力复合物，这使得能够构建负载KRN7000或其他密切相关糖脂的荧光标记CD1d四聚体，用于流式细胞术中鉴定人或鼠NKT细胞[10,54,55].
原型合成iNKT细胞抗原KRN7000的结构，它是一种αGalCer，具有C26:0酰胺连接的酰基链和C18饱和植物鞘氨醇碱。盒状区域显示了经过系统修饰以产生这种有效iNKT细胞抗原类似物的关键结构成分。
大量研究表明，KRN7000是小鼠和人类iNKT细胞的有效激活剂，它能诱导产生复杂的细胞因子混合物，其中包括那些通常与Th1型和Th2型反应相关的细胞因子[56]. 然而，事实上，KRN7000诱导混合Th1和Th2细胞因子反应，这在许多情况下可能是一个缺点，在这些情况下，需要适应性免疫反应的纯粹极化。例如，在治疗Th1细胞因子参与发病的某些自身免疫性疾病时，KRN70000诱导的促炎症Th1型细胞因子（如IFNγ或TNFα）是不可取的[10]. 相反，KRN7000诱导的Th2型细胞因子，如IL-4、IL-13和IL-5，在癌症免疫治疗或哮喘等过敏性疾病中可能有害。因此，近年来，一项主要的研究工作集中于开发KRN7000的合成类似物，该类似物能够诱导纯Th1或Th2型细胞因子反应。几项研究表明，改变KRN7000的基本脂质结构可以导致iNKT细胞激活后细胞因子生成的显著变化[57–63].
4.1‥鞘氨醇碱衍生物
αGalCer的第一个类似物显示出明显的细胞因子极化特性，是KRN7000命名为OCH的改良版本，其中鞘氨醇碱基被截断为C9，脂肪酸链略微缩短为C24:0() [57]. 当这种类似物注射到小鼠体内时，诱导了快速的IL-4反应，但没有检测到IFNγ。细胞因子反应中Th2偏倚的拟议机制是转录因子c-Rel公司属于转录调节因子NF-κB家族，是IFNγ释放的关键成分，在KRN7000刺激后由iNKT细胞诱导转录，而不是由OCH诱导转录[64]. 据报道，截短植物鞘氨醇链可以增加小鼠和人iNKT细胞释放IL-4[59]尽管这一点在人类iNKT细胞应答的文献中尚未得到有力证实。相反，芳香环连接到截短的鞘氨醇链末端（例如，αGalCer C13）被认为会产生一种有效的iNKT细胞激活剂，该激活剂可诱导更多Th1偏向的细胞因子反应() [65].
具有iNKT细胞激活特性的KRN7000鞘氨醇链类似物的四个示例。OCH是一种Th2-细胞因子偏倚iNKT细胞激活剂，与KRN7000相比，其具有明显截短的C9植物鞘氨醇和稍短的N-酰基链（C24:0）。C13是截短鞘氨醇衍生物的一个例子，其中加入芳香环可提高iNKT细胞激活效力。三唑8有一个24碳烷基链，通过三唑环与类鞘氨醇碱相连，这是一个高度稳定的刚性连接单元，模拟了酰胺键的拓扑和电子特征。RCAI-18演示了反式-2，4-二烷基化氮杂环丁烷环可以结合在神经酰胺部分中以限制灵活性，同时保留刺激iNKT细胞反应的能力。参考文献见正文。
植物新戈辛支架的改良被用作制造具有不同能力的类似物以扭曲NKT细胞反应的一种方法。由于鞘氨醇类似物比含植物鞘氨醇形式的αGalCer更容易制备，因此对KRN7000和OCH的此类鞘氨醇相似物与母体化合物进行了比较评估。这些类似物激活小鼠iNKT细胞的相对效力在体外表明它们与亲本脂类一样有效，并且在细胞因子诱导方面也与αGalCer的植物鞘氨醇形式非常相似[66]. 与这些功能特性相一致，表面等离子共振研究表明，由于缺乏植物蛋白果胶4-羟基，iNKT细胞TCR与αGalCer-mCD1d复合物的结合几乎可以忽略不计，而植物蛋白果糖链上的3-羟基对TCR结合至关重要[67]. 在另一项研究中，αGalCer神经酰胺基的酰胺被1,2,3-三唑基团取代，这是一种刚性连接单元，模拟酰胺键的拓扑和电子特征，对水解和氧化/还原条件具有极高的稳定性[68]. 一系列GalCer类似物中三唑连接的脂链长度递增变化表明，用三唑等位取代αGalCer的酰胺部分可以产生高度刺激性的iNKT细胞抗原。刺激效应受连接链的长度影响，长链三唑类似物对iNKT细胞刺激的效力与KRN7000相当（例如，三唑8含有与三唑基团相连的24碳饱和烷基链；). 通过对iNKT细胞作出反应，观察到该系列中的一些化合物与IFNγ相比，IL-4的产生显著增加在体外和体内小鼠iNKT细胞反应分析[68].
为了研究神经酰胺部分构象限制的影响，用氮杂环或吡咯烷环合成了类似物。其中，化合物命名为RCAI-18，具有反式-2,4-二烷基化氮杂环丁烷环被证明是来自小鼠NKT细胞的细胞因子的有效诱导物(). RCAI-18的活性与低剂量下Th2型细胞因子的活性呈剂量依赖性，因此具有潜在的临床应用前景[69]. 还合成了半乳糖丝氨酸型神经酰胺类似物，并在在体外小鼠脾细胞增殖和细胞因子测定。这些脂质通常被发现不如基于神经酰胺的α-半乳糖基糖脂有效[70].
两个小组已经报道了αGalCer的差向异构体的合成，其中KRN7000植物鞘氨醇碱（即2S、3S、4R）的手性碳2、3和4的立体化学已经被系统地改变[71,72]. 虽然这些差向异构体的功能研究尚未详细报道，但初步分析表明，植物鞘氨醇C2-NH2组和C3-OH组的三维空间取向都对iNKT细胞的刺激有重要影响，与C3-OH组相比，C2–NH2组的构型对识别更为关键。相反，C4-OH组的立体化学变化似乎对iNKT细胞反应的影响相对较小。
4.2. N-酰基衍生物
通过改变αGalCer的不饱和度长度和程度而产生的类似物N个-酰基取代基已被测试其激活iNKT细胞的能力。据报道，αGalCer中脂肪酸链的缩短会降低iNKT细胞激活的效力，而在链长较短的类似物中，IL-4与IFNγ的比率较高[59]. 筛选出了20个具有不同程度不饱和碳酰基链的化合物，这些化合物与鞘氨醇核心结构耦合，并观察到碳11和碳14不饱和的二烯酸类似物（αGalCer-C20:2；11,14-顺-二不饱和C20脂肪酸）产生了一种非常有效的类似物(). C20:2类似物诱导了Th2偏向的潜在抗炎细胞因子反应。对这种改变的细胞因子反应的分析表明，这是由于iNKT细胞激活所触发的下游级联反应的改变，包括抑制产生IFNγ的NK细胞的二次激活[60].
KRN7000的代表性N-酰基链类似物的结构。（A） 显示了五个糖脂诱导Th2-偏置iNKT细胞反应的例子。尽管结构差异很大，但它们都含有酰基链修饰，从而增加了极性，例如不饱和度、链截断或氧原子的并入。（B） 一种高活性类似物的例子，其中酰基链由芳香环终止。据报道，此类化合物是有效的iNKT细胞激活剂，并被建议支持更偏向Th1的细胞因子反应。参考文献见正文。
有趣的是，αGalCer-C20:2在加载到CD1d的要求方面与KRN7000有显著差异。尽管KRN7000需要CD1d的内胚层定位才能有效加载和呈现，但αGalCer-C20:2不需要这样做[60]. 最近，已描述了α-半乳糖基C18植物鞘氨醇碱的其他几个N-酰基衍生物，它们也显示出缺乏内体负荷需求，并刺激Th2-细胞因子偏倚反应。与KRN7000相比，这些化合物通常含有更多极性或更少疏水性的N-酰基取代，例如C20前列腺素B1链（αGalCer-PGB1）或花生四烯酸（αGarCer-C20:4）、饱和C10链（αGalCer-C10:0）或4-氟苯乙酸基（αGal Cer-4FPA）(). 这些发现表明，在细胞表面直接与CD1d相关而无需内胚体负荷的能力与iNKT细胞细胞因子产生极化至Th2偏倚的能力相关[73].
相反，已经描述了一些αGalCer的N-酰基衍生物，它们将细胞因子反应极化为相反的方向，其中干扰素γ的产生超过了IL-4的产生。据报道，当用于刺激人类NKT细胞时，将末端芳香环引入αGalCer的酰基链可诱导Th1偏向的细胞因子反应。脂肪酰基链含有6-苯基己基（C6Ph）、8-苯基辛基（C8Ph）或11-苯基十一烷基（C11Ph）基团的类似物显示出整体细胞因子生成的效力增强，可能存在Th1偏倚() [61]. 随后对酰基链中含有芳香环取代的αGalCer类似物进行的后续研究表明，这些类似物可以诱导强有力的Th1偏向细胞因子反应体内注射到小鼠体内时[65].
4.3. 糖苷键衍生物
αGalCer的一个类似物是α-C-GalCer，它引起了NKT细胞生物学家的极大兴趣，其中糖苷氧（极性氢键受体）被非极性CH取代2组。该类似物已被证明能在小鼠中诱导有效且持续的Th1细胞因子反应，并且在诱导小鼠抵抗疟疾和黑色素瘤转移方面的效力比KRN7000高1000倍。据推测，α-C键可增加脂质的稳定性，因为这种取代使其抵抗α-半乳糖苷酶的降解体内() [58].
KRN7000的代表性碳水化合物和糖苷键衍生物的结构。（A） 基于糖苷键取代的衍生物，包括KRN7000的原始C糖苷（带有亚甲基单元（-CH）的α-C-GalCer2-)取代糖苷键中的氧，以及GCK109，它是α-C-GalCer的高活性E-烯烃连接类似物。（B） 以碳水化合物修饰为基础的衍生物，用α-连接的葡萄糖、双半乳糖（Gal（α1→6）αGalCer）或与6'-脲基-6'脱氧-αGalCher连接的1-萘基取代半乳糖。（C） 一种以苏糖醇神经酰胺为代表的活性非糖苷衍生物。参考文献见正文。
最近测试了一组E-烯键C-糖苷类似物对人iNKT细胞的激活作用在体外据报道，它们是小鼠和人类iNKT细胞的有效配体，并可诱导Th1型偏倚反应。在这项研究中，通过在较短烷基链（化合物GK152）的尾部添加芳香环或在烷基链（混合物GK109和GK151）中添加烯烃链，进一步对E-烯烃类似物GK127进行了修饰，发现这些类似物与GK127相比诱导了更高水平的Th1细胞因子诱导() [63]. 建议在CH的位置插入E-烯烃连接剂2糖苷键可以将糖的位置固定在iNKT细胞TCR识别的最佳构象附近[63]. 此外，估计该类似物的E-烯烃连接体的空间排斥能远小于分别为αGalCer和α-C-GalCer的O-糖苷和C-糖苷连接体，因此在疏水CD1d槽的近端部分（预计适合）内引起的排斥较小[63].
与β-异头半乳糖神经酰胺不激活iNKT细胞的普遍印象相反，一项研究调查了四种酰基链长度不同的β-异头体的活性，结果表明其中两种，β-GCa12和β-GCa26，激活了NKT细胞体内与IFNγ和IL-4的诱导有关。尽管发现这些类似物的效力不如αGalCer，但它们能诱导NK细胞的反式激活[74]. 然而，另一项研究表明，β-异丙基GalCer激活NKT细胞，但该研究未能找到NK细胞反式激活的证据[75].
4.4. 碳水化合物改性衍生物
对小鼠脾脏iNKT细胞刺激试验中多种糖苷类似物的分析表明，α-葡糖神经酰胺（αGlcCr）的活性与αGalCer的活性相似(). 由于αGlcCer和αGalCer仅在其4-羟基上有所不同，这表明糖的4-羟基构型对生物活性并不重要。相反，与αGalCer或αGlcCer上的赤道键相比，轴向配置中含有2-羟基的α-甘露糖神经酰胺（αManCer）没有显示出任何活性，表明糖部分上2-羟基配置的重要性[52]. 还合成了一些二糖类似物，并对其iNKT细胞激活特性进行了测试。在一项研究中，使用平板涂层小鼠CD1d在无APC T细胞刺激系统中分析了KRN7000的两种双半乳糖衍生物Gal（α1→2）αGalCer和Gal（β1→6）αGal Cer对CD1d的反应，以确定是否需要加工碳水化合物才能被CD1d呈现。在这个无细胞呈现系统中，Gal（α1→2）αGalCer确实不能刺激NKT杂交瘤细胞，而Gal（a 1→6）αGal Cer诱导的刺激与KRN7000相似(). 利用完整APC的表达，Gal（α1→2）αGalCer的表达依赖于CD1d向溶酶体的转运以及溶酶体α-半乳糖苷酶A的存在，以生成单糖表位[76]. 本研究确立了低聚糖酶处理可能与某些类型的CD1d抗原相关的原理。
已测试了几种经半乳糖6'位修饰的KRN7000类似物激活小鼠iNKT细胞的能力。其中6′-O-甲基化类似物RCA-61被发现是小鼠IFNγ的强诱导剂体内[77]. 通过在半乳糖的C6位置引入乙酰胺基团和顺式高可溶性类似物KRN7000的酰基链中的双键（PBS57）被证明比KRN7000更有效地激活人类和小鼠NKT细胞[78]. 半乳糖6'-OH是唯一不参与αGalCer和CD1d之间任何氢键的糖醇，这一事实促使在该位置进行更精细的修饰合成类似物，目的是潜在地实现CD1d和己糖环6'位置取代基之间的更多相互作用。有鉴于此，我们合成了一系列6′-脱氧半乳糖神经酰胺类似物的6′-酰胺和6′-脲基类似物，并对其刺激系统细胞因子反应进行了测试[62]. 尽管功能分析非常有限体内小鼠活性功能筛选显示，6'-酰胺衍生物诱发了不同水平的血清细胞因子，与iNKT细胞刺激活性一致，并倾向于诱导对IFNγ的偏倚，相对于KRN7000，IL-4分泌减少。6’-脲基类似物（例如Trappeners报道的化合物19等。[62]，具有与6'-脲基-6'脱氧-αGalCer相连的庞大1-萘基；)通常显示IFNγ刺激相当于或可能大于KRN7000，IL-4生成减少，也表明Th1偏向的细胞因子反应。这些化合物代表了潜在的有前途的Th1型iNKT细胞激动剂，将对进一步详细的免疫学分析产生极大的兴趣。
随着发现，在位置2和3处的阳聚氧和羟基之间的氢键对于极性头部基团与CD1d的结合很重要，非糖苷类似物含有我-苏式将半乳糖残基在C2和C3的构型与KRN7000进行比较。其中一种苏糖醇酰胺类似物诱导的细胞因子水平低于KRN7000，树突状细胞杀伤更少，并且对模型抗原也显示出佐剂活性() [79].
5.NKT细胞识别不同配体的分子基础
NKT细胞反应的一个显著特征是可以识别的不同脂质结构的范围，因为这些细胞的TCR和涉及的单个抗原提呈分子相对缺乏多样性。小鼠和人类CD1d的晶体结构清楚地显示了这些蛋白质能够结合并呈现各种脂质配体的基本机制。CD1d的膜远端α1和α2结构域包含一个疏水性配体结合位点，该位点由两个相连的囊袋组成，命名为a'和F'[80]. αGalCer与小鼠和人CD1d复合物的晶体结构证实，该结合位点由结合配体的脂尾占据，如αGalCer，这些脂尾与结合槽的非极性表面之间的疏水相互作用主要促成了结合。在αGalCer结合的情况下，hCD1d的A'口袋被酰基链填充，F'口袋被鞘氨醇链填充[81]. mCD1d与最活跃的合成类似物硫苷（顺-四碳烯基硫苷）的配合物的晶体结构表明，较长的脂肪酸链完全占据了A'口袋，而鞘氨醇链由于凹槽中心的精确氢键而填充了CD1d结合凹槽的F'口袋[82]. mCD1d与αGalCer短链（C8）形式的PBS-25复合物的晶体结构显示出类似的脂质结合方向，也显示了a'囊的远端存在“间隔脂质”[42]. 在mCD1d与鞘氨醇α-半乳糖醛酸神经酰胺复合物晶体结构的a’囊中也发现了与类似间隔脂相一致的密度[83]，以及mCD1d与推定的自身糖脂抗原iGb3复合物的晶体结构[35]. 存在这样的间隔脂质来填充CD1d凹槽中的空白区域可能是一种一般机制，通过这种机制可以稳定脂质与相对较短的烷基链的结合，从而进一步增加可以呈现的不同脂质结构的范围。
CD1d对结合脂质配体暴露部分的定位以及TCR对这些配体的识别也具有相当大的灵活性。正如hCD1d与αGalCer复合并结合到iNKT细胞TCR的三元复合物的晶体结构所强调的那样，该抗原的α-异聚半乳糖基团通过氢键网络紧密地固定在CD1d蛋白的表面[84]. 这使得TCR能够非常接近CD1d的表面，导致蛋白质之间的多个直接接触区域。相反，硫酰化物或iGb3的β-连接糖由于其β-连接而似乎向上突出并远离结合袋，并且高度暴露于TCR的识别[35,42]. mCD1d与磷脂酰肌醇二芒苷复合物的晶体结构也表明了碳水化合物基团远离CD1d表面的类似投影[85]. 在这种情况下，TCR接触可能主要与结合抗原的碳水化合物基团接触，并且与CD1d表面的直接TCR相互作用可能有限或相对不重要。在C糖苷α-C-GalCer的情况下，αGalCer糖苷键（极性氢受体）的氧原子被非极性CH取代2不能参与氢键。这被认为是导致糖脂在CD1d凹槽中的位置不同，从而改变复合物的结构及其对iNKT TCR的亲和力，也可能允许半乳糖和神经酰胺之间的糖苷键自由旋转[58]. 这些发现突出了iNKT细胞TCR的非凡灵活性，尽管其多样性相对有限，但似乎能够实现不同的识别模式，从而能够对广泛的CD1d呈递配体作出反应。
6.配体结构控制NKT细胞反应的机制
iNKT细胞能够产生明显不同的免疫反应，从刺激保护性免疫到产生免疫耐受。尤其是在对αGalCer结构变体的反应的情况下，糖脂抗原的结构可以对产生的iNKT细胞反应的性质产生深远的影响。这一点在许多关于不同αGalCer类似物可产生的不同类型细胞因子的研究中显而易见，这些细胞因子包括Th1和Th2型细胞因子的混合物（例如，与KRN7000混合）、更纯的Th2样反应（例如，使用OCH或αGalCer-C20:2）或纯的Th1样反应（如，与α-C-GalCer混合）。尽管最近有许多研究解决了这一重要问题，并且一些假设现在正在受到关注，但对刺激性质不同的iNKT细胞反应的机制仍知之甚少。
6.1. TCR亲和力与iNKT细胞反应的控制
将KRN7000与纯Th2型激动剂OCH进行比较的初步研究表明，直接假设iNKT细胞TCR的亲和力可能是决定反应质量的关键因素。尽管KRN7000生成的CD1d复合物具有较高的TCR亲和力，但很明显OCH生成的复合物亲和力明显较低。携带截短鞘氨醇类似物OCH的人和小鼠CD1d分子对iNKT细胞TCR的亲和力较低[86,87]. 利用表面等离子体共振测量可溶性人iNKT细胞TCR与负载αGalCer类似物的hCD1d的结合，平衡解离常数（Kd日)TCR与类似OCH的C9鞘氨醇类似物的配合物的结合比αGalCer-C26:0的配合物大约两个数量级[87]. 最近，OCH负载的mCD1d四聚体的TCR结合亲和力比αGalCer-C26:0负载的mCD四聚体至少低一个数量级，而hCD1d四聚体的亲和力太低，无法测量[73].
基于弱结合，提出了一个亲和阈值模型来解释Th2细胞因子的偏倚活性[64,87]. 该模型预测，KRN7000等配体诱导的高水平持续IFNγ生成是TCR高亲和力相互作用的结果，这导致了不同于识别弱激动剂（如OCH）的细胞内信号传导[57]. 沿着这些路线，一项研究报道转录因子c-Rel公司它属于转录调节因子NF-κB家族，是IFNγ释放的关键成分，由KRN7000而非OCH刺激的iNKT细胞诱导转录[64]. 此外，在酰基或鞘氨醇尾部带有芳香环的αGalCer合成类似物刺激了在体外与αGalCer相比，Th1-细胞因子/趋化因子诱导、TCR激活和人iNKT细胞扩增显示与TCR结合的亲和力更高，并诱导CD3ε、ERK1/2或CREB磷酸化[65].
然而，使用四聚体结合分析和表面等离子体共振来评估iNKT细胞TCR与许多其他糖脂配体结合的研究，并没有一致支持简单的TCR亲和阈值模型来解释所观察到的细胞因子反应类型的变化。例如，发现αGalCer-C20:2类似物与mCD1d或hCD1d络合时具有结合亲和力，这与负载αGalCer-C26:0的络合物的结合亲和力非常相似，该类似物产生与OCH刺激相似的Th2型细胞因子偏倚[73,87]. 最近对其他Th2-偏置类似物的研究表明，这些类似物对小鼠和人类iNKT细胞TCR具有一系列结合亲和力，通常介于OCH和KRN7000之间，从而证明Th2-偏置相似物对iNKT-TCR具有低、中或高亲和力[73]. 因此，虽然TCR亲和力可以解释iNKT细胞反应质量的某些方面，但这似乎不是唯一涉及的因素，甚至可能不是强效Th2-偏置αGalCer类似物（如αGalCer-C20:2）的主导因素。
6.2. 按替代类型APC呈现
另一种被认为可以解释不同糖脂抗原反应产生的细胞因子的不同模式的可能性与这些抗原的摄取和呈现的差异有关。研究表明，KRN7000主要通过细胞外脂质携带蛋白（如载脂蛋白E）促进的一个过程被内吞摄入后，被装载到CD1d中[88]，并且负载量取决于酸性pH和脂质转移蛋白（LTP），如皂苷和GM2激活蛋白[89–92]. 然而，发现诱导主要Th2反应的KRN7000的N-酰基变体αGalCer-C20:2不需要任何这些因素，因为它可以直接加载到表面CD1d中，这表明这些差异可能导致Vα14 iNKT细胞活化结果的定性和定量变化[60]. 最近的一项研究发现，CD1d的直接细胞表面负载特性是多种Th2-偏置类似物的一般特征。所有这些脂质都由APC快速提供，并且能够与细胞表面CD1d分子结合，而不需要细胞内CD1d负载，这与KRN7000不同，后者需要细胞内负载，并且提供速度慢得多[73].
大多数或所有Th2-偏置αGalCer类似物的一般特征是，它们要么具有显著缩短的N-酰基链，要么包含极性取代，例如N-酰基中的双键或氧原子。与αGalCer-C26:0相比，这些结构属性有助于增加极性和降低疏水性，可能导致溶解度增加，从而更容易进入细胞表面表达的CD1d分子的脂质结合位点[73]. 有趣的是，最近的一项研究表明，酰基链相对较短的αGalCer类似物实际上被排除在晚期内体的细胞内负荷之外，即使它们被有效地运输到该位点[93]. 这为此类糖脂抗原直接在细胞表面负载CD1d提供了极强的偏向性().
αGalCer类似物刺激偏置细胞因子反应的机制模型。αGalCer类似物，如KRN7000（以红色显示）产生由Th1和Th2型细胞因子组成的混合细胞因子反应的细胞因子在与细胞外脂质载体蛋白（如ApoE）结合后被内吞，并在细胞内装载到CD1d中，该过程由低pH值和脂质转移蛋白（如GM2激活蛋白（GM2A））的存在促进和皂苷。这些细胞内生成的CD1d-脂质复合物被转运到质膜上的脂筏微域，激活强烈且持续的iNKT细胞反应，其特征是Th1和Th2型细胞因子与显著且持续的IFNγ生成的混合物。注意，在这种情况下产生的大多数IFNγ很可能不是活化的iNKT细胞的直接产物，而是由NK细胞的二次活化产生的。相反，快速加载到表面CD1d中的糖脂（以绿色显示）可激活iNKT细胞，诱导以Th2型细胞因子为主的反应，而不会刺激IFNγ或其他促炎Th1型细胞因子的长时间分泌。这种类型的糖脂从晚期内体和溶酶体中的CD1d中卸载，因此含有这些糖脂的细胞内复合物被抑制形成，因此不会被转运到质膜脂筏中。TGN，跨高尔基网络；内质网。有关更详细的解释和参考，请参阅正文。
KRN7000与大多数或可能所有Th2-偏置型αGalCer类似物之间APC对抗原摄取的需求差异表明，后者可能优先由非吞噬细胞CD1d呈现+APC，如B细胞。不同类型的APC呈现KRN7000和Th2偏置糖脂，可能是因为缺乏作为Th2偏置激动剂主要APC的细胞类型上的基本共刺激分子，从而导致细胞因子产生的不同模式。这个假设得到了一个在体外比较DC或CD1d刺激的人iNKT细胞克隆反应的分析+雪旺细胞作为APC[12]. 此外，一项关于小鼠iNKT细胞反应的研究发现，B细胞表达KRN7000导致细胞因子产生倾向于相对于IFNγ分泌增加IL-4[94]. 然而，最近的其他研究表明，CD11c+DC可能是αGalCer类似物Th2-偏置类似物以及KRN7000的主要APC类型[73]和CD11c的耗尽+细胞导致iNKT细胞对所有αGalCer类似物的反应丢失或显著减少，至少在在体外小鼠脾细胞培养（S.Porcelli，未出版）。
6.3. CD1d的脂筏定位和iNKT细胞反应的改变
已经证明，一部分质膜CD1d分子定位于洗涤剂不溶性的质膜微域，也称为脂筏[95–97]. 最近的一项研究表明，由KRN7000在细胞内装载的mCD1d分子积聚在APC质膜上的脂筏中，而装载Th2-偏置类似物αGalCer-C20:2或αGalCer-C10:0的mCD1主要位于脂筏外[73]. 鉴于已知脂筏结构域参与细胞信号传导，这表明脂筏相关呈现的程度可能是控制iNKT细胞刺激结果的重要因素。这种想法在肽特异性MHCⅡ类限制性T细胞的研究中有很强的先例，对于这种T细胞，筏相关的呈递有利于Th1反应，而筏外的MHCⅡ级分子呈递则刺激Th2反应[98]. 因此，糖脂配体的结构依赖性分选优先加载到脂筏或非脂筏区域的CD1d分子中，这可能是一种重要的机制，可引导iNKT细胞活化朝向促炎性（Th1和Th2混合型）或耐受性（纯Th2型）反应().
8.结论
CD1d可用于激活NKT细胞的脂质和糖脂配体的储备在数量和复杂性上继续增加。这里回顾的当前可用数据强调了NKT细胞反应的显著灵活性，它允许通过使用单个抗原提呈分子和相对低变异性的TCR集合来识别许多不同的抗原。尽管我们对不同糖脂结构能够刺激不同iNKT细胞反应的机制的理解尚不完善，这一研究领域的不断发展有可能使激动剂的设计成为可能，这将允许更精确地控制这些淋巴细胞的许多潜在活性，以用于广泛的应用。
致谢
作者得到了NIH/NIAID（AI45889和AI063537）的资助，以及比尔和梅琳达·盖茨基金会艾滋病疫苗发现合作基金的资助。
脚注
出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。
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