中的端接修复机制大肠杆菌

摘要

DNA双链断裂（DSB）是推动基因组进化的强大力量。在哺乳动物细胞中，大多数DNA重排和插入是由普遍存在的DSB修复机制，即非同源末端连接（NHEJ）引起的(1,2). NHEJ的主要进化优势在于它能够连接不相关的DNA末端，并在不具有同源性的序列之间创建新的基因组组合。与低等真核生物中较简单的装置相比，NHEJ装置的复杂性在高等真核生物（其中有几个蛋白质与断裂端的加工和突触有关）中增加。“核心”成分Ku70、Ku80、依赖DNA的蛋白激酶催化亚单位和复合连接酶4/XRCC4，以及其他蛋白质，包括Cernunos/XLF和Artemis，致力于确保高效NHEJ(2)也与哺乳动物中DSB介导的Ig基因重排的修复有关(三). 最近，真核生物中描述了替代性末端连接机制（A-NHEJ）、Ku-、Ligase4-、XRCC4-或DNA-PK-independent，这些机制的效率和/或准确性低于经典NHEJ(4 –8). 值得注意的是，在哺乳动物中报告的A-NHEJ与淋巴瘤的致癌易位有关(4,7,8).

与真核生物不同，细菌对NHEJ的熟练程度较低或缺乏NHEJ(9). 一些细菌，包括系统发育距离较远的细菌分枝杆菌属和枯草芽孢杆菌拥有由两种蛋白质组成的基本NHEJ机制，即多功能ATP依赖连接酶D和Ku(10,11)共同保护、加工和连接DNA末端。细菌NHEJ，其机制通过对转染到细菌中的线性化质粒的修复研究确定(10,12)在非分裂期（休眠期和静止期、干燥期），可以促进DSB的存活分枝杆菌属(13,9)和孢子形成枯草杆菌(14,15). 事实上，在这些条件下，同源重组（HR），即依赖同源序列存在的细菌修复机制，由于细菌染色体数量有限，预计在很大程度上无效。

其他细菌，如流行的肠道共生菌大肠杆菌其中Ku-like和Ligase-D-like蛋白未被发现，通常被认为是无终接的(9)并且仅依赖重组介导的机制来修复DNA断裂并整合外源序列。的确，大肠杆菌用作其他细菌NHEJ实验的阴性对照(16). 在这里，我们调查了大肠杆菌通过末端连接修复DSB，独立于保守的同源重组，以及这是否影响其基因组的进化。

结果

NHEJ在细菌中的发生最终通过分枝杆菌属在体内和通过修复事件的分子分析修复DSB底物(10,12). 我们采用了类似的策略来分析最终加入大肠杆菌将各种DSB底物（pSK质粒线性化以产生非互补末端用于最终处理）输送至大肠杆菌测试端部连接，并在修复后进行分子分析(图1A类–C类). pSK-Cm质粒，其介导的氯霉素（Cm）抗性基因在两个DSB形成后被移除，用于确定相容钝端的准确修复事件(图1B类; 根据参考修改。12). 我们表明实验室（TG1）和致病性（CFT073，536）大肠杆菌菌株通过桥接DNA末端修复DSB，频率为0.35–3.90×10⁻⁵，其中高致病性泌尿系毒株CFT073表现出最高的效率(图1D类).

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图1。

病原学和实验室的端接大肠杆菌菌株。(A类和B类)端接用质粒基板。五个具有不相容端部的基板（用红色横条交叉；5′外伸、3′外伸和钝端的组合）和一个具有兼容端部的基底(生态RV）。强调了微同源性。灰色箭头表示DNA合成的方向。(C类)实验范式。线性化质粒（开环），在大肠杆菌，被准确修复（再循环）（仅在相容的DNA末端，完整的圆圈）或不准确修复（在每种DNA末端，用方框圈起来）。十字表示端接基板的退化和损失。(D类)致病性（菌株536，CFT073）和实验室（TG1）的末端连接大肠杆菌菌株。两个星号，对≤0.01，根据学生的t吨测试。(E类)修复效率与DNA末端的类型和同源重组蛋白RecA无关。在没有RecBCD核酸外切酶的情况下提高质粒终接效率（减少底物降解）。(F类)维修事件的分布。上x个轴表示精确事件或删除大小（∆）。误差条（当不可见时，它们小于绘制的线）表示两到四个独立实验的SD。(G公司)野生型和照明与之前分析的TG1菌株相比，允许温度（30℃）和非允许温度（42℃）下的菌株。这个照明突变体的末端连接受损两个数量级。基本准确的维修事件发生在照明应变。两个星号，对≤0.01，根据学生的t吨测试。(H（H）)野生型和野生型修复事件的分布发光二极管突变菌株。

修复事件的克隆分析显示，令人惊讶的是，末端连接的效率大肠杆菌与基板端部无关(图1E类). 此外，101个连接点的测序显示，修复在大多数情况下是不可靠的，其特征是广泛的双向末端切除（100/101），大量使用微同源性（1-9个核苷酸，大多<3nt），以及缺乏DNA合成(图2和图S1)与细菌NHEJ形成鲜明对比(10,12)，请参见下文。因此，一种与NHEJ不同的精细末端连接活性，我们称之为替代末端连接（A-EJ），在NHEJ缺乏的细菌中起作用。A-EJ产生的分子连接不同于细菌NHEJ（在分枝杆菌属) (12)其特点是大量非模板化核苷酸添加（NHEJ中8/21，A-EJ中0/101），频繁的单向切除（NHEJ9中9/21，A-EG中0/01），以及不使用微同源性进行缺失修复（NHEJ0中0/21，A-EW中95/101）。我们还观察到DSB在兼容端的忠实连接，在这里测试的致病菌株中具有特别高的保真度（CFT073中为82.6%，536菌株中为71.4%，TG1中为9.8%，实验室菌株JJC74中为1.4%，见下文）。考虑到这些菌株之间不同的修复效率，在这里测试的致病菌株中，准确事件的效率至少高出3到38倍(图1F类). 序列分析(图S2)揭示了在致病菌株中，准确的事件取代了TG1中观察到的涉及微缺失（1-10 bp）和缺失>1000 bp的突变修复。这一发现表明，一些菌株携带改进的A-EJ机制，通过限制短程和长程核酸外切酶活性来促进精确连接。CFT073菌株已经完全测序，但该菌株似乎没有Ku-like蛋白或其他已知NHEJ因子编码(17). 然而，与K12衍生实验室菌株相比，CFT073的基因组包含插入岛(17)，它可能编码促进最终连接的未知蛋白质。

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图2。

A-EJ维修不同类型的DSB。(A类)直方图表示与野生型和记录A⁻（在两种情况下，也在记录BCD ⁻)大肠杆菌. “n个“是已排序事件的数量。(B类)顺序A-EJ维修事件总结。对于每个基板，显示了接头的总数及其分为四类的分类。预计仅对兼容端（EcoRV）进行精确修复。报告每个数据集依赖微同源性的修复连接的百分比。斜杠表示不适用。

为了进一步研究A-EJ的机制，我们分析了TG1的端接修复记录A ⁻和记录BCD ⁻菌株。我们报告A-EJ的效率和连接类型（测序、，n个=86）独立于重组因子RecA，表明不涉及重组依赖机制(图1E类和图2). 然而，在没有具有核酸外切酶活性的RecBCD复合物的情况下，A-EJ受到大约200倍的刺激。我们推断，这种增加是由于基质降解和损失减少所致。连接的测序显示，所有修复事件在记录BCD⁻菌株(n个=52），与野生型和记录⁻菌株，尤其是200–800 bp缺失的特定事件(图2和图S1)，证实当缺乏recBCD复合物时，有更多的底物可用。因此，A-EJ的效率似乎取决于对核酸外切酶活性的控制。突变株产生的连接类型在其他方面与WT株非常相似，即与广泛双向末端切除相关的突变修复（138/138，累积记录A⁻和记录BCD⁻)大量使用微同源性（129/138）和有限的DNA合成（1/138）。

为了进一步了解其机制，我们分析了A-EJ中涉及的DNA连接酶活性。在缺乏依赖ATP的LigD和LigC的情况下，大肠杆菌可以依赖NAD⁺-依赖性连接酶LigB和必要的LigA，一种参与连接冈崎片段的酶，用于连接DNA断裂。在没有LigB的情况下修复线性化质粒(亿立方英尺⁻菌株）表明该连接酶不参与A-EJ(图S3A类). 相反，对温度敏感(时间)的突变利加(18)（菌株JJC75），导致a-EJ在允许和非允许温度下均减少2 log(图1G公司)与携带WT的亲本菌株（JJC74）和TG1相比利加(表S2和图S4). 因此时间即使在允许的温度下突变也会损害LigA的末端连接活性。有趣的是，这个突变体中的残余连接事件基本上是准确的(图1G公司和H（H）和图S5)它们在WT JJC74菌株中出现的频率与准确修复的频率一样高。这些结果表明，LigA是影响A-EJ保真度的重要因素。

为了评估A-EJ是否也修复染色体DSB，我们将其插入细菌的染色体2 I中-Sce公司I内切酶位点被2.9 kbp分开，在相同（相容端）或相反（不相容端）方向，并位于自杀盒侧面(图3A类–C类). 盒式磁带由自杀基因组成立方分贝在阿拉伯糖（Ara）诱导启动子和aadA7型编码对大观霉素（Sp）的抗性。内切酶I的表达-Sce公司我生成了两个DSB，结果删除了自杀磁带。染色体的修复可以使Sp敏感细菌在Ara平板上生长。在NHEJ高产哺乳动物细胞中，修复两个远距离染色体DSB的效率远低于修复单个DSB（频率为10⁻²-10⁻⁶和大约10⁻¹）(19,20,21,22). 然而，这一观察结果，包括中间序列的丢失和新连接的形成，清楚地表明了端接的发生。

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图3。

染色体DSB的A-EJ。(A类)实验范式。质粒编码的限制性内切酶（剪刀）在细菌染色体上的自杀盒（矩形）两侧产生两个DSB。用质粒pUC19RP12（编码I）转化细菌-Sce公司I内切酶）或质粒pSK作为对照。端接导致自杀盒丢失，并在选择性培养基上生长。(B类)自杀录音带，插入不重要的元基因两侧有内切酶I的两个限制位点-Sce公司I（5′端为粉红色，3′端为蓝色）方向相同（磁带A，上部)产生兼容端或相反方向（磁带B，下部)，生成不兼容的端。(C类)相容和不相容DNA末端的序列。(D类)修复效率与DNA末端的类型和同源重组蛋白RecA无关。对根据学生的t吨测试。

我们在中展示了这一点大肠杆菌，远端DSB通过端接进行修复，频率为2.6–3.2×10⁻⁵(图3D类). 互补和非互补染色体末端的修复效率相当，这与质粒证实了这一发现。存活细菌修复事件的分子分析和测序显示，广泛切除约40 kbp，并通过微同源性连接(图4). 在一侧，最大的切除停止在43.6 kbpdnaB公司编码复制DNA解旋酶的基因，另一侧为2.7kbp，之前rrlE公司编码23s rRNA的基因。rRNA是高度转录的基因，其中一个基因的缺失会导致生长速度下降(23). 因此，切除界限似乎更多地受遗传限制而不是受定向核酸酶活性的影响。

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图4。

A-EJ后的修复导致基因组重排。(A类)染色体中与A-EJ相关的基因组序列频繁丢失。切除大小在记录BCD ⁻ 大肠杆菌.星星，准确的修复事件；“S”顺序连接。(B类)精确和不忠实连接的排序。连接的特点是三到八个核苷酸的微同源性。错误事件与删除相关（0.4–12.3 kbp）。下半部分表示发生在单个DSB的连接事件，并与2.5kbp的缺失有关，该缺失切除了大部分自杀盒，产生Ara⁺细菌。

染色体DSB的修复效率在记录A ⁻细菌(图3D类)，表明在这个过程中没有重组依赖机制的参与，质粒的修复也是如此（见上文）。在染色体中，大多数底物切除都不是致命的，修复的效率在记录BCD ⁻菌株要么不受影响（互补端），要么减少（非互补端）可能是由于非编码底物的低效降解导致寻找其他可连接端(图3D类). 修复中的接头记录A ⁻和记录BCD⁻大肠杆菌与WT细菌相似，微同源性为3–8 bp，桥接0.4–12 kbp的DNA末端(图4B类). 在互补端观察到一些准确的事件（3/34，9%，野生型和突变株加在一起），导致NHEJ高产哺乳动物细胞中两个染色体DSB修复的百分比低四倍（9/26，35%）(21). LigB失活对染色体末端的连接效率没有影响(图S3B类和C类)，因为质粒中的A-EJ也是如此（见上文）。这些发现表明，A-EJ可以忠实地重新连接相距2.9 kbp的DNA末端。总之，A-EJ是一种不同于NHEJ的重组依赖性修复机制(图5A类).

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图5。

用A-EJ插入外源序列(A类)A-EJ的建议模型(赖特). 虽然NHEJ招募同二聚体Ku（椭圆）和LigD（圆）来保护、成熟和突触DNA末端，但A-EJ依赖于RecBCD核酸酶/解旋酶复合物（蓝色不完整圆）降解DNA末端。微同源区域（1到9个核苷酸，红色条带）可以促进DNA末端之间的突触。结束语可能依赖于基本的LigA。(B类)A-EJ通过精确连接或复杂的最终处理（红色字母：新合成的碱基；对角字母：切除的碱基）插入一个外源的无关序列[AR=抗生素（卡那霉素）抗性基因]。已排序七个事件。在这种情况下，可以想象，外源基因的成功表达还可能与依赖于外切酶的原始启动子的移除和靠近功能性宿主启动子的插入有关。

在真核生物中，NHEJ促进外源或异源DNA序列插入基因组（病毒、转座子、线粒体DNA等），从而促进基因组进化(1,24,25). 在细菌中，外源序列通过多种同源性依赖机制整合，这些机制选择与基因组同源的区域或通过位点特异性重组(26). 我们检查了A-EJ能否在DSB插入DNA。为此，我们用编码抗生素卡那霉素耐药性的DNA片段转化了细菌，并且与目标序列没有同源性。我们证明，该DNA片段插入野生型质粒以及记录A⁻和中记录BCD⁻菌株(表S3). 7 Km的排序^R（右）菌株表明，插入是通过精确的连接或复杂的末端处理过程进行的，这不仅揭示了有限的末端切除，也揭示了间隙填充(图5B类). 因此，大肠杆菌可以通过末端连接整合不相关的非同源外源序列。

讨论

流行的观点是大肠杆菌没有连接DNA末端的能力(9)最近有报道称，“如果真是这样，分子克隆就会有不同的故事”(27). 为此，大肠杆菌用作NHEJ实验的阴性对照(16). 然而，过去25年中报告的一些事件可能归因于终止加入大肠杆菌尽管当时提出了其他机制。例如，自发重组相关缺失在大肠杆菌基因组，与不同大小同源区域相关(28). 作者发现同源性大小和缺失事件频率之间存在直接关系，并提出了一个基于DNA复制过程中（短）重复序列之间滑动的模型。此外，重组依赖性生存大肠杆菌报道了一种对术语敏感的核酸内切酶的活性(29). 修复事件尚未确定，但存活率取决于DNA连接酶的存在(29). 最近，Meddows等人(30)显示可诱导DSB通过微（2-5nt）或更长（16-42nt）同源性进行染色体连接，并且在缺乏同源性的情况下，主要在细菌穿插镶嵌元素（BIME）处，这是一类沿着染色体分布的重复序列。BIME未发生的三起事件归因于最终退火或不同（未确定）机制。

这里我们展示了实验室和致病性大肠杆菌菌株具有一种独特的末端连接机制，我们称之为a-EJ，它修复DNA断裂并执行精细连接，独立于NHEJ-Ku和LigaseD蛋白。不同于分枝杆菌属NHEJ公司(12)，A-EJ的特点是频繁的双向切除，大量使用微同源性和罕见的连接处非模板DNA合成。这些发现得到了染色体DSB末端连接分析的证实大肠杆菌表明A-EJ与NHEJ明显不同。

对修复连接的分析表明，在A-EJ中，由于缺乏类Ku蛋白而未受保护的DNA末端大多发生降解并产生缺失。末端降解主要但不完全取决于RecBCD复合物的核酸外切酶活性。末端切除的程度会影响A-EJ的效率，如在记录BCD ⁻与WT菌株相比，由于突变体中底物降解减少。事实上，在我们的实验系统中，由于质粒复制和选择的关键序列被删除，DSB每个位点上经过数百bp以上切除的质粒被挑选出来。对于染色体来说，更大的缺失与存活是不相容的，至少在到达一个关键区域之前是如此，这就解释了对修复效率的明显缺乏影响记录BCD尽管突变型中的缺失通常比野生型短，但在兼容端的突变。重要的是，长基质（染色体）上的末端切除反过来通过发现新的微同源性来促进寻找新的可连接末端，从而有利于修复。这似乎确实是不相容DNA末端的情况，这种末端在保护性野生型中比在记录BCD⁻应变。我们解释了RecBCD复合体对不相容染色体末端修复效率的影响，这是因为未经处理时未能连接这些末端，从而促进了RecBCD依赖性末端切除和新的同源性搜索。相反，在相容端，由微同源性介导的成功连接和/或多次连接尝试可能会限制DNA端的可用性以进行切除。在质粒中，与染色体不同，DNA切除会导致大量底物丢失（这与DNA末端的类型无关；见上文），RecBCD复合体会影响相容末端和不相容末端的修复效率。

质粒和染色体上的A-EJ不依赖于LigB，而LigA与连接过程密切相关。这个发光二极管突变体能够在允许的温度下密封冈崎碎片(18)尽管它的末端连接活性显著受损，这使得这两个过程在功能上至少部分解耦。我们的发现与温度敏感的观察结果一致利加突变体对紫外线诱导的DNA损伤异常敏感，即使在允许的温度下也是如此(31). 此外，在非允许温度下的端接活性与最初观察到的应变承载灯ts7(λ后⁻)能够在42°C下从线性噬菌体λ分子中形成共价环(18). LigA不仅是效率的关键因素，也是修复过程的准确性的关键因素。与这一观点一致，人们发现连接酶4可能通过保护DNA末端免受核溶解降解而影响哺乳动物细胞中末端连接的保真度(32).

A-EJ中大量使用的微同源性（93%的病例）支持这样一种模型，即两端的突触强烈依赖于DNA末端的粘附，而不是蛋白质驱动机制，正如Ku-dependent NHEJ在分枝杆菌属，其中几乎不需要微同源性(12). 然而，不能排除LigA或其他蛋白质在此阶段参与A-EJ。我们发现一个变种人利加在容易出错的修复中受到实质性影响，可能表明LigA在突触形成阶段与修复复合体相互作用。

似乎参与A-EJ的蛋白质也参与DNA复制和重组，这表明A-EJ是通过这些机制进化而来的。真核生物A-NHEJ中涉及DNA复制和其他修复途径的蛋白质也是如此(6,33). 有趣的是，A-NHEJ也不依赖于Ku-和连接酶4（XRCC4），与最终降解相关，并且强烈依赖于微同源性(4,5,7,8,21,34). 最后，A-NHEJ还使用NAD+连接酶。因此，人们很容易推测A-EJ是一种起源于细菌并在高等真核生物中保持的古老修复机制。然而，与A-NHEJ不同，A-EJ能够以可检测的效率对兼容端进行准确修复。

最后，A-EJ不仅不同于规范NHEJ，而且也不同于Ku-和LigD-独立NHEJ分枝杆菌属是一种可靠的修复机制，以端部密封而非端部加工为特征，严格针对3′悬挑(12). 据报道，最后一种机制的效率为10⁻⁵在同一生物体中，大约比NHEJ低1000倍（根据参考文献推断。12)，但类似于中的A-EJ大肠杆菌(表S4). 此外，A-NHEJ尤其是在哺乳动物的Ig（Ig）基因座上进行分析，其效率远低于经典NHEJ(4,8)，表明替代端接机构的整体效率较低。然而，Ku-independent A-NHEJ在非Ig基因座上与NHEJ一样有效，尽管精确度较低(5,21). A-NHEJ与经典NHEJ共存，NHEJ受损时检测到A-NHEJ。有趣的是，大肠杆菌似乎是唯一具有替代末端连接而不具有经典NHEJ的生物体。

在哺乳动物中，A-NHEJ与Ig位点的频繁易位有关(7,8)这表明，由于选择性末端连接引起的修复事件虽然罕见，但对基因组进化和细胞生存来说是不可忽视的。在缺乏关键NHEJ因子的情况下，染色体易位频率的增加突显了A-NHEJ对基因组重排和稳定性的影响(8,35). 我们的发现提出了A-EJ在大肠杆菌。与分枝杆菌属NHEJ，我们发现A-EJ大肠杆菌与指数阶段相比，早期平稳阶段的效率并不高(图S6B类) (13)表明A-EJ不能通过非分裂细菌中的同源重组在功能上替代DSB修复大肠杆菌，A-EJ治疗未通过重组依赖机制修复的DSB，从而使注定死亡的细菌得以存活，而这种情况的发生要么没有遗传信息，要么会丢失遗传信息。经典NHEJ在真核生物中的一个相关功能是通过整合异源序列促进基因组进化的能力(1,24,25). 在细菌中，获得了本质上相关的同源序列，这是由于重组依赖机制。值得注意的是，我们证明了这一点大肠杆菌可以通过A-EJ整合无关的非同源序列。这一过程为细菌基因组中的水平基因转移提供了一种替代策略，包括获得抗生素耐药性，它可能与基因组进化和大肠杆菌生存。

我们的研究结果表明，在没有经典NHEJ的情况下，也存在替代端接。我们推测大肠杆菌A-EJ可能是在高等真核生物中起作用的选择性末端连接的祖先，也可能存在于NHEJ产生菌中大肠杆菌真核生物中的A-NHEJ使用参与其他DNA处理途径的蛋白质，而更有效的NHEJ依赖于特定蛋白质。这些观察结果和NHEJ的系统发育分布表明，选择性末端连接在进化上先于NHEJ。最后，尽管A-NHEJ的效率低于经典的NHEJ，但它可以促进参与基因组进化和细胞生存的高等真核生物的基因组修改。同样，A-EJ整合外源序列的能力大肠杆菌有助于病原菌和共生菌在恶劣和快速变化的环境中的适应性。

材料和方法

补充材料

致谢

脚注

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