SUMO蛋白酶SENP6对内动粒组装至关重要

SENP6缺失细胞中MT组装与Aurora B激活

为了检测SENP6缺失细胞中k纤维的结构，我们用抗α-微管蛋白和CREST血清的抗体对细胞进行染色。SENP6缺失细胞中的纺锤体是双极的，MT密度与对照纺锤体相似(图2 C). 同时，我们在染色前对类似培养物进行10分钟的冷处理，以解聚未稳定附着在动粒上的MT。SENP6缺失的细胞显示了用于对齐染色体的健壮的k纤维(图2 D). 此外，SENP6缺失的细胞表现出正常的k纤维成分负荷，如HURP（肝癌上调蛋白；图S2;王尔德，2006)表明其组成与对照细胞的k纤维相当。对照细胞和耗尽细胞之间缺乏显著差异，这与失去SENP6后k纤维组装或稳定性的显著变化相矛盾。

在纺锤组装过程中，附着错误是经常发生的，有一些机制可以纠正syntelic（两个动粒都附着在一个单极上）和merotelic（一个单动粒附着在两个极上）配置(Kelly和Funabiki，2009年). 这些机制监测姐妹动粒对之间的张力，并依赖于CPC的组成部分Aurora B激酶。我们希望确定SENP6耗尽后，张力监测系统是否正常工作。为了检测Aurora B的活性，我们用monastrol处理对照组和SENP6缺失的细胞12小时，monastrol抑制驱动蛋白Eg5（驱动蛋白5），导致大多数细胞在有丝分裂时因联合体附着而停滞(卡普尔等人，2000年). 去除红曲醇30分钟后，用针对有丝分裂着丝粒相关驱动蛋白（MCAK）的磷酸特异性抗体进行蛋白质印迹，测定Aurora B活性水平，MCAK是一种表征良好的Aurora B底物(Kelly和Funabiki，2009年). 我们在对照细胞和SENP6缺失细胞中观察到磷酸化-MCAK的水平相当，这些细胞在使用特异性极光激酶抑制剂ZM447439治疗后丢失(图2、E和F). 这些结果表明，SENP6缺失的细胞能够识别对动粒的不适当MT附着，能够通过Aurora B激活做出反应，从而释放这种附着。此外，SENP6缺失细胞中未对齐的染色体缺乏冷稳定的k纤维(图2 D)表明同分体和单分体（只有一个动粒附着）的构型是相当不稳定的，进一步反对SENP6在跨动粒张力传感中的作用。

总之，这些发现表明，SENP6缺失细胞中k纤维组装和CPC激活的许多方面相对正常。我们的结果并没有排除这两个过程中的微妙问题，但这些问题本身并不足以解释SENP6缺失后观察到的有丝分裂缺陷。

CENP-H/I/K复合物缺失导致SENP6-缺失细胞缺陷

因为sumoylation以前与动粒结构和功能有关（综述见Dasso，2008年)，我们通过内外动粒成分的免疫定位详细检查了SENP6缺失细胞的动粒。我们对CENP-H/I/K复合体特别感兴趣：CENP-H/I/K复合体成员的缺失会导致多条染色体错位的有丝分裂停滞，但染色体的一个子集通常仍能在中期板上与冷稳定的kMT对齐(Cheeseman等人，2008年)，这与我们在SENP6缺失细胞中观察到的表型惊人相似(图1和​和2）。2). 我们通过免疫染色检测CENP-H和-I的状态。虽然这两种蛋白在对照细胞的动粒上都能清楚地检测到，但在SENP6缺失细胞的所有动粒上均无法检测到(图3). Western blotting显示，SENP6缺失细胞中CENP-I的总水平显著降低（参见图5 A)这表明它在动粒中的缺失反映了较低的蛋白质水平，而不仅仅是定位错误。

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图3。

SENP6缺失导致动粒中CENP-H/I/K复合物的丢失。（A和B）用对照或SENP6 siRNA处理HeLa细胞，并用DTB进行同步化。中期细胞被固定并用CREST血清和针对所示着丝粒蛋白、CENP-I（A）和CENP-H（B）的抗体染色。每个面板右下角的插图显示Hoechst 33342染色。其他插图显示所示区域的放大倍数。测定着丝粒蛋白的IFI。图表显示了中期细胞的平均±95%置信区间，如图所示(n个=100，对于双极性连接的姐妹动粒；n.d.=测量值与背景信号无法区分）。AU，任意单位。棒材，5µm。

CENP-H/I/K复合体促进了一些其他动粒成分的正确定位。我们推断，如果SENP6缺失细胞的表型主要是由于CENP-H/I/K复合物的丢失造成的，那么这些蛋白质的行为应该通过其他方式密切模拟CENP-H/I/K复合成分的扁平化。例如，CENP-O复合体的动粒负荷完全取决于它(Okada等人，2006年). 我们通过免疫染色检查了CENP-O的状态，发现如预测的那样，它完全不存在于动粒中(图4 A). 然而，与CENP-I不同，CENP-O仍然清楚地存在于耗尽的细胞中(图5 B)表明在没有SENP6的情况下，它会发生位移，但不会退化。

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图4。

SENP6缺失后动粒组成的变化。（A–E）用对照或SENP6 siRNA处理HeLa细胞，并用DTB同步48小时。固定细胞并染色动粒蛋白，如图所示：CENP-O（A）、Hec1（B）、Mis12（C）、CENP-F（D）和CENP-E（E）。同时对细胞进行着丝粒染色（CREST）。每个面板右下角的插图显示Hoechst 33342染色。其他插图显示所示区域的放大倍数。如图所示，在前中期细胞的动粒上以及在中期细胞的附着（对齐）或未附着（未对齐）动粒上测量蛋白质的IFI。图表显示平均±95%置信区间(n个=100，对于双极性连接的姐妹动粒；n个=40，对于未连接的错位动粒；***，P<0.0001；和*，P＜0.05，如图所示；n.d.=测量值与背景信号无法区分）。AU，任意单位。棒材，5µm。

Hec1复合体包含Hec1、Nuf2、Spc24和-25，它在kMT-动粒附着中起着关键作用(田中和德赛，2008年). Hec1复合物向外动粒的募集部分依赖于CENP-H/I/K复合物(Cheeseman等人，2008年). Hec1的总水平在SENP6缺失时没有变化，我们也没有观察到该蛋白的显著sumoylated形式(图S3;Montpetit等人，2006年). 然而，对中期细胞Hec1的分析揭示了两个有趣的发现(图4 B). 首先，SENP6缺失细胞对齐染色体的动粒上Hec1的水平大约比对照细胞低45%。其次，SENP6缺失细胞两极附近未对齐的染色单体显示出与动粒相关的Hec1的显著减少，大约比对照细胞中对齐染色体的动粒减少75%。后一项发现尤其引人注目，因为Hec1在G晚期被稳定地招募到动粒细胞上₂相位，因为其水平通常不会随MT附件而变化(Hori等人，2003年;DeLuca等人，2005年). 这些变化的幅度与Hec1复合物负载不足可能导致动粒附着缺陷的观点一致，特别是对于未对齐的动粒。

Mis12复合体包含Dsn1、Nnf1、Nsl1和Mis12；它与Hec1复合体协同作用，促进外动粒组装和MT捕获(Cheeseman等人，2006年). 在某些分析条件下，CENP-H/I/K组分的耗尽会导致Mis12复合物的明显定位错误，但在其他分析条件下不会(Cheeseman等人，2008年). 在SENP6缺失后，Mis12表现出与Hec1相似的再分配模式，尽管附着（14%）和未附着（52%）动粒上Mis12结合减少的幅度小于Hec1(图4 C). 同样，可以推测，Mis12复合体的不稳定负载发生在G晚期缺乏SENP6的情况下₂期，导致低负荷的动粒附着失败，从而导致纺锤体缺陷和有丝分裂阻滞。

CENP-F是一种定位于外动粒的大螺旋蛋白，与多种有丝分裂功能有关(Varis等人，2006年). CENP-F加载不需要CENP-H/I/K(Cheeseman等人，2008年). 诺康唑处理后，CENP-F染色在对照细胞和SENP6-缺失细胞的动粒上无法区分，而在未处理中期细胞的姐妹染色单体的对齐动粒上相似。SENP6缺失中期细胞中未对齐的姊妹对显示CENP-F积累水平略高于对齐的姊姊对(图4 D)这与之前的观察一致，即动粒附着后CENP-F水平降低(Varis等人，2006年). 这些发现表明，CENP-F加载在很大程度上独立于SENP6。因此，SENP6耗尽后CENP-O、Hec1、Mis12和CENP-F重新分布的情况都让人想起CENP-H/I/K复合物耗尽后的情况(Cheeseman等人，2008年). 这些发现与SENP6耗尽引起的缺陷反映CENP-H/I/K复合物不稳定性的概念一致。

CENP-E分布对SENP6耗尽不敏感

CENP-E是一种MT电机，位于外动粒上，在MT连接和主轴检查点控制中起作用(穆萨乔和萨尔蒙，2007年). CENP-E在有丝分裂的人类细胞中被sumoylated，其C末端结构域中的SUMO结合基序促进其向动粒的募集(Zhang等人，2008年). 我们分析了CENP-E在对照组和SENP6-缺失的前中期细胞中的分布，这些细胞经历了NEB但尚未形成稳定的kMT附着(图4 E). CENP-E在缺乏SENP6的细胞中的招募与在对照细胞中一样好或更好。中期，当大多数对齐染色体形成稳定的k纤维时，CENP-E与对齐染色单体动粒的关联在对照细胞和SENP6缺失细胞中相似(图4 E)，尽管由于沿着kMT染色，无法量化与动粒结合的CENP-E水平。值得注意的是，CENP-E负载对SENP6耗尽后动粒的附着状态作出反应(图4 E，右下角，将插图1与插图2进行比较），如前所述(霍夫曼等人，2001年).

除CENP-E外，人类BubR1和Nuf2也可以进行有丝分裂(Zhang等人，2008年). 我们没有观察到SENP6耗尽后，CENP-E、BubR1和Nuf2的sumoylated形式显著增加（未公布的数据）。因此，我们怀疑其他Ulps/SENP可能在有丝分裂中充当CENP-E、BubR1和Nuf2的解偶联酶。这一观察表明，sumoylation以多种不同的方式控制哺乳动物细胞中动粒的组装和功能。

细胞培养、siRNA-介导的缺失和药物治疗

在37°C和5%CO下，在补充有10%胎牛血清的DME中维持HeLa细胞及其衍生物稳定系₂根据制造商的说明，使用效应试剂（QIAGEN）进行质粒转染。从QIAGEN中获得了具有标准dTdT 3′延伸的抗SENP6（5′-AAGAAGTGAGAGAGATACAG-3′）或层粘连A/C（5′-AACTGGACTTCCAGAGAACA-3′）mRNA的双重siRNA。siRNA实验在6孔培养板或6或10厘米培养皿中进行。细胞以3×10的密度进行电镀^三/厘米²培养24小时，转染前立即用不含抗生素的DME冲洗一次。将2.5µl 20µM siRNA和7µl Lipofectamine RNAiMAX悬浮在0.5 ml OptiMEM（Invitrogen）的单独试管中。试管在23°C下保存7分钟，将两个试管的内容物混合，在室温下再保存25分钟，并添加到一个6厘米的皿中，其中含有4毫升不含抗生素的完整DME。其他培养皿也遵循相同的程序，但试剂也相应地进行了缩放。

为了通过DTB进行同步，在添加siRNA后添加2 mM胸腺嘧啶核苷。12 h后，用无胸腺嘧啶二甲醚清洗细胞一次，并在无胸腺嘧啶的情况下培养14 h。通过与2 mM胸腺嘧啶核苷孵育12 h进行第二块，然后再次在无胸腺嘧啶核素的二甲醚中洗涤释放。释放后10 h，约30%的细胞有丝分裂，检测有丝分裂表型。

在图5用SENP6或对照siRNA转染HeLa细胞。转染36 h后，向培养基中添加2 mM胸腺嘧啶核苷，并继续培养13 h。如有指示，在培养的最后一小时内添加20µM MG132。

极光B活性测定

用SENP6或对照siRNAs转染10-cm培养皿的HeLa细胞。转染36 h后，向培养基中添加40µM monastrol（EMD），并持续培养12 h。通过摇晃收集有丝分裂细胞，用冰镇DME清洗三次，并在6 cm的皿中镀上或不镀上2µM ZM447439（Tocris Bioscience）。30分钟后，在SDS样品缓冲液中溶解细胞。对细胞裂解物进行SDS-PAGE分析。使用磷酸化-MCAK特异性抗体进行免疫印迹，并使用红外成像系统（Odyssey；LI-COR Biosciences）量化信号。

免疫荧光、显微镜和图像分析

对于免疫荧光，细胞生长在聚-我-用0.5%Triton X-100在BRB80缓冲液（80 mM管道，pH 6.9，1 mM EGTA和5 mM MgCl）中预萃取赖氨酸涂层盖玻片1分钟₂)或在室温下用4%多聚甲醛在PBS中直接固定12分钟。用0.5%Triton X-100在TBS（10 mM Tris-HCl，pH 7.5和150 mM NaCl）中渗透细胞10分钟。用TBST（TBS+0.1%[vol/vol]Tween 20）洗涤后，在1%正常马血清中封闭细胞10分钟（Vector Laboratories）在TBST中，用1:200至1:500稀释在封闭溶液中的一级抗体孵育1小时。将盖玻片洗涤并与在封闭溶液中稀释为1:1000的二次抗体一起孵育45分钟。通过洗涤去除未结合抗体，并将细胞在100 ng/ml Hoechst 33258 DNA染色中短暂培养。最后，将盖玻片安装在Vectashield安装介质（Vector Laboratories）中。

在RT条件下，在配备100×平面彩色物镜的共焦显微镜（LSM510 Meta；Carl Zeiss，Inc.）上进行荧光显微镜检查。我们使用543 nm HeNe激光（5 mW输出；检测LP560 nm）检测Alexa Fluor 568标记的抗体。氩激光488 nm线（25 mW标称输出；检测BP 505–530 nm）用于分析Alexa Fluor 488标记抗体。Hoechst 33258图像是使用离子激光器的364-nm线拍摄的（Enterprise II ML UV；Coherent，Inc.；80 mW标称输出；检测BP 385-470 nm）。共聚焦显微镜软件（SP2 3.2版；卡尔蔡司公司）用于捕获图像。在所有图中，比例尺代表5µm。

使用ImageJ 4.1g软件（美国国立卫生研究院）对图像进行分析，并如前所述对动粒蛋白的荧光信号进行量化(豪厄尔等人，2000年). 简而言之，在动粒荧光点上标记了两个同心圆感兴趣区域（ROI），以确保可见信号位于较小的圆圈内。测量所有z切片的积分荧光强度（IFI）和两个ROI的面积。然后，使用以下公式计算IFI减去背景：特定IFI=Fs–BG=[（FL–Fs）/（AL–As）]x As，其中Fs=小ROI的IFI，FL=大ROI的IFI，As=小ROI的面积，Fs=大ROI的面积。如果特定动粒点的荧光信号跨越多个z切片，则将所有切片的特定IFI相加，以生成单个动粒点IFI。对100个不同的着丝粒点重复这一过程，保持特定着丝粒蛋白ROI区域的恒定。然后使用Open Office Calc（Sun Microsystems）对这些值进行统计分析，并生成图表。

CENP-I的免疫沉淀和免疫印迹

在图5 A，细胞在冰镇PBS中清洗一次，通过刮取200µl的裂解缓冲液（50 mM K-Hepes，pH 7.5，150 mM NaCl，2%Empigen BB，1µg HA–SUMO-2–乙烯基砜，20 mM碘乙酰胺，2µM AEBSF，和10µg/ml leupeptin，pepstatin和chymostatin）收集，并在冰上短暂超声处理。将细胞裂解物冷冻在液氮中并储存在−80°C或立即使用。100µg亲和纯化的兔CENP-I抗体与1 ml蛋白A结合磁珠（Invitrogen）结合，并与吡美酸二甲酯结合，并在pH 2.5的100 mM冰镇甘氨酸-HCl中洗涤三次。在23°C的洗涤缓冲液（10 mM K-Hepes，pH 7.5，150 mM NaCl和2%Empigen BB）中，将珠子在5%水解明胶中封闭30分钟，并在洗涤缓冲液中洗涤两次。将200µl细胞裂解液与50µl珠在4°C下孵育1 h。这些珠子在冰镇洗涤缓冲液中进行了三次5分钟的洗涤。用200µl 0.1 M甘氨酸-HCl洗脱结合蛋白，并立即用20µl pH 8.0的1 M Tris-HCl中和。向洗脱液中添加5µl 1%脱氧胆酸钠，并在4°C下用最终浓度为20%的TCA沉淀蛋白质过夜。TCA沉淀物在16000下离心克在4°C下保持30分钟，在−20°C丙酮中清洗，并在16000下重新离心克在4°C下保持30分钟。将颗粒在37°C下干燥，溶解在15µl样品缓冲液中，进行免疫印迹，并使用SuperSignal West试剂（赛默飞世尔科技公司）进行显影。

我们要感谢Maia Ouspenskaia和Maiko Furuta的技术支持，以及Micheala Serpe博士对奥德赛成像系统的帮助。我们还感谢卡拉·卢卡西维茨博士对手稿的批判性阅读。

这项工作得到了国家儿童健康和人类发展研究所内部基金的支持（NICHD项目#Z01 HD001902-14和#Z01 HD008740-07）。