用DNA芯片分析MCF7/BUS乳腺癌细胞雌激素诱导和抑制基因的配体敏感性

摘要

雌激素与雌激素受体（ER）结合，属于类固醇受体转录因子家族，配体ER通过招募辅活化蛋白或辅加压蛋白来激活或抑制基因转录。雌激素受体直接与被称为雌激素反应元件的基因组DNA序列结合，或通过其他DNA结合蛋白（如AP-1或Sp1）与基因组DNA间接相互作用。ER还与其他信号转导途径的关键成分相互作用，如Src酪氨酸激酶或磷脂酰肌醇3-激酶，通过这些途径间接影响基因表达(1)。此外，作为雌激素主要反应发生的基因表达变化可能对其他基因的表达产生次要影响。因此，雌激素的大多数生物作用来源于或至少与某些基因组的诱导或抑制有关，即使这些作用被认为是间接的或非基因组的。

为了表征雌激素对基因表达的影响，一些实验室使用了DNA微阵列，并测定了在存在或不存在17β-雌二醇（E2）的情况下培养的雌激素依赖性人类乳腺癌细胞的转录组谱(2——4)。在这些实验中，细胞受到激素饥饿长达5天，然后用1–10 nM E2刺激，这是一种高浓度的E2，通常会饱和ER阳性乳腺癌细胞培养物的E2剂量依赖性生长曲线(5,6)。因此，这些先前研究中报告的转录组谱的变化可能反映了E2的最大或接近最大效应，每个研究都只处理单一的高E2浓度。然而，关于E2在较低、不饱和浓度范围内的剂量依赖性效应的信息对于了解雌激素的作用至关重要体内细胞不太可能持续接触饱和浓度的雌激素。

基因的E2敏感性可由mRNA表达的E2剂量依赖性谱的三个方面表征，即：(我)显著诱导或抑制mRNA转录物表达所需的最低E2浓度(ii（ii）)E2浓度饱和E2对mRNA表达的影响，以及(三)mRNA表达的E2剂量-反应曲线形状（即线性、凸形或凹形）。由此表征的E2敏感性可能由多个因素决定：E2对ER的两种亚型（即ERα和ERβ）的亲和力，配体ER对雌激素反应元件（ERE）的亲和力(7,8)，ERE在基因组DNA转录控制序列中的位置(8)以及转录辅激活剂和共抑制剂的可用性，这些辅激活剂与共抑制剂被招募到围绕配体ER形成的转录蛋白复合物中(9)。当E2敏感性在基因间存在差异时，E2的过饱和浓度（仅涉及E2调节基因全部储备的一部分）的影响可能不仅在数量上，而且在质量上与雌激素的饱和浓度的影响不同。为了检验这种可能性，有必要开发一种方法，以合理的精度和统计基础表征大量基因E2敏感性的定量方面。

在本研究中，我们应用Affymetrix高密度寡核苷酸DNA芯片来测定ER-阳性MCF7/BUS人乳腺癌细胞中E2诱导和E2-抑制基因的配体敏感性。使用Perl编程语言，我们开发了一组简单的计算机脚本，用于处理DNA微阵列数据并表征每个基因的E2敏感性，实现了度量统计的标准测试。

材料和方法

细胞培养。MCF7/BUS电池(5,10)由A.M.Soto和C.Sonnenschein（波士顿塔夫茨大学）提供，并保存在补充5%FCS的DMEM（4.5 mg/L葡萄糖）中，FCS含有生物活性雌激素，相当于异种雌激素塑料器皿（Corning）中约60 pM E2（HyClone，规定等级）。它们的E2剂量依赖性生长曲线如下所示电子屏幕协议(5,10)。为了测定E2对转录组的影响，用无酚红DMEM洗涤细胞三次，并在不同浓度的E2存在下培养48小时；在这些实验中，培养基中添加了5%木炭/右旋糖酐脱脂FCS（HyClone），该FCS不含大量类固醇激素。在整个实验过程中，所有塑料器皿都经过仔细挑选，以避免异种雌激素污染。

DNA微阵列实验和RT-PCR。使用RNeasy mini-kit（Qiagen，Chatsworth，CA）从细胞培养物中分离出总RNA样品，并通过紫外分光光度法和RNA-nano生物分析仪（Agilent，Palo Alto，CA）评估其数量、纯度和完整性。本研究中描述的所有RNA样品的固相档案将按要求提供给研究人员。按照制造商的说明进行人U-133A基因芯片DNA微阵列（Affymetrix，Santa Clara，CA）的探针合成和杂交。基因表达数据（Affymetrix的CHP文件微阵列套件5.0软件）归一化为全球目标强度500；用手测量，背景噪声强度<50。如有要求，可提供用于E2应答基因半定量检测的RT-PCR引物和条件。

微阵列数据分析。E2剂量依赖性基因表达的主数据集电子表格由CHP文件生成微阵列套件5.0并转换为制表符分隔的文本文件。该文本文件的每一行代表一个基因，由基因名称、Affymetrix ID号和五组重复E2剂量-反应实验的标准化信号强度组成。每组E2剂量反应实验包括0、10、30、60和100 pM E2的数据。该文件中约22000行代表了人类U-133A芯片覆盖的所有基因。

什么时候？e（电子）(i、 j个)是实验编号中基因的标准化信号强度我E2浓度下j个[我= 1, 2, 3, 4, 5;j个=0，10，30，60，100（pM）]，分布电子下式中定义的近似正态分布(11,12)。这种近似虽然在数学上不严格，但在实际应用中通常是令人满意的(11,12):

因为电子在以下情况下为0e（电子）(j1公司) =e（电子）(j个2） ，因为电子当e（电子）(j1公司)是>e（电子）(j2公司)，单尾学生的t吨检验无效假设，

确定是否e（电子）(j个1） 明显大于e（电子）(j个2） 或者没有。

使用编程语言Perl(13)，开发了简单的计算机脚本来计算电子(i、 j个1,j个2） 对于以下所有组合(i、 j个1,j个2） 并执行上述操作t吨测试。为每个截断生成了单独的脚本P（P）价值(P（P）=0.05、0.01、0.001），每增加一倍截止数（f）因此，脚本S公司(第页,（f）)从主数据集文本文件中读取一行，并将其复制到另一个名为(第页,（f）,j个1,j个2)如果e（电子）(j个1） 显著大于e（电子）(j个2) (P（P）价值<第页)和e(j个1） 超过了（f）-折叠大于e（电子）(j个2). 因此，基因e（电子）(j个1） 小于e（电子）(j个2） 已复制到文件(第页,（f）,j个2,j个1)。然后，脚本读取下一行并重复该过程，直到到达主数据集文件和文本文件的末尾(第页,（f）,j个1,j个2)为四个参数的所有可能组合生成。激素饥饿实验的基因表达数据也进行了类似的处理。

计算机辅助知识提取。将E2应答基因与雌激素、癌症、E2F1或细胞周期相关的Medline引文由作品知识提取引擎（X-Mine），它可以发现基因名称和关键字之间有意义的关系，即使它们没有出现在单个出版物的标题或摘要中。手动验证提取的文献，以确认建议的关系。

结果

不同低浓度E2诱导或抑制的基因数量测定。MCF7人乳腺癌细胞的BUS亚系已广泛用于定量检测低浓度的天然和外源性雌激素(5,10)。与以往研究一致(5,10)，BUS细胞显示出高度可重复的E2剂量依赖性生长曲线，显示出低至2 pM E2的显著反应，并饱和80–100 pM E2(图1一个)。纯抗雌激素ICI182780（100 nM；数据未显示）完全阻断了100 pM E2的生长刺激作用，表明E2与ER结合是BUS细胞生长所必需的。Western blotting检测到BUS细胞和从美国型培养物收集获得的MCF7细胞株中存在ERα蛋白，但没有检测到ERβ（数据未显示）。在本研究中，在E2处理之前，BUS细胞没有受到激素饥饿的影响，因为在仔细控制的无异种雌激素细胞培养环境中，激素饥饿超过48小时后，BUS电池的生存能力严重受损。

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图1。

E2对MCF7/BUS细胞生长和转录组的整体影响。(一个)MCF7/BUS细胞E2剂量依赖性生长曲线。将细胞在指定浓度的E2存在下培养120小时，并测定细胞数量。每个点代表五个独立实验的平均值±SEM。(B类和C类)E2诱导敏感性的全球分布(B类)和E2-抑制(C类)基因。将BUS细胞暴露于不同浓度的E2中48小时，并通过DNA微阵列测定其转录组谱。列表示mRNA表达强度更强的基因数量(B类)或较弱(C类)[>2倍的差异和P（P）< 0.01 (n个=5）]在E2浓度存在的情况下x在色码E2浓度存在的情况下。

为了获得E2亚饱和浓度对基因表达影响的全面信息，将BUS细胞暴露于0、10、30、60和100 pM E2中48 h，并通过DNA微阵列测定其转录组谱。本实验的五个独立重复的数据以文本文件格式编译，并计算每个基因和每个E2浓度的信号强度平均值±SEM，它反映了mRNA转录物的数量。然后比较两种E2浓度之间的平均信号强度（表示为j个1和j个2)当E2浓度为j个1与…相比j个2（截止P（P）值≤第页)至少（f）-将折叠更改从这个文本文件复制到另一个标记有四个参数的文本文件中(第页,（f）,j个1,j个2) (P（P）=0.05、0.01或0.001；（f）=1、2或4；j个1,j个2=0、10、30、60或100 pM）。因此，一个文本文件(第页,（f）,j个1,j个2)列出E2诱导基因j个1>j个2; 相反，它列出了E2抑制基因，当j个1<j个2。我们实验室开发的一组简单的Perl脚本为四个参数的所有可能组合生成了这些基因列表。通过使用来自三个独立重复的激素饥饿实验和另一类基因列表的DNA微阵列数据集，类似地分析了激素饥饿对基因表达的影响(第页,（f）,天1,天2)，其中天1和天2表示饥饿期（0、1或2天）。重要的是，基因列表(第页,（f）,j个1,j个2)与仅通过减去一个基因列表生成的列表不同(第页,（f）,j个2，0 pM）来自另一个基因列表(第页,（f）,j个1，0 pM）。通过任何两个其他基因列表之间的减法生成的基因列表将与有意义的参数无关第页或（f）.

为了了解E2对转录组的整体影响，我们测定了在一种浓度的E2存在下显著诱导或抑制的基因数量(j个1pM）与另一个相比(j个2下午；j个1>j个2).图1B类和C类显示了此类分析的示例(P（P）=0.01，（f）= 2;j个1由指示x轴，和j个2由彩色插图表示）。什么时候？j个2=0 pM（红色列），两个E2诱导基因的数量(图1B类)和E2-抑制基因(图1C类)随着增长急剧增加j个1，如预期。然而，当j个2=10 pM（紫色柱），E2诱导和抑制基因的数量显著小于j个2=0 pM，尽管它们仍然随着增加而稳定增加j个1.何时j个2=30pM（蓝色柱）或60pM（深蓝色柱），E2诱导或抑制基因的数量微不足道。使用几个不同的参数截止值也获得了类似的结果第页和（f）这些观察结果可能表明，将细胞预先暴露于极低浓度的E2（≤10 pM）可能会对较高浓度E2（如100 pM）诱导或抑制基因的效率产生重大影响。

图1B类和C类此外，E2诱导基因和E2抑制基因的总数具有可比性，前者约为后者的1.5到2倍。该特征在不同的截止点下保持不变P（P）值(P（P）=0.05或0.001；数据未显示），这表明E2是一种有效的基因抑制剂，就像它是一种诱导剂一样。然而，与没有E2相比，10 pM E2诱导或抑制的基因数量是例外。当三个不同的截止时间P（P）值(P（P）=0.05、0.01和0.001），E2诱导和E2抑制基因的数量分别为190对602、38对122和3对16，因此始终表明在这种最低端E2浓度下抑制的基因数量多于诱导的基因数量。虽然目前的分析没有提供E2诱导和抑制基因的机制方面的信息，很容易推测，这些观察结果可能意味着，当E2浓度受到严格限制时，配体ERα的转录辅抑制因子招募可能比辅激活因子招募更有效。

E2-诱导和E2-抑制基因对E2敏感性的表征。接下来，我们使用基因列表表征了每个E2诱导和E2抑制基因的E2敏感性(P（P）= 0.05,（f）= 4,j个1，0 pM）和(P（P）= 0.05,（f）= 4,天1，0天）(j个1=0、10、30、60、100微微；天1=0，1，2天）。如所示图2E2诱导基因的mRNA表达随着E2浓度的增加而增强，相反，在激素饥饿期间受到抑制。这些基因被分为四类E2敏感性基因，即(我)重要的(P（P）<0.01）和>10 pM E2的2倍诱导（A类）；(ii（ii）)重要的(P（P）<0.05），但<2倍诱导10 pM E2（B类）；(三)重要的(P（P）<0.05）用30 pM E2诱导，但不用10 pM E_2诱导，尽管用10 pM-E2（C类）的mRNA转录物数量略有增加；和(iv（四）)10 pM E2（D类）的mRNA转录物数量无明显变化。E类包括几个已知的E2靶基因，这些基因没有被鉴定为E2诱导型基因，用于定义其他类别的严格标准。同样，E2抑制基因（F类）的mRNA表达谱显示，在激素饥饿期间，随着E2浓度的增加和增强，其mRNA表达降低。因此，图2简明扼要地显示了E2敏感性的三个属性，即显著基因诱导或抑制所需的最低E2浓度、饱和转录效应的E2浓度以及基因表达的E2剂量-反应曲线的形状。此外，计算机辅助知识提取表明，本研究中发现的许多E2调节基因已被报道为与癌症和/或细胞周期调节相关的基因(图2，代码）。

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图2。

E2敏感性分析。彩色图显示了E2处理和激素饥饿对基因的诱导（红色）和抑制（绿色）。图中的数字表示由学生的t吨测试；即，1、2和3表示P（P）< 0.05,P（P）<0.01，以及P（P）分别<0.001。每列代表一个实验条件，每行代表一个基因，显示了其名称和GenBank登录号。这些代码表明了每个基因与雌激素、癌症、细胞周期和E2F家族转录因子的已知关系，这些转录因子由计算机辅助知识提取引擎从数据库中检索并用符号表示锿,钙,塞浦路斯、和E2F（E2F）分别是。(A–F)A类——F的定义基于基因的E2敏感性，每类代表性基因的mRNA表达谱的细节以成对线图的形式表示。每对的左侧（填充符号）显示E2剂量-反应曲线(n个= 5); 右图（开放符号）显示荷尔蒙饥饿的概况(n个= 3). 每个数据点代表平均值±SEM。单箭头、双箭头和三箭头表示P（P）分别≤0.05、0.01和0.001。彩色图中显示的所有基因的详细mRNA表达谱如图4所示，该图作为PNAS网站上的支持信息发布。

E2敏感性分析显示自分泌生长因子的E2诱导与MCF7的E2剂量依赖性生长曲线分离/总线单元。转化生长因子-α（TGF-α）和基质细胞衍生因子-1（SDF-1）被报道为E2诱导的自分泌生长因子，支持MCF7细胞E2依赖性生长(14,15)。因此，高达100 pM E2的这些基因明显缺乏mRNA转录诱导(图2，E类)似乎矛盾，因为2–80 pM E2增强了MCF7/BUS细胞的生长(图1一个)。半定量RT-PCR分析证实，E2靶基因的mRNA转录物的E2剂量依赖性诱导和激素缺乏依赖性减少，该分析在扩增周期有限且未达到饱和的情况下进行CTSD公司/组织蛋白酶D和WISP2号机组，而对照基因mRNA转录物的表达GAPDH公司不受E2治疗或激素缺乏的影响(图3一个)。当进行类似分析时，观察到TGF-αmRNA转录物的弱而一致的表达，没有证据表明E2治疗或激素饥饿对其有影响(图3一个)，并且在几个不同数量的PCR扩增周期中，这种观察持续存在（数据未显示）。另一方面，在不同的RT-PCR条件下，根本没有检测到SDF-1的mRNA转录物(图3一个)。这些结果证实了DNA微阵列数据，该数据表明，低浓度E2（≤100 pM）和激素饥饿均未对TGF-α和SDF-1基因mRNA转录物的表达产生任何显著影响。

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图3。

E2敏感性高或低的E2诱导基因的mRNA表达谱：半定量RT-PCR。(一个)暴露于指定浓度的E2 48小时或激素保护（HS）达2天的BUS细胞中的mRNA表达。(B类)在暴露于10或100 nM E2 48 h的BUS细胞中TGF-α和SDF-1 mRNA转录物的表达。SDF-1检测引物对1用于实验一个.

因为之前的报告中描述的将TGF-α和SDF-1表征为E2诱导的自分泌生长因子的实验使用了10 nM E2，其浓度大于MCF7细胞E2剂量依赖性生长曲线饱和值的100倍(5)和MCF7/BUS单元(图1一个)]我们推测这些基因的mRNA转录物的诱导可能需要比我们在DNA微阵列实验中更高的E2浓度。事实上，10 nM E2强烈诱导TGF-αmRNA转录(图3B类; 在没有E2的情况下培养的细胞明显缺乏RT-PCR产物，这是由于减少了用于避免PCR饱和的PCR循环数所致）。当细胞暴露于10 nM E2和100 nM E2s时，SDF-1 mRNA转录也显著诱导(图3B类)。使用两对不同的PCR引物对SDF-1 mRNA进行了特异性检测。这些结果表明，TGF-α和SDF-1 mRNA转录物的E2依赖性诱导需要的E2浓度远远高于饱和MCF7/BUS细胞E2剂量依赖性生长曲线的E2含量。

讨论

E2诱导和E2抑制基因的配体敏感性信息不仅可以对E2本身的生物学行为提供重要的见解，还可以对影响E2效应的因素（如ER协同调节蛋白的表达）提供重要的认识(9,16)、ER与其他信号通路的相互作用(1)以及其他雌激素激动剂和拮抗剂的存在，如选择性雌激素受体调节剂或外源性雌激素。为了获得大量基因E2敏感性的系统数据，本研究设计了一种简单的方法，利用Affymetrix DNA微阵列和Perl脚本来确定基因表达的E2敏感性，并将其用于表征ERα阳性MCF7/BUS人乳腺癌细胞的E2反应。在本研究中，当几个代表性E2靶基因（例如孕酮受体或WISP2；参见图2)E2刺激后达到最大水平（未显示时间进程数据）。配体敏感性和E2对转录组影响的时间进程的联合方面的特征是一个重要问题，应在未来的研究中解决。

目前的E2敏感性分析成功地识别了一些已知的E2靶基因，如代码所示锿在里面图2支持我们的方法和方法的有效性。E2诱导基因列表还包括许多与细胞周期进展和癌症有关的基因，如代码所示塞浦路斯,电子2F类、和钙在里面图2; 其中一些基因的诱导可能涉及BRCA1和/或E2F1，它们是E2诱导的转录因子和细胞周期和致癌的关键调节因子（参见图2和参考文献。17和18)。另一方面，细胞周期蛋白D1和c-MYC公司虽然cyclin D1 mRNA的表达随着E2浓度的增加表现出适度增加，但未选取人类乳腺癌细胞中两个具有代表性的E2诱导基因(图2，E类)。这种增加可能是由其mRNA转录物诱导的短暂性引起的，其在E2暴露后≈8小时达到峰值，随后降低(19,20)。我们还试图确定其mRNA表达的E2剂量依赖曲线呈U形或倒U形的基因。然而，使用几个不同标准进行的分析仅发现假阳性，其非标准mRNA表达谱未经RT-PCR证实（数据未显示）。

本研究还发现了一些额外的E2诱导和E2抑制基因(图2)，尽管其中一些可能不是ER的直接目标。其mRNA表达的E2反应性机制及其调控的生物学意义有待进一步研究。在这些基因中FHL2型/四个半LIM域2(图2，B类)特别有趣，因为该基因编码AP-1的转录辅激活子(21)和β-连环蛋白(22)。这个FHL2型E2诱导可能意味着E2作用与有丝分裂原激活的蛋白激酶信号通路（涉及AP-1转录因子的形成）和/或Wnt信号通路（包括β-catenin转录辅激活子的稳定）之间可能存在相互作用。另一个有趣的基因是核糖核苷酸还原酶M2，编码DNA合成过程中脱氧核糖核苷酸生成的速率限制酶。据报道，RRM2 mRNA转录物可由E2F蛋白诱导(23)和BRCA1(24)。此外，最近的一项研究发现建议零售价2作为一种标记基因，其在浸润性导管癌中的表达强于导管癌就地(25)。这些观察结果表明RRM2在乳腺癌细胞的生长和恶性肿瘤中具有潜在的重要性，并且有兴趣确定是否E2敏感性建议零售价2乳腺癌恶性进展过程中的基因变化。

先前的研究报道，TGF-α和SDF-1是雌激素受体α阳性的人乳腺癌细胞的E2诱导自分泌生长因子。TGF-α的mRNA转录本(14)和SDF-1(15)在含有10 nM E2的MCF7细胞中强烈诱导。小干扰RNA抑制TGF-α的产生(14)，并通过中和抗体阻断分泌的SDF-1肽(15)导致该细胞系的E2依赖性生长受到显著抑制。然而，尽管我们能够在10–100 nM E2的MCF7/BUS细胞中复制这些mRNA转录的诱导(图3B类)我们还发现，较低的E2浓度以剂量依赖的方式促进细胞生长（即2–80 nM；图1一个)不影响这些因子的mRNA表达（图。​（图2电子2电子和​和3一个).三一个)。数据如所示图3一个相反，当细胞在E2的亚饱和浓度下生长时，TGF-α的表达较弱且一致。有趣的是，最近有人提出TGF-α可以通过激活有丝分裂原激活的蛋白激酶信号通路，将MCF7细胞的E2敏感性提高10–100倍，从而可能促进E2依赖性细胞的生长(6)。此外，我们最近证明，ER辅激活剂CITED1选择性地增强了TGF-αmRNA转录物的E2依赖诱导，而不影响pS2 mRNA转录的表达（E2浓度为10 nM）(26)。综上所述，这些观察结果可能意味着TGF-α的诱导可能在E2敏感性水平上进行调节，E2敏感性由ER辅活化剂的可用性决定，TGF-β可能作为E2生长刺激效应的自分泌修饰物，而非经典的自分泌生长因子。另一方面，在E2亚饱和浓度存在时，无法检测SDF-1 mRNA(图3一个)可能表明，只有当癌细胞暴露于饱和的E2浓度时，该因子才可能发挥自分泌生长因子的作用，这种情况可能发生在绝经前妇女中。需要进一步研究，以阐明这些因子与乳腺癌细胞E2剂量依赖性生长相关的生物学作用。

DNA微阵列数据分析是一个不断发展的科学领域，有许多软件专门为此应用而设计。然而，这种软件的规格并不完全适合实验设计和研究项目的目标，这并不罕见。在本研究中，我们使用Perl编程语言生成简单的脚本来实现数据处理算法。最近，Perl在生物学研究中的使用越来越流行(13)、本研究以及其他实验室的一些研究(27)，证明了Perl脚本技术在DNA微阵列数据分析中的有用性。尽管DNA微阵列数据分析的复杂方法（如无监督聚类）需要一个完整的软件包，但Perl脚本对于快速实现通常足以从DNA微阵列中提取有意义信息的简单算法来说似乎是方便而有效的。

总之，我们设计了一种方法，通过使用DNA微阵列和Perl脚本来表征细胞培养中表达的大量基因对E2的敏感性。通过将该方法应用于ERα阳性MCF7/BUS人类乳腺癌细胞，我们进行了全面的E2敏感性分析，并鉴定了许多E2反应基因。E2敏感性分析的重要性体现在发现诱导MCF7细胞的两种代表性E2诱导自分泌生长因子TGF-α和SDF-1的mRNA转录物所需的E2浓度实际上远大于使E2剂量依赖性MCF7/BUS生长曲线饱和的E2浓度。

补充材料

致谢

笔记

缩写：E2，17β-雌二醇；雌激素受体；RRM2、核糖核苷酸还原酶M2、TGF-α、转化生长因子α；SDF-1，基质细胞衍生因子1。

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