膜胆固醇、侧移和细胞肌动蛋白的磷脂酰肌醇4,5-二磷酸依赖性组织

摘要

越来越多的人认为，细胞表面膜是由结构域拼凑而成的，膜蛋白的局部浓度和脂质与整个膜的平均值大不相同(1). 胆固醇在组织某些类型的结构域（通常称为脂筏）方面很重要(2，三). 这些脂筏被认为是细胞功能所必需的，包括膜蛋白的定向迁移和覆盖、受体介导的信号传递、病原体的进出和膜运输（参考文献。4). 提取细胞胆固醇时脂筏分散(三). 因此，胆固醇消耗对特定功能的影响通常被认为表明这种功能需要脂筏(5——11). 这个假设忽略了胆固醇耗竭的影响在局部膜环境之外产生分支的方式，从而对膜和细胞特性产生全局影响。

我们考虑胆固醇消耗的全球影响的出发点是最近的研究表明，关键的调节性磷脂，磷脂酰肌醇4,5-二磷酸[PI（4,5）P2]集中在与F肌动蛋白浓度相近的胆固醇依赖性区域，以及膜转运的其他组分(12——16). PI（4,5）P2的定位与其广泛参与细胞功能的调节一致(17)尤其是细胞骨架的调节(18). PI（4,5）P2的可用性调节细胞骨架/膜相互作用(19)，皮层肌动蛋白的稳定性，以及细胞质应激纤维的周转(20).

在这里，我们将胆固醇在组织质膜PI（4,5）P2中的需求与PI（4,15）P2在组织细胞骨架中的作用联系起来。我们发现，胆固醇耗尽后，质膜蛋白的横向迁移受到限制。这种作用被细胞松弛素D逆转，并与细胞肌动蛋白的组织和周转的变化平行。胆固醇耗竭后，质膜中PI（4,5）P2的水平降低，胆固醇耗竭的影响通过隔离质膜PI（4,1）P2来模拟。因此，胆固醇消耗降低了膜蛋白的横向流动性，因为它破坏了PI（4,5）P2与控制肌动蛋白细胞骨架状态和组织的分子之间高度调节的相互作用。由于许多膜功能都需要侧向迁移，例如配体诱导的受体聚集和内吞，因此膜胆固醇水平的变化似乎可以影响细胞功能，而细胞功能本身与脂筏无关。

方法

细胞培养与胆固醇消耗。来自科里尔研究所NIGMS人类遗传细胞库（新泽西州卡姆登）的正常人类皮肤成纤维细胞株5659在添加10%FBS（Intergen，Purchase，NY）、0.2 mM非必需氨基酸和2×维生素（Invitrogen）的Dulbecco改良Eagle's培养基（GIBCO/Invitrogen。JY细胞、Epstein–Barr病毒转化的B淋巴细胞(21)在添加了10%FBS和2 mM谷氨酰胺的RPMI培养基1640（Invitrogen）中培养。

通过在补充有10%脂蛋白缺乏的FBS（Intracel，Frederick，MD）的McCoy培养基（Invitrogen）中培养，成纤维细胞和淋巴母细胞长期消耗胆固醇，而不是用10%完整的FBS。在一些实验中，消耗的培养基补充有人类低密度脂蛋白（LDL，CalBiochem）。成纤维细胞在37°C的完全培养基中与5–10 mM甲基-β-环糊精（MCD，Sigma）孵育15–30分钟，胆固醇急剧减少。MCD对JY淋巴母细胞有毒，因此在37°C的完全培养基中用0.5单位的胆固醇氧化酶（C8273，Sigma）处理1小时后，这些细胞的胆固醇急剧减少。

PI（4,5）P2与Pleckstrin同源性（PH）-GFP的表达。两种方法用于隔离膜PI（4,5）P2。首先，成纤维细胞在0.01M硫酸新霉素（Sigma）培养基中培养过夜(22). 清洗、贴标签和贴装溶液中也含有新霉素。在第二种方法中，用表达磷脂酶C-δGFP标记的PH结构域的质粒转染细胞(23)通过电穿孔。24-48小时后，大约一半的细胞呈GFP阳性。此时，他们被用于实验。

横向扩散的荧光光漂白和恢复（FPR）测量。对于横向扩散测量，用对I类MHC分子特异的单克隆抗体KE2的Cy3（Amersham Pharmacia）-Fab标记细胞(24). 在我们的标准方法中，一束衰减的激光束通过一个×63物镜聚焦，在标记细胞表面形成半径为0.6至0.8μm的光斑。在记录了该点的荧光后，这些分子的一部分在全激光功率下被短脉冲漂白。用衰减光束恢复漂白斑点中的荧光。如果所有分子都是流动的，荧光会恢复到漂白前测得的水平。观察到的恢复与初始荧光的比率产生标记分子的流动部分。对于PH-GFP转染后的测量，通过弧光灯照明选择细胞进行中度GFP荧光；然后，将过滤器切换到Cy3进行FPR。

PH-GFP荧光的成像分布。在用PH-GFP转染后，将成纤维细胞镀在40mm圆形盖玻片上，用于安装在温度控制室（Biotech FCS2，Biotechs，Butler，PA）中。细胞在蔡司LSM510共焦显微镜上成像，同时在37°C的培养基中加上5%的脂质缺失FCS。收集一组细胞的图像堆栈后，将培养基更换为含有10 mM MCD的培养基，并将细胞在显微镜台上保持30分钟。然后再次对细胞成像。通常，第二组图像的最大荧光值比第一组低20%。从每个控制和MCD图像堆栈中选择一个截面后，使用显微镜软件的轮廓工具确定强度分布。在其他涉及长期消耗细胞胆固醇的实验中，用PH-GFP转染对照细胞和消耗胆固醇的细胞，2天后固定，并在Delta-Vision（Applied Precision，Issaquah，WA）反褶积显微镜上成像细胞间的强度分布。

用抗体包被珠标记的HLA分子的激光捕获。我们实验室的早期工作中描述了用于测量标记分子在细胞膜平面内运动的激光陷阱和标记珠的制备(25). 转染PH-GFP的细胞在捕获前通过表观荧光进行鉴定。参考文献中描述了用于拉动垂直于膜的系带的标记细胞以及用于拉动这些系带的陷阱。19.

Triton细胞骨架的制备。根据参考文献的方案，从5659c成纤维细胞制备Triton提取细胞骨架。26简单地说，用0.25%Triton X-100+2%BSA+蛋白酶抑制剂（蛋白酶抑制剂混合物，罗氏应用科学公司，马萨诸塞州弗明翰）在等渗钙溶液中清洗并渗透生长在玻璃盖玻片上2天的细胞²⁺-0°C下的游离Hepes缓冲NaCl。在等渗盐水中清洗渗透细胞，使其达到37°C，并在37°C下与2天前转染GFP-actin的293T细胞的细胞质提取物孵育10分钟。提取物的总蛋白浓度为5 mg/ml，并将ATP添加到最终浓度为0.5 mM。在加入GFP-actin后，细胞骨架要么固定在4%多聚甲醛（PFA）中，要么用单克隆抗凝胶素（Sigma G4896）或抗α-精蛋白（SigmaA5044）洗涤并进一步孵育抗体后接Cy5-结合山羊抗鼠Ig（Jackson ImmunoResearch）。双标记细胞骨架也固定在4%PFA中。

细胞PI（4,5）P2的测定。根据参考文献中的方法，使用商业结合蛋白测定法（Amersham Pharmacia Biosciences）测定细胞脂质提取物中的PI（4,5）P2水平。27简单地说，PI（4,5）P2水解为d日-肌醇1,4,5-三磷酸（IP3）和IP3根据与标准结合的竞争性进行分析[^三H] IP3。

结果和讨论

我们测量了典型的1型跨膜蛋白、人类I类HLA分子、淋巴母细胞和成纤维细胞的侧向扩散。在低密度脂蛋白缺乏的培养基中生长的细胞在10-14天内慢性消耗胆固醇，或者用胆固醇氧化酶（淋巴母细胞）或MCD（成纤维细胞）处理细胞后急剧消耗胆固醇。所有这些治疗都将细胞胆固醇降低到对照水平的50-60%（数据未显示）。在荧光光漂白和恢复测量的时间尺度（10秒）上，他们还降低了HLA分子的流动分数(图1). 胆固醇耗竭后，表皮生长因子受体的侧向扩散也发现了类似的影响（数据未显示）。

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图1。

胆固醇耗竭降低了成纤维细胞和淋巴母细胞HLA分子的横向迁移率。这种减少被细胞松弛素D逆转(A类)所示为对照组5659c皮肤成纤维细胞（黑色）和在缺乏LDL的培养基中生长的细胞（红色）中Fab标记的I类MHC分子光漂白后的荧光恢复。计算机拟合了这些恢复曲线，估计对照细胞的最大恢复为65-70%，生长不含LDL的细胞为30-35%。(B类)在对照培养基（10%FCS，顶部)，中度缺乏LDL(中间)或在缺乏LDL的培养基中生长2周后，返回对照培养基24小时(底部). 胆固醇耗尽后，流动组分的分布转移到较低的流动性，但与胆固醇耗尽细胞在对照培养基中培养24小时时的对照组相似(C类)5659c皮肤成纤维细胞上I类HLA分子的平均可移动部分，要么在没有LDL的情况下生长10-14天（-LDL），要么通过MCD治疗急性消耗胆固醇。在用纯化的LDL（–LDL/+LDL）重组的LDL培养基中生长的细胞和用细胞松弛素D（5μg/ml）处理30分钟的细胞也显示出可移动部分(D类)JY淋巴母细胞上I类HLA分子的平均移动部分在10–14天内生长时没有低密度脂蛋白（–LDL），或者通过胆固醇氧化酶（0.5单位/ml）处理后胆固醇急剧减少。用细胞松弛素D（5μg/ml）处理30分钟的细胞也显示出可移动部分。

尽管细胞胆固醇水平是对照组的1.5–2倍（可能是因为胆固醇耗尽细胞上调了LDL受体），但在含有胆固醇的培养基（补充LDL的低密度脂蛋白耗尽培养基，或含有完整血清的培养基）中培养3到12小时后，活动性并没有恢复而是在24小时内恢复到控制水平(图1B类 底部)当细胞胆固醇水平与对照组相同时。然而，用细胞松弛素D（解聚F肌动蛋白）短暂（30分钟）处理胆固醇耗尽的细胞，使不动部分恢复到对照细胞的水平(图1C类和D类). 因此，胆固醇消耗似乎可以稳定膜下骨骼。

用40nm金珠标记成纤维细胞上的I类分子，使其被激光陷阱捕获并拖曳穿过细胞表面(25). 当标记的分子遇到障碍物时，它们从陷阱中出来，表现出布朗运动。图2A类显示了这种行为。附着在HLA分子上的珠子被困在左侧.英寸居中，将其向电池边缘（框架上部）拖动≈1μm的距离。在这一运动的最后，它遇到了一个障碍，并走出了陷阱。赖特显示出，离开陷阱后，粒子仍停留在障碍物附近，远离其起始位置，用星号标记。相反，在胆固醇缺乏的细胞中，HLA分子遇到障碍并走出陷阱(图2B类 居中)折回一微米或更长的距离，用一秒钟的时间到达他们第一次被困的位置(图2B类 赖特). 这一结果表明，它们被细胞骨架的弹性元件所固定或限制(28). 在对照细胞中弹性反冲很少见(表1)但有一半以上的颗粒滞留在缺乏胆固醇的细胞上。用细胞松弛素D对胆固醇缺乏的细胞进行短暂处理，可降低弹性反冲的频率(表1).

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图2。

激光捕获用40nm珠标记的HLA分子。(A类)当HLA I分子沿着对照成纤维细胞表面拖曳时，被抗体包裹的40nm金珠标记的分子遇到了障碍。将珠子从其初始位置拖动1μm多一点，标记为星号(左侧). 在居中，它遇到一个障碍物（在箭头标记的点）并离开陷阱。半秒钟后，珠子仍接近离开陷阱的点。（巴=2μm）(B类)用抗体包被的40nm金珠标记的HLA I分子遇到了一个障碍，因为它们沿着无LDL培养的胆固醇耗尽的成纤维细胞表面拖曳了10-14天。(左侧)珠子的初始位置，用箭头标记。(居中)珠子遇到障碍物时的位置。(赖特)如图所示，0.1秒后，珠子向其起点附近的点的相反方向倒退。

为了区分细胞骨架的锚定和膜相关细胞骨架的限制，使用激光诱捕器垂直于表面拉动珠状附着的HLA分子(23). 如果HLA分子没有附着在细胞骨架上，那么细胞膜就可以从表面上脱落，形成膜管或系链。如果它们附着在细胞骨架上，则无法形成系链。因此，如果HLA分子在胆固醇缺乏细胞中比在对照细胞中更有效地锚定在细胞骨架上，那么与对照细胞相比，它们将更难从表面拔出。相反，我们发现，与对照细胞相比，在胆固醇缺乏的细胞上，系链更容易被拉扯，这意味着与细胞骨架的连接更少。大约75%的珠子附着在对照细胞或胆固醇缺乏细胞的表面。在对照细胞中，即使在高（1110 mW）陷阱功率下，也可以拉动10%至25%的这些珠子产生膜系带。相比之下，60%的珠子可以从胆固醇耗尽的细胞膜中提取系链。因此，由弹性膜骨架限制而不是固定在骨架上，更好地解释了珠标记HLA分子在胆固醇缺乏细胞中对侧向运动和弹性行为的抑制。

胆固醇消耗后肌动蛋白细胞骨架的变化也明显表现为肌动蛋白和肌动蛋白修饰蛋白的组织和活性的变化。总的来说，这些图像表明，与对照组相比，胆固醇缺乏细胞中的细胞质肌动蛋白细胞骨架不太稳定。对照细胞及其Triton细胞骨架有明显的罗丹明-指骨样肽染色的应激纤维(图3A类和B类，第一和第二面板）。低密度脂蛋白耗竭细胞和MβCD处理细胞及其Triton细胞骨架中的应力纤维更少、更薄。胆固醇缺乏细胞中也有许多肌动蛋白聚合灶(图3A类和B类，第三到第六个面板）。当用非常高浓度（10 mM）的MβCD处理相对较长的时间（30分钟）时，细胞产生大量标记F-actin的小孢子（数据未显示）。来自对照细胞的Triton细胞骨架制剂比胆固醇缺乏细胞的细胞骨架含有更少的G-actin，并且含有相对较高水平的gelsolin，其中大部分与应激纤维有关(29). 从图像中绿色（GFP-G肌动蛋白）和红色（抗凝胶素抗体）荧光的相对强度可以看出这一结果图3C类α-肌动蛋白水平在耗尽细胞中高于对照组（比较插入属于图3D类，第五个面板与图的其余部分）。它的分布有所不同。在对照组中，它定位于小突起，沿着所报告的特征点模式的应力纤维（例如，参考文献。30)和可能代表局部粘连的斑块(图3D类，第一和第二面板）。这些斑块也见于胆固醇缺乏的细胞。此外，α-肌动蛋白也存在于靠近表面的网状网络中，以及肌动蛋白聚合的焦点中(图3D类，第三到第六个面板）。

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图3。

胆固醇消耗和肌动蛋白细胞骨架的组织。(A类)从左到右，分别是对照成纤维细胞、在不含LDL的情况下生长10-14天的成纤维细胞和在37°C下与5μM MCD孵育15分钟的成纤维细胞中的鬼笔肽标记F-肌动蛋白的两个例子。与胆固醇缺乏细胞相比，对照细胞中标记的应力纤维更丰富，且明显更厚。(B类)从左到右，分别有两个例子，分别是在由对照成纤维细胞制备的Triton细胞骨架中的F-actin的类肽标记，无LDL培养的成纤维细胞培养10-14天，以及在37°C下用10μM MCD培养30分钟的成纤维纤维细胞。与胆固醇缺乏细胞相比，对照细胞中标记的应力纤维更丰富，且明显更厚。此外，在对照细胞中，可以看到卵磷脂标记的放射状病灶，但不存在胆固醇耗竭。(C类)从左至右，将GFP-actin（绿色）掺入由对照成纤维细胞、不含LDL的成纤维细胞培养10–14天，以及在37°C下用10μM MCD培养30分钟的成纤维纤维细胞制备的Triton细胞骨架中，并用抗凝胶素单克隆抗体（红色）标记。对于所有图像，显微镜增益被设置为恒定。因此，与胆固醇缺乏细胞的细胞骨架相比，对照细胞骨架的暗绿色荧光和亮红色荧光表明，对照细胞中的应激纤维更替率较低，结合凝胶素水平高于胆固醇缺乏细胞骨架。(D类)从左到右，分别有两个例子，将GFP-actin（绿色）掺入由对照成纤维细胞制备的Triton细胞骨架中，并用抗α-肌动蛋白单克隆抗体（红色）标记，无LDL培养的成纤维细胞培养10–14天，成纤维细胞在37°C下与10μM MCD孵育30分钟。必须降低用于图像控制的显微镜增益，以生成第二、第三、第四和第六面板的图像。这个插入第五个面板中的显示了该面板中单元的一部分；在第五个面板中显示了与控件具有相同增益的图像。（比例尺=20μm。）

我们观察到的肌动蛋白细胞骨架的变化与PI（4,5）P2调节的肌动素修饰蛋白活性的变化一致(18). 胆固醇耗竭破坏了质膜中PI（4,5）P2的组织(13)急性胆固醇耗竭后，我们观察到的一些细胞形态变化，特别是大量小孢子的形成，与所谓的GMC蛋白隔离质膜PI（4,5）P2时观察到的变化相似(15). 我们的荧光光漂白和恢复以及激光诱捕实验中反映出的皮层细胞骨架稳定性的增加，以及胆固醇缺乏细胞骨架中应力纤维的更替增加，也与质膜中有效PI（4,5）P2的丢失或重新分布相一致(20，31).

急性或慢性胆固醇耗竭后，细胞总PI（4,5）P2的数量变化<20%（数据未显示）。然而，与对照组相比，胆固醇缺乏细胞的质膜中PI（4,5）P2相对较少。我们通过测量用GFP（PH-GFP）标记的磷脂酶C-δ的PH域分布的变化来量化这种变化(23，32，33)在质膜和细胞质之间。图4图示了在10 mM MCD中培养前后对成纤维细胞进行成像的实验。共聚焦显微照片中显示了五个细胞图4A类中的两个细胞在MCD前后PH-GFP荧光分布图4B类在对16个不同细胞的48次测量中，我们发现质膜上的GFP荧光与细胞质中GFP荧光的比率有所下降，下降了2倍以上。MCD处理前细胞平均扫描电镜为4.5±0.4，MCD处理后为1.8±0.3。当对照细胞群体与剥夺低密度脂蛋白10-12天的细胞群体进行比较时，质膜PH-GFP与细胞质PH-GFPs的比率也出现了类似的下降（对照组为2.4±0.2扫描电镜，耗尽低密度脂素的为1.4±0.1扫描电镜），但分布几乎没有变化（2.00±0.2）当细胞在补充LDL的耗尽培养基中培养时。对照细胞的质膜中可被PH-GFP结合的PI（4,5）P2水平似乎高于胆固醇缺乏细胞的质质膜。PH-GFP降低的PI（4，5）P2标记与肌动蛋白细胞骨架的重组相关。

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图4。

胆固醇耗竭，根据PH-GFP的分布测量PI（4,5）P2的分布，以及PH-GFP表达对肌动蛋白细胞骨架的影响。(A类)表达PH-GFP的细胞的共聚焦显微镜切片。细胞在Bioptech培养箱中培养，并在胆固醇耗尽前在37°C的培养基中成像(左侧)用10 mM MCD孵育20分钟(赖特). (B类)GFP荧光在细胞中的分布（用白线标记A类)显示在胆固醇消耗之前(左侧)以及MCD降低胆固醇后(赖特). 可以看出，在胆固醇耗竭后，膜结合的GFP荧光与细胞质GFP荧光的比例转移到细胞质。(C类)Triton细胞骨架从转染了不结合PI（4,5）P2的突变PH域的细胞中并入GFP-actin(上部)或通过PH-GFP转染细胞的细胞骨架结合PI（4,5）P2(下部). 当表达PI（4,5）P2-请求PH结构域时，GFP-actin的结合比表达突变时更多。（巴=20μm）

如果肌动蛋白细胞骨架的PI（4,5）P2调节取决于其在质膜中的局部浓度和可用性，那么我们预计隔离PI（4,15）P1的效果应该与胆固醇消耗类似。我们用作PI（4，5）P2定位探针的PH-GFP结构域也可以用于螯合PI（4，5）P2。由表达PH-GFP的细胞制备的Triton细胞骨架在应激纤维中结合了更多的GFP-G肌动蛋白，而不是由表达不结合PI（4,5）P2的突变PH-GFP的细胞所制备的细胞骨架(图4C类)，这正是我们观察到的胆固醇缺乏细胞和对照细胞的细胞骨架之间的差异。表达PH-GFP的成纤维细胞表面的激光捕获HLA分子都显示出弹性反冲，而不是遇到障碍时的布朗反冲(表1)在胆固醇缺乏的细胞中也有同样的作用。最后，我们发现通过表达PH-GFP或用新霉素培养细胞来隔离PI（4,5）P2，新霉素结合并隔离PI（5,5）P1(22)减少MHC I类分子的流动部分，其程度与胆固醇消耗差不多(图5). 胆固醇耗竭和PI（4,5）P2的分散对侧向扩散的调节似乎有一个下限。与单独治疗相比，胆固醇耗竭和PI（4,5）P2螯合对侧向扩散的影响并不更大(图5B类和C类). 与此结果一致，淋巴母细胞的胆固醇消耗对淋巴细胞功能相关抗原（LFA-1）和细胞间黏附分子-1（ICAM-1）的移动分数没有影响，这些分子在对照细胞中大多（≈65%）不动（数据未显示）。

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图5。

隔离PI（4,5）P2对I类HLA分子侧向迁移率的影响。(A类)HLA分子在新霉素过夜培养的成纤维细胞中的横向迁移率分布与对照细胞或MCD导致胆固醇急剧下降的细胞中的分布相比。还显示了用新霉素和MCD处理过的细胞中流动组分的分布。(B类)与转染后不表达PH结构域的细胞相比，低水平PH-GFP转染的成纤维细胞中HLA分子的横向迁移分布，以及MCD处理的PH-GFP-表达细胞中的分布。用作淋巴母细胞（5C）对照的突变GFP-PH结构域不能用于成纤维细胞，因为它总是以非常高的水平表达，其荧光渗入显微镜的荧光光漂白和恢复通道，造成荧光恢复伪影。(C类)与表达不结合PI（4,5）P2的突变PH域的细胞中的值分布相比，HLA分子在低水平PH-GFP转染的JY B淋巴细胞中的横向迁移率分布。

我们的数据表明调节PI（4,5）P2活性是调节细胞骨架所必需的。与细胞质中的PI（4,5）P2相比，细胞胆固醇耗竭和质膜水平降低会扰乱这种调节。这种扰乱导致了通过肌动蛋白细胞骨架的变化介导的对质膜功能的整体影响，而不仅仅是局部影响。我们的研究结果还表明，胆固醇耗竭对任何特定细胞功能的影响可能会报告膜蛋白的侧向扩散或聚集需求，而不是报告脂筏直接参与所研究的功能。

致谢

笔记

缩写：PI（4,5）P2，磷脂酰肌醇4,5-二磷酸；低密度脂蛋白；甲基-β-环糊精；PH，pleckstrin同源性。

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