通道视紫红质-2，一种直接光控阳离子选择性膜通道

摘要

动物的光接收在脊椎动物和无脊椎动物中的进化不同，尽管两者都用作主要的光受体视紫红质，一种七跨膜（7-TM）螺旋蛋白，与共价连接的视网膜。在脊椎动物中，光激活的视紫红质启动G蛋白偶联酶级联反应，最终水解cGMP并关闭cGMP调节的阳离子通道，从而使质膜超极化(1–三). 无脊椎动物也使用基于视紫红质的G蛋白偶联信号级联，然而，这会导致瞬时受体电位（TRP）/TRP样（TRPL）通道的激活和膜电位的去极化(4,5). 微生物型视紫红质也是7-TM视网膜蛋白，但与动物视紫红质没有序列同源性。原型微生物型视紫红质是光驱动质子泵细菌视紫红素（BR）(6)，一个结构和功能都很好理解的主动跨膜离子传输模型系统(7,8). 其他微生物视紫红质是光驱动的氯化物泵或光传感器，后者通过与特定传感器耦合实现趋光性(9–11).

最近，在真菌中也发现了微生物型视紫红质(12)和藻类(13)自1991年以来，人们已经知道绿藻的趋光性和避光反应莱茵衣藻由微生物型视紫红质介导全视网膜生色团(14–16). 如绿藻所示雨生红球菌(17),C.莱因哈迪(18)、和团藻(19)，感光电流仅限于色素斑区域。虽然这些藻类中光感受器电流的离子依赖性不同，但根据刺激-响应曲线，已经提出这三种藻类都由一种或多种视紫红质组成的高强度和低强度光感受器系统(19–21). 对于C.莱因哈迪结果表明，在高闪光能量下，闪光与光电流开始之间的延迟小于50μs，这表明光感受器和通道形成了蛋白质复合物(22)或者甚至是一种相同的蛋白质(21). 在低闪光强度下，感光器电流延迟数毫秒，这表明低强度感光器系统涉及一个信号放大系统，该系统间接激活电导(19). 在生理条件下，感光电流主要由钙携带²⁺，但K⁺当高细胞外K时，驱动力增强时也会进行⁺(23). 当眼斑区域每秒暴露在低pH值（H⁺-携带）感光器电流分量出现(21).

在中搜索C.莱因哈迪基因组数据库显示了两个编码与微生物视蛋白有一定同源性的载脂蛋白的cDNA序列，即通道视蛋白1（Chop1）和通道视蛋白2（Chop2）(24)[原名衣原体蛋白：Cop3和Cop4(13)，也称为CSOA和CSOB(25)或Acop-1和Acop-2(26)，分别](图1一和支持文本，作为支持信息发布在PNAS网站上）。我们最近发现，Chop1在小鼠卵母细胞中的表达非洲爪蟾产生对质子高度选择性的光门控电导，我们认为通道视紫红质-1（ChR1=Chop1+视网膜）是介导H⁺-携带感光电流(24). Sineshchekov及其同事(25)生成的转化子中，通过反义方法改变了Chop1及其同源物Chop2的比率。在一项监测细胞面对光与背向光的差异反应的电细胞群分析中，作者证明ChR1和ChR2都有助于感光电流(25). 因为在ChR1-deprived细胞中，高闪光强度下的光电流减少，而在ChR2-derived电池中，低闪光能量下的光流减少，作者得出结论，ChR1介导高强度响应，而ChR2负责低强度光电流(25). ChR1和ChR2对光电流的贡献机制以及恐惧反应和趋光性的程度尚不清楚。ChR2产生的光电流被描述为缓慢，类似于古菌的趋光性，提出了ChR与其特定换能器的耦合，尽管考虑到ChR1本身可能是离子通道的可能性(25). 高桥和同事(26)产生针对Chop1和Chop2的抗体。他们无法在总膜分数内定位蛋白质，但在富集的眼斑膜中检测到Chop1作为66-kDa蛋白质。

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图1。

ChR2–315介导的光激活电导的离子依赖性。全长ChR2–737的光电流无法区分。(一)ChR2–737和ChR2–315的预测结构方案。(b条)在林格溶液（110 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM CaCl）中表达ChR2–315的卵母细胞的双电极电压灯记录₂，1 mM氯化镁₂pH值7.6）。蓝色（450±25 nm）光的照明由灰色条指示。电流是其他23个实验中的典型电流。(c（c）)在同一卵母细胞中测量的115 mM盐溶液（LiCl、NaCl、KCl、RbCl、CsCl和NMG-Cl）在–100 mV、pH 7.6下的归一化向内光电流。电流是其他四个实验中的典型电流。(d日)在pH 9、pH 7.6或pH 5的115 mM NMG-Cl中，来自同一卵母细胞的–100 mV光电流。电流是其他三个实验中的典型电流。(e（电子）)一个代表性卵母细胞（从上到下）的稳态光电流的电流-电压关系：115 mM NMG-Cl，pH 9；80 mM氯化镁₂，pH 9（电流-电压，如NMG，pH 9）；115 mM氯化锂，pH 9；110 mM氯化钠，5 mM氯化钾，pH 7.6。电流是其他三个卵母细胞的典型电流。(（f）)由反转电位变化得出的不同单价阳离子的渗透率比(31)更换Na时的光电流⁺通过阳离子X⁺使用的溶液为：115 mM XCl、2 mM BaCl₂，1氯化镁₂，pH值9。H的渗透率⁺由Goldmann–Hodgkin–Katz方程估算(31)根据115 mM NMG-Cl在pH 9下的光电流反转电位，假设细胞质≈100 K⁺和酸碱度_我第7.3页。n个= 3. (克)80 mM CaCl中的光电流₂–100毫伏时pH9(下部和插入，时间分辨率更高）。然后，卵母细胞注射1,2-双（2-氨基苯氧基）乙烷-N个,N个,N个′,N个四乙酸（BAPTA）（作为K盐）达到最终浓度10 mM，并再次测定光电流(上部和插入). 电流是其他四个实验中的典型电流。(小时)瞬时表达ChR2–315的HEK293细胞的光电流。在–100、–50、0、+50和+100 mV下测定光电流。使用的移液管溶液为140 mM NaCl、5 mM EGTA、2 mM MgCl₂，10 mM Hepes，pH 7.4。使用的镀液为140 mM NaCl，2 mM MgCl₂，1 mM氯化钙₂，10 mM Hepes，pH 7.4。电流是HEK293上其他九个以上实验和BHK电池中五个以上实验的典型电流。

迄今为止，ChR2的异源表达尚未见报道，其主要作用方式尚不清楚。我们的目标是在爪蟾卵母细胞和哺乳动物细胞，以期获得一种功能性视紫红质（ChR2），该视紫红素可能揭示其主要功能，并可能用于确定其作用谱。我们相信，在三种不同的动物细胞中异源表达后观察到的一种功能也将存在于藻类中，即使在宿主系统中与藻类感觉传导途径的其他蛋白质耦合可能缺失。

材料和方法

全长(第二章-737）和C末端截断第二章变体(第二章-315）由全长cDNA模板（GenBank登录号：。{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“AF461397”，“term_id”：“20219019”}}AF461397型)如所述第1章(24).第二章-315被额外亚克隆到pBK-CMV中，并通过瞬时转染在HEK293或BHK细胞中表达。用全细胞斑贴灯技术检测哺乳动物细胞(27). 有关更多详细信息，请参阅支持文本.

结果

卵母细胞中ChR2的表达产生光敏性阳离子电导。我们在卵母细胞中表达了Chop2拉埃维斯X.laevis，在全反式视网膜，以测试是否可以获得功能性视紫红质（与共价连接的视网膜：ChR2）。测试了仅包含氨基酸1–315的全长ChR2或ChR2片段(图1一图5，作为支持信息发布在PNAS网站上）。在标准卵母细胞Ringer溶液中，两种结构均观察到大的光激活电流(图1b条). 这些光电流在未注射的卵母细胞中完全缺失，正如之前对其他视紫红质的研究所报道的那样，这些视紫红蛋白在类似条件下表达于卵母细胞(9,24,28,29). 在连续光中，光电流衰减到稳态水平，即脱敏(图1b条). 光电流的大小和方向随膜电位的变化而变化，表明光触发了ChR2的被动离子电导。ChR2的阳离子电导仅限于假设的7-TM螺旋，因为与ChR2–737或ChR2–315获得了相同的光电流和非常相似的电流-电压关系，从而得出氨基酸316–737对离子电导没有贡献的结论。

与质子选择性离子通道ChR1相比，在含有不同阳离子的溶液中，ChR2的光电流变化很大(图1c（c）)，表明几种阳离子可能渗透ChR2。用天冬氨酸取代细胞外氯化物，证明了阴离子对光电流没有贡献，这既没有改变光电流的大小，也没有改变光电流的反转电位（数据未显示，但请参阅115 mM NMG-Cl或80 mM MgCl的电流-电压₂在里面图1e（电子）). 光电流对不同盐溶液的依赖性与阳离子的原子半径呈强烈的反比关系(图1c（c）). 大一价阳离子存在时的小向内光电流N个-甲基-d日-葡聚糖（NMG⁺)pH值7.6时，可能表明ChR2对NMG具有渗透性⁺然而，当NMG-Cl中的向内光电流在pH值为9时完全消失，而LiCl中则保持在pH值9时，我们得出结论，NMG-Cl-存在时的向内光电流是一个质子通量，在pH值5时变得非常明显(图1d日).

为了估计不同阳离子的渗透率，我们测量了不同阳离子在pH 9下的光电流-电压关系和反转电位。这些实验表明，NMG⁺非Mg²⁺在可测量的程度上进行(图1e（电子）). 一系列分级大小的不同有机阳离子揭示了甲基铵、二甲基铵甚至四甲基铵的渗透率(图1（f）)，而四乙基铵不可测量地渗透ChR2。该系列表明有效的ChR2孔必须大于电压活化Na的孔⁺通道，不能通过甲基铵(30,31). 而在大多数电压激活Na中⁺胍的渗透率约为钠的13%⁺(30,31)我们发现ChR2对胍有很大的光敏渗透性(图1（f）). 这一事实，再加上甲基化铵化合物的渗透性，意味着有效孔径超过了电压活化钠的孔径⁺频道。从一价金属离子的电导随原子半径的增加而降低的观察结果可以得出结论，阳离子渗透到选择性过滤器中(31)处于大部分脱水状态（即没有完整的内部水壳）。

除单价阳离子外，ChR2还可渗透二价阳离子。在含有80 mM Ca的溶液中²⁺，激活ChR2会触发大电流(图1克 下部)具有双相上升时间(图1克 插入). 这种电流最好用快速光激活的Ca来解释²⁺进入胞浆，导致卵母细胞内源性钙激活较慢²⁺-敏感氯离子通道(32,33). 在钙抑制剂的存在下，这种光电流的强烈降低证实了这一假设²⁺-敏感的氯离子通道、硝氟米酸或通过减少胞浆游离[Ca²⁺]用快速钙²⁺-螯合剂1,2-双（2-氨基苯氧基）乙烷-N、 N、N′,N个'-四乙酸（BAPTA）。将BAPTA注射到卵母细胞中会抑制先前观察到的更缓慢上升的光激活电流(图1克 上部). 剩下的光电流反映了钙的真实大小²⁺电导。ChR2的相对渗透率，根据–100 mV和80 mM二价阳离子的内向电流估计，遵循Ca序列²⁺>高级²⁺>巴²⁺≫锌²⁺，镁²⁺（≈0），除镁外²⁺，同样与原子半径成反比。镁渗透性不足²⁺很可能是由镁的强烈水合作用引起的²⁺(31,34)根据建议的大部分脱水阳离子的渗透。

哺乳动物细胞中ChR2的表达。为了证明ChR2电导的特性与宿主系统无关，在HEK293和BHK细胞中表达了ChR2–315。在这些细胞中，ChR2还产生了一个光开关的大被动阳离子电导，当细胞受到光照时，该电导迅速激活，然后降低到一个稳定的水平(图1小时)，非常类似于爪蟾卵母细胞。这些全细胞斑贴灯实验特别支持光诱导电导完全被动的概念，因为对称离子浓度的反转电位为0 mV(图1小时). 这些实验还揭示了钠的光激活电导⁺是内向矫正。

ChR2脱敏受膜电位和pH值的影响。从中可以看出图1b条，ChR2光电流衰减到稳定水平，这可能是由切换到不同导电状态或部分ChR2分子失活引起的。在光中平衡后，稳定电流是稳定的。然而，在短暗相之后给出的对第二个脉冲的响应包括比第一个响应更小的瞬态电流分量。峰值电流的恢复取决于膜电位，即在负电压下比在正电压下恢复更快(图2一–c（c）). 失活的恢复也取决于细胞外pH值（pH_哦)：pH值较高时速度较慢_哦(图2d日)低于低pH值_哦(图2e（电子）). A小时⁺在黑暗时期给予的脉冲加速了ChR2从脱敏状态的恢复(图2（f）). 这一结果表明，从非活性状态的恢复与细胞外一个或多个氨基酸的质子化有关。Glu-123是一种预计会暴露于细胞外侧的氨基酸（因为其在BR中的位置类似于Asp-85，见图5），将其突变为Asp会产生类似的光电流，瞬态与稳态光电流的比率增加(图2克). Glu-123突变为Gln完全消除了峰值光电流，但也导致了固定光电流的强烈降低(图2小时). 我们建议E123改变光照下的质子化状态，从而介导ChR2的脱敏。

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图2。

光电流脱敏的恢复是电压和pH值_哦依赖。电流是其他三个实验中的典型电流。(一–c（c）)两个暗相为10 s的光脉冲，pH值_哦7.6，相同卵母细胞在–120 mV下(一)，–40毫伏(b条)和+40毫伏(c（c）). (d日)另一个pH值的卵母细胞_哦7.4，+20 mV，光脉冲之间暗32秒。(e（电子）)相同的卵母细胞，pH_哦= 5.5. (（f）)与中的卵母细胞相同d日和e（电子），pH值_哦闪光期间为7.4，但pH值为_哦=5.5，黑暗阶段持续20 s。光脉冲由灰色条表示。(克)ChR2–315-E123D在–100 mV，pH 7.6下的光电流。(小时)100 mV，pH 7.6时ChR2–315-E123Q的光电流

在切除的质膜片中观察到的光电流。在无细胞条件下，研究了细胞质对ChR2光电流的影响，在离体的巨大内外膜贴片中，细胞质溶液可以可靠且容易地控制(35–37). 为了简化分析，我们研究了H⁺-不同细胞内pH（pH）的镀液携带的光电流_我). 在这个无细胞系统中，光电流再次下降到稳定的稳态，并且在第二次刺激后瞬态分量减少(图3一)表明ChR2失活是蛋白质的固有特性，而不是由可溶性卵母细胞成分的任何修饰引起的。

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图3。

离体内外巨膜片中ChR2光电流的激活爪蟾卵母细胞。此配置允许快速改变浓度（≈100 ms；参考。43)在细胞质侧通过改变过熔浴溶液。(一)442 nm光脉冲激活内向光电流（灰色条）。使用的移液管溶液为115 mM NMG-Cl，pH 5；所使用的溶液（细胞质溶液）为115 mM NMG-Cl，pH 7。显示了其他九个实验中的典型电流。(b条)通过两次持续时间为10ns（箭头）、440nm的激光闪光激活光电流。使用的移液管溶液为115 mM NMG-Cl，pH 5；使用的镀液为115 mM NMG-Cl，pH_我7或115 mM NMG-Cl，pH_我4，如图所示。显示了其他三个实验中的典型电流。(c（c）)第一光电流的时间分辨率更高，如所示b条，pH值_我= 7. (d日)闭合速率对pH值的依赖性_我(n个= 4–7). (e（电子）)ChR2光循环的简单三态模型。浅色弯曲箭头表示从ChR2基态（C）到开路状态（O）的光激活步骤。直箭头表示暗反应，即闭合脱敏状态（D）和返回基态（C）。有关更多详细信息，请参阅正文。(（f）)用τ模拟光电流_直流=2 s和其他时间常数，如e（电子）(克)用τ模拟光电流_直流=60 ms和其他时间常数，如e（电子）.

ChR2本身就是阳离子通道。斑贴实验证明，ChR2本身调节光门控被动阳离子电导，并且它不会像动物感光系统中的视紫红质那样通过可溶性信使触发通道的门控(1–5). 为了更准确地分析导电状态的上升和下降，用两次持续时间仅为10 ns的激光闪光刺激ChR2(图3b条). ChR2诱导的光电流上升速度极快，没有可见延迟，上升时间≈200μs或更快(图3c（c）). 这种快速开放只存在于通过电压变化或配体结合激活的离子通道中，但迄今为止，从未在通过化学信号转导系统激活的离子渠道中发现。这种快速激活和细胞内介质的完全替代支持了激活独立于可扩散细胞质递质的概念。

酸碱度_我确定通道关闭的速度。Giant-patch实验也表明，光电流的衰减在很大程度上取决于pH值_我(图3b条和d日)，而它实际上与pH无关_哦如在整个卵母细胞的实验中所观察到的。细胞内高H时光电流衰减较慢⁺浓度表明质子释放到细胞质侧先于闭合。大的光电流和慢的动力学与运输和光循环紧密相连的机制不相容。然而，它们很好地符合光循环中间产物允许被动离子传输的机制。

光电流分析和光循环建模。虽然到目前为止，ChR2仅以微量异源表达，光谱研究中没有蛋白质，但我们记录的光电流允许模拟简单的光循环。对于迄今为止所研究的任何视紫红质，可以假设超快（<1 ns）光激活步骤导致ChR2（C*）的激发状态。接下来是对开放状态（O）、闭合、脱敏状态（D）和闭合基态（C）的较慢暗反应。从ChR2的快速打开(图3c（c）)我们可以将<1ms的时间常数分配给导致打开状态（C→C*→O）的步骤，而接近脱敏状态（D）需要10-400ms，具体取决于pH_我(图3d日). 由于打开（C→C*→O）如此之快，四态模型（C→C*→O→D→C）可以进一步简化为三态模型（C→O→D→C）(38)[参见图3e（电子）例如，根据以下公式得出的光控开启（C→O）的时间常数为0.2 ms图3c（c），20 ms，用于在pH值下关闭（O→D）_我=7.3，根据图3d日，从脱敏（D→C）中恢复2 s图2一]. 当使用这些时间常数时，该模型预测的稳态光电流要小得多(图3（f）)比实验观察到的(图3一). 光电流图3一然而，如果假设脱敏恢复更快（D→C），例如时间常数为60 ms（参见图3克). 与在黑暗中观察到的恢复的差异（参见图2)可能表明在光循环过程中吸收了两个光子，即有效时间常数为60ms的光激活D→C跃迁。光循环的中间体表现出光反应，导致双光子循环的概念对视网膜蛋白（如卤视紫红质）来说并不新鲜(39)或蛋白视紫红质(40). 或者，具有两个闭合状态、两个开放状态（第一个光循环的开放状态的电导较大，后续光循环的电导较小，即，脱敏状态由一个闭合状态和一个开放状态组成）的四态光循环，以及黑暗中到初始闭合状态的缓慢过渡，也可以解释所观察到的光电流的形状。由于还没有实验数据来决定这些模型之间的差异，进一步的实验将不得不显示光循环的更多细节。一旦有足够的ChR2蛋白可用，对ChR2的光谱测量肯定会改进光循环模型，并可能添加新的中间产物。然而，所提供的电气数据已经为光循环的转换时间设定了一个下限，例如，pH值>60 ms_我第7.3页。

衣原体中ChR2作用和表达的光依赖性。在卵母细胞中，ChR2光电流的作用光谱是典型的视紫红质光谱，最大值约为460nm(图4一). 光谱几乎与达特纳尔视紫红质诺模图完全相符(41)但相对于ChR1光电流的作用光谱，光谱蓝移了40 nm(图4一). 在衣原体使用抗这两种蛋白质C末端亲水端抗体的膜组分(图4b条和c（c）). Chop2是一个70kDa的物种，而Chop1是一个分子量在60-66kDa之间的三联体。当细胞在低光条件下或黑暗中生长时，这两种蛋白质的含量最高。两者在强光条件下都会退化(图4)当细胞培养接近稳定期时，几乎完全消失。ChR2的降解速度比ChR1快。

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图4。

ChR2和ChR1的作用光谱C.莱因哈迪膜组分和ChR2诱导的膜去极化。(一)pH条件下ChR2介导的卵母细胞内向电流的归一化作用谱_哦=7.6和-100毫伏（□，n个=3）和来自C.莱因哈迪pH 9下的菌株CW2(▪）。C.莱因哈迪细胞在弱光下生长（0.5W·m^–2)持续3天。用NMG-Hepes，2 mM Ca直接从眼点记录光电流²⁺和2 mM K⁺吸管中(21). 实线显示标准视紫红质光谱[Dartnall光谱(41)]，安装到数据点。卵母细胞中测得的ChR1光电流光谱(24)和感光电流，记录自C.莱因哈迪pH值为7(21)，绘制用于比较。(b条和c（c）)C.莱因哈迪细胞在黑暗（D）、低光条件（LL，0.5 W·m）下生长^–2)和强光条件（HL；10 W·m^–2). 收集膜组分并通过蛋白质免疫印迹分析。第1章_310–546针对兔的Chop1–310-546片段制备抗血清（1:1000稀释）。(b条)它识别了Chop1和Chop2。(c（c）)第二章_617–723抗血清（针对Chop2-617-723片段制备）对Chop2具有特异性。使用碱性磷酸酶偶联第二抗体检测结合。Chop1和Chop2片段表达于大肠杆菌（车道4、车道5、车道9和车道10）被吸墨以进行比较。(d日和e（电子）)如灰色条所示，蓝光使ChR2-表达细胞去极化。显示了其他四个实验中的典型电压。(d日)在林格溶液（110 mM NaCl/5 mM KCl/2 mM CaCl）中表达ChR2–315的卵母细胞₂/1 mM氯化镁₂pH值7.6）。(e（电子）)一种HEK293细胞，瞬时表达ChR2–315。使用的移液管溶液为140 mM KCl、5 mM EGTA、2 mM MgCl₂，10 mM Hepes，pH 7.4。使用的镀液为140 mM NaCl，2 mM MgCl₂，1 mM氯化钙₂，10 mM Hepes，pH 7.4。

我们测量了年轻人闪光诱导的光感受器电流的作用光谱C.莱因哈迪细胞在pH 9下，其中质子传导ChR1预期是低效率的。pH 9光谱显示最大≈485 nm，相对于所有早期的光电流光谱，该光谱是蓝移的，从未转化的单细胞或细胞群中记录(18,20,21)这表明，在高pH值下，ChR2有助于感光电流。

ChR2可用于动物细胞去极化。我们推断ChR2应该能够显著地去极化衣原体第二，ChR2的异源表达应该成为操纵细胞内Ca的有用工具²⁺浓度(图1克)或膜电位，尤其是在哺乳动物细胞中。表达ChR2卵母细胞的电流灯实验(图4d日)或HEK293电池，直径与衣原体单元格(图4e（电子）)为了测试这一承诺，我们清楚地证明了当细胞被蓝光照射时，快速光诱导去极化数十毫伏。

讨论

这项研究解决了来自藻类的第二种微生物类型视网膜蛋白（视紫红质）ChR2的分子功能是什么的问题C.莱因哈迪可能是。ChR2参与了C.莱因哈迪最近的一项研究显示(25). 西内舍科夫等。(25)把这个视紫红质命名为CSRB(衣原体感觉视紫红质B），因为其分子功能是间接揭示的（通过抑制内源性表达），并假设与古生代感觉视紫光质类似，耦合到传感器。

从Chop2-expression中的大光电流爪蟾卵母细胞或哺乳动物（HEK293和BHK）细胞，我们可以得出结论，ChR2来自C.莱因哈迪在我们的宿主系统，即两栖动物和哺乳动物细胞中有功能性表达。实验表明，Chop2结合视网膜形成ChR2，而ChR2是一种视紫红质，它与阳离子导电的光循环中间产物或换句话说，具有内在光传感器的离子通道发生光循环。该通道在阳离子中的选择性较低，但由于它不传导阴离子，所以不是非特异性的。从传导阳离子的范围可以得出结论，通道的最窄孔径或选择性过滤器(31)比电压激活Na宽⁺通道，但可能略小于烟碱乙酰胆碱受体的通道，因为四乙基铵⁺，镁²⁺和锌²⁺没有进行。

ChR1和ChR2都揭示了一个7-TM基序，该基序在其他微生物型视紫红质和G蛋白偶联受体中广为人知，但在离子通道中是新的。大多数离子通道是由亚单位的聚合物形成的，或者是具有内部重复的大蛋白(31). 一个众所周知的例外是囊性纤维化跨膜电导调节器，其中单个12-跨膜蛋白形成氯离子通道(42). 然而，到目前为止，7-TM蛋白形成阳离子通道孔的情况尚不清楚。ChR1的光控质子通道(24)可以理解，因为为光驱动离子泵BR建立的是，主动传输的质子沿着单体BR形成的氢键网络移动。对于ChR2，我们认为7-TM螺旋形成的阳离子通道必须宽（直径≈6º）才能渗透到甲基化铵阳离子。与其他视紫红质类似，我们认为该通道是由蛋白质的构象变化在光诱导异构化后打开的全反式视网膜。

假设ChR2在质膜中的表达密度类似于BR（2×10⁹每个卵母细胞；裁判。28)我们可以计算一个ChR2分子的单通道电流。在–100 mV时，我们通常获得1μA的内向电流（光电导≈10μS），相当于5×10^–16如果所有ChR2通道在饱和光下打开，则为每个分子。假设≈10%的ChR2处于开放状态（参见光循环模型），对于单通道事件，产生5 fA（或≈50 fS的单通道电导）。虽然当前5 fA的步长对应于≈3×10的营业额⁴离子每秒，它仍然太小，无法观察到，并且没有观察到单通道事件。

我们没有迹象表明ChR1或ChR2与任何信号受体蛋白（如G蛋白）或换能器（如古代感觉视紫红质I和II）耦合到各自的换能器。ChR1和ChR2的电学性质独立于蛋白质的大的亲水半部分，即7-TM区域的C末端，这一发现证实了这一观点。在C.莱因哈迪，有证据表明H有两种不同的光敏电导⁺和钙²⁺但Ca的上升时间²⁺电流和H⁺电流无法区分(21). 因此，不可能确定这两个电流是直接被光闸控制的，还是两个电流中的哪一个触发了另一个。根据表达的ChR1的实验描述(24)和ChR2（如上），我们提出以下建议：C.莱因哈迪由ChR1和/或ChR2触发。局部去极化或H⁺然后，流入很可能激活二次钙²⁺电导，也局限于眼点区域。这种次级光感受器电导衰减得更快(21)但其分子起源仍有待确定。

对ChR1和ChR2含量改变的细胞群体进行的光电流测量表明，这两种光感受器都有助于衣原体(25). 据报道，与ChR2缺失细胞相比，ChR1缺失细胞的细胞敏感性蓝移≈40 nm，表明ChR2的吸收与ChR1相比蓝移。这项研究表明，异源表达的ChR2确实显示了相对于ChR1的蓝移作用谱，因此证实了先前的建议(25). 先前报道的ChR2属性光电流的缓慢激活(25)然而，与ChR2光电流的快速激活（<200μs）相反。

ChR2可能是一种感觉光感受器，当细胞长时间暴露在暗光下（数小时）时，优先使用。事实上，ChR2触发的光电流比ChR1大得多，很明显，在较高的光强度下观察到的ChR2降解将保护细胞免受持续向内流动阳离子的有害影响，尤其是质子和钙。

这项研究揭示了微生物型视紫红质（一种直接光开关阳离子通道）的重要功能，并证明了光信号转导机制的可能性，因为它可能用于C.莱因哈迪此外，我们已经表明，在卵母细胞或哺乳动物细胞中表达ChR2可能是增加细胞质钙的有力工具²⁺浓缩或通过光照使细胞膜去极化。

补充材料

致谢

笔记

缩写：7-TM，七跨膜；细菌视紫红质；Chop，沟视蛋白；通道视紫红质；纳米g，N个-甲基-d日-葡聚糖；酸碱度_我细胞内pH值；酸碱度_哦，细胞外pH。

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