圆形Res。作者手稿；PMC 2011年2月19日发布。
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二甲基精氨酸二甲氨基水解酶的过度表达对高同型半胱氨酸血症脑血管效应的保护作用
,1 ,2 ,4 ,1 ,1 ,5 ,6 ,7 ,7 ,8 ,三 ,1,4和1
罗曼·罗迪奥诺夫
1爱荷华州爱荷华市爱荷华大学卡弗医学院内科
哈扬·达尤布
2爱荷华州爱荷华市爱荷华大学卡弗医学院神经外科
辛西娅·林奇
4爱荷华州爱荷华市爱荷华大学卡弗医学院药理学系
卡蒂娜·M·威尔逊
1爱荷华州爱荷华市爱荷华大学卡弗医学院内科
杰夫·史蒂文斯
1爱荷华州爱荷华市爱荷华大学卡弗医学院内科
特奥多罗·博蒂格里里
7德克萨斯州达拉斯贝勒代谢病研究所
约翰·库克
8加利福尼亚州斯坦福市斯坦福大学医学院心血管医学部
加里·鲍姆巴赫
三爱荷华州爱荷华市爱荷华大学卡弗医学院病理学系
弗兰克·M·法拉奇
1爱荷华州爱荷华市爱荷华大学卡弗医学院内科
4爱荷华州爱荷华市爱荷华大学卡弗医学院药理学系
史蒂文·伦茨
1爱荷华州爱荷华市爱荷华大学卡弗医学院内科
1爱荷华州爱荷华市爱荷华大学卡弗医学院内科
2爱荷华州爱荷华市爱荷华大学卡弗医学院神经外科
三爱荷华州爱荷华市爱荷华大学卡弗医学院病理学系
4爱荷华大学卡佛医学院药理学系，爱荷华州爱荷华市
5爱荷华州爱荷华市爱荷华大学药学院
6日本冈山县立大学营养科学系
7德克萨斯州达拉斯贝勒代谢病研究所
8加利福尼亚州斯坦福大学医学院心血管内科
通信地址：Steven R.Lentz，医学博士，博士，内科，C32 GH，爱荷华州爱荷华城大学，IA 52242，电话：319-356-4048，传真：319-33-8383，ude.awoiu@ztnel-nevets - 补充材料
补充1。
指南：9AD8951B-2D92-46FE-8D2A-CF97FF3A99BE
摘要
背景
高同型半胱氨酸血症是一种与一氧化氮合酶抑制剂不对称二甲基精氨酸（ADMA）相关的心血管危险因素。通过转基因小鼠过度表达ADMA水解酶二甲基精氨酸二甲氨基水解酶-1（DDAH1），我们验证了DDAH1过度表达可保护高同型半胱氨酸血症患者脑小动脉免受不利结构和功能变化的假设。
方法和结果
使用高蛋氨酸/低叶酸（HM/LF）饮食，在DDAH1转基因（DDAH1-Tg）小鼠和野生型同窝小鼠中诱导高同型半胱氨酸血症。与对照饮食相比，喂食HM/LF饮食的野生型和DDAH1 Tg小鼠的血浆总同型半胱氨酸升高了约3倍（P<0.001）。与野生型小鼠相比，无论饮食如何，DDAH1 Tg小鼠的血浆ADMA大约低40%（P<0.001）。与对照饮食相比，HM/LF饮食使野生型（12±2 vs.29±3%；P<0.001）和DDAH1-Tg（14±3 vs.28±2%；P<0.001）小鼠的脑小动脉内皮依赖性扩张减少到10µmol/L乙酰胆碱。野生型小鼠在HM/LF饮食中对10µmol/L罂粟碱（一种直接平滑肌扩张器）的反应受到损害（30±3 vs.45±5%；P<0.05），但DDAH1 Tg小鼠的反应没有受到损害（45±7 vs.48±6%）。DDAH1 Tg小鼠也能防止脑小动脉肥大（P<0.05），但不能防止HM/LF饮食诱导的颈动脉加速血栓形成。
结论
DDAH1的过度表达可保护大脑小动脉结构和血管肌肉功能免受高同型半胱氨酸诱导的改变。
关键词：氨基酸、一氧化氮合酶、内皮、血管舒张、血栓形成
介绍
高同型半胱氨酸血症是心血管疾病、缺血性中风和静脉血栓栓塞症的独立危险因素。1,2在高同型半胱氨酸血症动物模型中观察到血管舒缩功能异常、血管力学和形态改变以及血栓形成加速。三尽管有强有力的流行病学证据表明，高同型半胱氨酸血症与心血管不良事件风险增加有关，但一些大型干预试验未能证明降低同型半月氨酸治疗的任何临床益处。4–9这些试验的负面结果可能与样本量不足、叶酸强化效应造成的混淆或高剂量B族维生素可能产生的不良影响有关。10另一种可能的解释是，高同型半胱氨酸血症可能与心血管风险增加有关，因为它是另一个致病风险因素的标志。这种因子的候选者之一是不对称二甲基精氨酸（ADMA），它是一氧化氮（NO）合成酶的内源性抑制剂。10
高同型半胱氨酸血症患者可能会出现ADMA代谢失调，原因是同型半月氨酸抑制二甲基精氨酸二甲氨基水解酶（DDAH）的表达和活性，DDAH将ADMA水解为瓜氨酸和二甲胺。11–13转基因小鼠中DDAH的主要亚型DDAH1的过度表达已被证明可以保护其免受外源性ADMA对内皮功能的不利血管舒缩作用。14,15然而，尚不清楚DDAH1的过度表达是否能保护高同型半胱氨酸血症的血管后果。有趣的是，DDAH也可能通过一种独立于ADMA水解的机制影响血管功能。16,17DDAH的ADMA非依赖性细胞效应被认为涉及DDAH与细胞信号分子（如蛋白激酶A或Ras通路调节分子）的直接结合。18
本研究的目的是利用DDAH1转基因小鼠来验证DDAH1过度表达可保护高同型半胱氨酸诱导的血管功能障碍、血管肥大和血栓形成的假说。我们的研究结果表明，DDAH1转基因过表达不能保护饮食性高同型半胱氨酸血症小鼠免受内皮功能障碍或加速血栓形成的影响。相反，DDAH1的过度表达确实可以保护血管免受高同型半胱氨酸血症对血管肌肉功能和脑血管肥大发展的有害影响。高同型半胱氨酸血症小鼠血浆ADMA缺乏升高提示DDAH1的这些保护作用可能与ADMA无关。
方法
小鼠和实验性饮食
动物方案得到了爱荷华大学和退伍军人事务动物护理和使用委员会的批准。人DDAH1转基因（DDAH-Tg）小鼠14在C57BL/6背景下生成，并通过与C57BL-6小鼠回交维持。使用引物：5'–AGCACCAGCTCTACGTG–3'（正向）和5'-GCCCTTTGGGGATATT-3’（反向）通过聚合酶链反应进行基因分型。从断奶（3-4周龄）开始，给小鼠喂食控制饮食（LM485，Harlan Teklad，威斯康星州麦迪逊），其中含有6.7 mg/Kg叶酸和4.0 g/Kg L-蛋氨酸，或喂食高蛋氨酸/低叶酸（HM/LF）饮食（TD00205，Harlan-Teklad），其中包含0.2 mg/Kg叶酸和8.2 g/Kg L-甲硫氨酸。19在6-12个月大的时候对小鼠进行研究之前，一直使用对照组或HM/LF饮食。
血浆总同型半胱氨酸、ADMA和SDMA
通过心脏穿刺采集血液至EDTA（最终浓度5 mmol/L）。血浆通过离心分离、快速冷冻并储存在−80°C下。血浆总同型半胱氨酸（tHcy），定义为所有二硫键定量还原裂解后同型半月氨酸的总浓度，20通过高效液相色谱法（HPLC）使用7-氟苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-磺酸铵荧光检测进行测量。21采用邻苯二甲醛柱前衍生的高效液相色谱法测定血浆和组织中ADMA和SDMA的水平。22
免疫印迹法
主动脉或颈动脉样品在冰镇HEMGN缓冲液（25 mmol/L HEPES[pH7.6]，0.1 mmol/LEDTA，12.5 mmol/LMgCl）中均质2，100 mmol/L KCl，10%甘油[v/v]，0.1%NP-40[v/v]），含有蛋白酶抑制剂混合物（Complete™Mini-EDTA-free，罗氏应用科学公司，印第安纳波利斯）。在14000×g的温度下，在4°C下离心30分钟。使用Bradford蛋白质分析法测定上清液组分的蛋白质浓度（加州Hercules的Bio-Rad实验室）。用SDS-PAGE在10%聚丙烯酰胺凝胶上分离样品（5µg蛋白质），转移到PVDF膜（Millipore，Billerica，MA）上，并用针对大鼠DDAH1的1µg/ml单克隆抗体进行检测23在室温下保持2小时。该抗体与小鼠和人类DDAH1交叉反应。15为了控制样品装载量，在室温下用0.5µg/ml抗β-肌动蛋白单克隆抗体（马萨诸塞州坎布里奇Abcam）重新对膜进行2小时的处理。HRP结合的山羊抗鼠抗体（皮尔斯，罗克福德，IL）用作二级抗体（10 ng/ml，1小时，RT）。使用Supersignal West Femto（Pierce，Rockford，IL）检测系统显示免疫反应带。在配备Quantity1软件程序的BioRad-VersaDoc成像系统上进行密度测定。
脑小动脉的血管运动功能
如前所述，使用颅窗准备测量脑小动脉扩张。24简单地说，用室内空气和补充氧气对小鼠进行麻醉和机械通气，在左侧顶叶皮质上开一个颅窗，暴露一段随机选择的软脑膜小动脉（直径约30µm）。在乙酰胆碱（1和10µmol/L）和罂粟碱（1和1µmool/L）灌流期间，使用视频显微镜和图像剪切设备测量脑小动脉直径的变化。
脑小动脉的结构和力学
如前所述，使用颈动脉导管测量清醒小鼠的系统动脉血压。25如前所述，使用连接至伺服全压测量装置的微型移液管，通过开放式颅骨标本测量麻醉小鼠大脑一级小动脉的压力和直径。26如前所述，在基线条件下测量动脉压力和直径，并在用含有EDTA的人工脑脊液灌注脑血管使血管肌肉失活后再次测量。26通过注射氯化钾杀死动物后，在保持横截面方向的同时，将用于压力直径测量的小动脉段移除、加工并埋入Spurr的低粘度树脂中进行显微镜检查。小动脉壁的横截面积（CSA）按照在线补充中的描述进行测定。使用我们之前详细描述的方法，通过测量脑小动脉压力、直径和横截面积来计算脑小动脉的机械特性（周向应力、周向应变和切向弹性模量）。26,27
颈动脉血栓形成
如前所述，颈动脉血栓是由光化学损伤引起的。28用戊巴比妥钠（70-90 mg/kg腹腔注射）麻醉小鼠，并用室内空气和补充氧气进行机械通气。左股静脉插管给药。自由解剖右颈总动脉，并用0.5PSB多普勒血流探头（Transonic Systems，Inc.，Ithaca，NY）和数字记录系统（Gould Ponemah生理学平台3.33版）测量颈动脉血流。为了诱导内皮损伤，用1.5-mV、540-nm的绿色激光（Melles-Griot，Carlsbad，CA）从6cm的距离连续照射右颈总动脉，并通过股静脉导管注射孟加拉玫瑰红（35 mg/kg）。持续监测血流90分钟，直至出现稳定的闭塞，此时实验终止。首次闭塞被定义为血流首次降至零并持续≥10秒的时间，稳定闭塞被定义为由血流持续缺失≥10分钟的时间。
统计分析
通过双向方差分析（ANOVA）和Holm-Sidak事后检验进行多重比较，比较基因型和饮食对血浆代谢物和血管力学（小动脉压力、直径、横截面积、壁厚和切向弹性模量与应力的斜率）的影响。使用双向重复测量ANOVA和Holm-Sidak事后分析分析脑小动脉对血管扩张剂的反应。采用Mann-Whitney秩和检验和Kaplan-Meier生存分析以及log-rank检验分析基因型和饮食对颈动脉血栓形成的影响。统计学意义定义为P值<0.05。数值报告为平均值±SE。
结果
DDAH1转基因小鼠血浆tHcy和ADMA
确定DDAH1的过度表达是否可以保护同型半胱氨酸对血管的有害影响体内，我们使用HM/LF饮食诱导DDAH1 Tg小鼠和野生型同卵双胞胎的饮食性高同型半胱氨酸血症。与对照饮食相比，喂食HM/LF饮食的野生型和DDAH1 Tg小鼠的血浆tHcy升高了约3倍（P<0.001）(). 野生型和DDAH1 Tg小鼠的血浆tHcy没有差异。喂食对照组（0.29±0.02µmol/L）和HM/LF（0.30±0.02μmol/L()，但在喂食任何一种饮食的DDAH1 Tg小鼠中约低40%（P<0.001）(). 各组间SDMA水平无统计学显著差异（数据未显示）。
喂食对照饮食或HM/LF饮食的野生型和DDAH1 Tg小鼠的（A）tHcy和（B）ADMA血浆水平。填充条表示野生型小鼠，开放条表示DDAH1 Tg小鼠。数值为平均值±SEM。*与喂食控制饮食的相同基因型小鼠相比，P<0.05#与喂食相同饮食的野生型小鼠相比，P<0.05（每组n=8）。
DDAH1在主动脉和颈动脉中的表达
免疫印迹法检测DDAH1-Tg小鼠主动脉和颈动脉中DDAH1蛋白的表达(). 在野生型小鼠的主动脉或颈动脉中未检测到DDAH1蛋白的表达。饮食干预对DDAH1的表达没有显著影响（P=0.14）。
喂食对照或HM/LF饮食的野生型（Wt）或DDAH1 Tg（Tg）小鼠的（A）主动脉和（B）颈动脉中DDAH1和β-肌动蛋白的代表性免疫印迹。显示了主动脉（C）（n=5）和颈动脉合并样本（n=2，每组3只小鼠）DDAH1表达的密度分析，DDAH1的表达归一化为β-肌动蛋白，并相对于喂食对照饮食的Tg小鼠表达。
脑小动脉的血管功能
与对照组相比，喂食HM/LF饮食的野生型小鼠对内皮依赖性扩张剂乙酰胆碱的反应导致脑小动脉扩张受损(). 与对照组相比，喂食HM/LF饮食的DDAH1 Tg小鼠对乙酰胆碱的扩张器反应受损程度相似(). 与对照饮食相比，HM/LF饮食使野生型小鼠对10µmol/L乙酰胆碱的扩张器反应减少了60%（12±2 vs.29±3%；P<0.001），使DDAH1 Tg的扩张剂反应减少了50%（14±3 vs.28±2%；P<0.0001）。
脑小动脉的血管运动功能。野生型（A，C）和DDAH1 Tg（B，D）小鼠脑小动脉扩张为乙酰胆碱（A，B）或罂粟碱（C，D）。填充条表示喂食对照饮食的小鼠，开放条表示喂吃HM/LF饮食的小鼠。数值为平均值±SEM。*与喂食控制饮食的相同基因型小鼠相比，P<0.05（每组的n=7-14）。
脑小动脉对直接平滑肌激动剂罂粟碱的反应()喂食对照饮食的野生型和DDAH1 Tg小鼠之间也相似。然而，喂食HM/LF饮食的野生型小鼠对最高剂量罂粟碱（10µmol/L）的反应低于喂食对照饮食的野生类型小鼠（30±3 vs.45±5%；P<0.05）。DDAH1 Tg小鼠在对照饮食和HM/LF饮食中对罂粟碱的反应没有差异().
脑小动脉的形态和力学特性
喂食HM/LF饮食的DDAH1 Tg小鼠对内皮非依赖性血管扩张剂罂粟碱反应的相对保存表明DDAH1对血管壁结构力学可能具有保护作用。为了确定DDAH1的过度表达是否能够保护大脑微动脉结构和弹性免受高同型半胱氨酸诱导的改变，26野生型和DDAH1 Tg小鼠喂食对照组或HM/LF饲料8至12个月。处于未麻醉或麻醉状态的小鼠组之间的系统动脉平均压没有差异(). 麻醉小鼠组之间的脑动脉压力和直径也没有显著差异(). 与对照组相比，喂食HM/LF饮食的野生型小鼠脑小动脉血管壁的横截面积显著增加(和). 这些小鼠的壁厚也显著增加(和). 与之形成鲜明对比的是，与对照组相比，喂食HM/LF饮食的DDAH1 Tg小鼠的横截面积或壁厚没有增加。切向弹性模量与应力的斜率减小()应力应变曲线右移()与对照饮食相比，喂食HM/LF饮食的野生型小鼠的脑小动脉(). 这些结果反映了被动扩张性的增加，与先前在高同型半胱氨酸血症小鼠脑小动脉中的发现一致。26有趣的是，DDAH1-Tg小鼠脑小动脉的应力-应变曲线在对照组和HM/LF组之间没有差异(). DDAH1-Tg小鼠两组的切向弹性模量和应力斜率均显著高于喂食HM/LF饮食的野生型小鼠().
脑小动脉的形态学和力学特性。野生型和DDAH1-Tg小鼠脑小动脉的横截面积（A）和壁厚（B）。填充条表示野生型小鼠，开放条表示DDAH1 Tg小鼠。数值为平均值±SEM。*与喂食对照饮食的野生型小鼠相比，P<0.05#与喂食HM/LF饮食的野生型小鼠相比，P<0.05。野生型（C）或DDAH1 Tg（D）小鼠喂食对照饮食（固体符号）或HM/LF（开放符号）饮食时的周向应力与应变（每组9–11只）。
表1
| 参数 | 野生型 | DDAH 1 Tg |
|---|
| 控制饮食 | HM/LF饮食 | 控制饮食 | HM/LF饮食 |
|---|
| 最大膨胀前 | | | | |
| 系统动脉平均压（mm Hg） | | | | |
| 未嵌套 | 126±2 | 128±3 | 126±2 | 132±3 |
| 已麻醉 | 62±2 | 63±1 | 62±2 | 65±3 |
| 脑动脉压（毫米汞柱） | | | | |
| 收缩性的 | 46±2 | 48±2 | 47±2 | 50±2 |
| 舒张性 | 31±2 | 33±1 | 33±1 | 34±2 |
| 平均值 | 36±2 | 38±1 | 38±1 | 39±2 |
| 脉冲 | 15±1 | 15±2 | 14±1 | 16±1 |
| 动脉血气 | | | | |
| pCO公司2 | 34±4 | 32±3 | 34±2 | 32±3 |
| pH值 | 7.38±0.03 | 7.34±0.03 | 7.36±0.01 | 7.33±0.02 |
| 氧化铅2 | 112±5 | 118±6 | 113±3 | 112±7 |
| 大脑内动脉直径（µm） | 49±2 | 50±4 | 48±4 | 43±3 |
| 最大膨胀后 | | | | |
| 大脑动脉直径（µm） | | | | |
| 内部 | 69±2 | 68±5 | 66±4 | 62±5 |
| 外部 | 75±2 | 75±4 | 72±4 | 67±4 |
| 容器壁横截面积（µm2) | 560±39 | 712±47* | 574±45 | 500±31† |
| 壁厚（µm） | 2.4±0.1 | 3.2±0.2* | 2.5±0.2 | 2.6±0.1† |
| E类T型vs压力 | 7.27±0.55 | 5.21±0.32* | 5.91±0.58 | 5.82±0.37† |
| N个 | 9 | 11 | 10 | 11 |
颈动脉血栓形成
使用光化学损伤方法评估颈动脉血栓形成的易感性。28喂食对照饮食的野生型和DDAH1 Tg小鼠首次咬合或稳定咬合的平均时间没有显著差异(). HM/LF饮食使首次闭塞和稳定闭塞的平均时间缩短了60-70%，与基因型无关。Kaplan-Meier生存分析显示，喂食对照组和HM/LF饮食的小鼠之间的颈动脉通畅性（定义为无稳定闭塞）存在显著差异（两种基因型均P<0.05），但野生型和DDAH1 Tg小鼠之间的通畅性无显著差异().
光化学损伤后颈动脉血栓形成。（A） 喂食对照组或HM/LF饮食的野生型或DDAH1 Tg小鼠首次咬合（填充条）或稳定咬合（开放条）的时间。数值为平均值±标准偏差。*与喂食控制饮食的相同基因型小鼠相比，P<0.05（每组n=8-9）。（B） 颈动脉通畅的Kaplan-Meier生存分析，定义为服用孟加拉玫瑰红后没有稳定的闭塞时间，在喂食对照饮食的野生型小鼠中（填充圆圈），喂食对照食物的DDAH1 Tg小鼠中（开放圆圈）、喂食HM/LF食物的野生型鼠中（填充三角形），或DDAH1 Tg小鼠喂食HM/LF饮食（开放三角形）。
讨论
本研究的主要目的是验证DDAH1的过度表达可以防止高同型半胱氨酸血症对血管的不利影响这一假设。本研究有两个主要发现：1）与我们的假设相反，我们发现DDAH1的过度表达并不能防止高同型半胱氨酸诱导的内皮功能障碍或血栓形成，尽管会导致血浆ADMA显著降低。这些发现表明，至少在这个模型中，高同型半胱氨酸血症通过一种基本上独立于ADMA/DDAH途径的机制损害血管内皮功能。因此，高同型半胱氨酸血症更有可能通过其他机制产生内皮功能障碍，如蛋白激酶C对内皮NO合成酶活性的抑制29或细胞抗氧化酶活性受损导致NO氧化失活。302） 尽管DDAH1 Tg小鼠没有受到高同型半胱氨酸诱导的内皮功能障碍的保护，但它们对内皮非依赖性激动剂罂粟碱引起的血管反应受损以及脑血管壁结构和力学的改变表现出抵抗力。这些发现表明，DDAH1选择性地保护血管免受高同型半胱氨酸血症对血管肌肉的有害影响。高同型半胱氨酸血症小鼠血浆ADMA缺乏升高提示DDAH1的这些保护作用可能与ADMA无关。
我们研究的一个潜在局限性是HM/LF饮食不会导致血浆ADMA升高。在其他高同型半胱氨酸血症小鼠模型中也进行了类似的观察，13,29提高了同型半胱氨酸和ADMA之间的代谢相互作用在小鼠和人类中可能不同的可能性。然而，即使在人类中，最近的一些研究也表明，高同型半胱氨酸血症并不总是伴随着血浆ADMA的升高。31,32即使血浆ADMA没有升高，ADMA也可能在细胞内积聚并抑制血管功能，因为ADMA被血管细胞主动摄取。33另一个有趣的可能性是，我们观察到的DDAH1过度表达的保护作用可能与ADMA无关。DDAH1和DDAH2都被认为对血管细胞具有作用，而这种作用与ADMA水解无关。16,17,34未来对DDAH的催化失活变体的研究可以设计为解决DDAH在血管功能调节中ADMA非依赖性效应的作用。
与之前对小鼠饮食诱导高同型半胱氨酸血症的研究一致，19喂食HM/LF饮食的野生型和DDAH1-Tg小鼠的血浆tHcy水平比喂食对照饮食的小鼠高出约3倍。由于高同型半胱氨酸血症可导致内源性DDAH1的表达和活性降低，11,13必须证明HM/LF饮食不会改变DDAH1转基因的表达或活性。免疫印迹显示，在β-肌动蛋白启动子的控制下，人类DDAH1转基因的表达不受HM/LF饮食的显著影响，并且DDAH1基因的过度表达使喂食对照和HM/LF食物的DDAH1 Tg小鼠的血浆ADMA降低到类似的程度。这些发现表明，转基因在正常高同型半胱氨酸血症和高同型半胱氨酸血症小鼠中的表达和活性相似。
我们小组和其他小组先前的几项研究表明，高同型半胱氨酸血症动物对内皮依赖性扩张器的血管舒缩反应受损。35在一些动物模型中，包括我们首次证明轻度高同型半胱氨酸血症患者血管舒缩功能障碍的灵长类动物模型，36还观察到对内皮非依赖性血管扩张剂的反应受损。在高同型半胱氨酸血症小鼠模型中，对内皮依赖性扩张器的反应首先在幼年小鼠（小于6个月大）中受损。35在年龄较大的小鼠（6个月以上）中，经常观察到对内皮依赖性扩张器和非内皮依赖性扩张剂的反应受损。37目前的结果是，HM/LF饮食对6–12个月龄野生型小鼠脑小动脉对罂粟碱的反应产生损害()，与之前的研究结果一致。
高同型半胱氨酸诱导平滑肌功能障碍的一个潜在机制是脑血管肥大，26这可能导致最大血管扩张能力受损。38为了验证DDAH1过度表达保护血管壁免受高同型半胱氨酸诱导的结构变化的假设，我们检测了喂食对照组或HM/LF饮食的DDAH1转基因小鼠的脑小动脉壁厚度和横截面积。与我们之前的观察结果一致，26高同型半胱氨酸血症导致动脉壁肥厚变化，壁厚和横截面积均显著增加(). 与高同型半胱氨酸血症对内皮非依赖性血管舒缩反应的影响一样，DDAH1转基因的过度表达可以防止血管肥大。因此，血管壁的结构变化很可能是罂粟碱引起的损伤的部分原因。
由于HM/LF饮食没有升高血浆ADMA，DDAH1对平滑肌结构和功能的保护作用可能与ADMA无关。这种保护作用的一个潜在机制是DDAH1依赖的神经纤维蛋白1（NF1）磷酸化。34NF1已被证明调节平滑肌增殖，39因此，DDAH1对NF1活性的调节可能会潜在地影响血管壁的结构和功能。另一种可能的机制是，尽管血浆ADMA缺乏升高，但高同型半胱氨酸血症可能促进血管细胞内ADMA的积累。40如果是这样的话，那么DDAH1的保护作用可以通过增加ADMA细胞内池的代谢来介导。通过降低细胞内ADMA水平，DDAH1可以防止血管紧张素II介导的平滑肌肥大，41可能会改善平滑肌血管舒张功能。血管紧张素II 1型受体拮抗剂缬沙坦可保护高同型半胱氨酸诱导的心室肥大和血管重塑，这一观察结果支持了这一潜在机制。42,43
我们还观察到DDAH1过度表达改变了高同型半胱氨酸饮食诱导的血管壁弹性变化。正如预期，26与对照组小鼠相比，喂食HM/LF饮食8-12个月的小鼠大脑小动脉被动扩张能力增加(). 在DDAH1 Tg小鼠中未观察到HM/LF和对照饮食之间的差异(). 有趣的是，DDAH1-Tg小鼠的脑小动脉弹性似乎介于喂食对照饮食的野生型小鼠和喂食HM/FL饮食的野生类型小鼠之间（通过E斜率的差异证明T型与中显示的压力).
最后，我们验证了DDAH1过度表达可防止高同型半胱氨酸诱导的血栓形成加速的假设。我们在喂食HM/LF饮食的野生型小鼠中观察到加速血栓形成()但DDAH1的过度表达不能防止高同型半胱氨酸血症引起的加速血栓形成。这一发现表明，至少在该动物模型中，高同型半胱氨酸血症可能通过ADMA非依赖性机制导致血栓形成加速。我们的结果与我们之前的观察结果一致，即内皮NOS缺乏(3个)在小鼠中不会导致加速血栓形成。44综上所述，这些研究表明NO生成不足不是高同型半胱氨酸血症患者颈动脉血栓形成的主要机制。高同型半胱氨酸血症血栓前效应的可能替代机制包括与膜联蛋白A2结合的组织纤溶酶原激活物减少、组织因子上调或血小板过度活化。三
总之，我们测试了DDAH1在防止高同型半胱氨酸血症对血管的不良影响方面的作用。我们的结果表明，DDAH/ADMA途径不是高同型半胱氨酸诱导的内皮功能障碍或加速血栓形成的主要介质。相反，DDAH1的过度表达可保护高同型半胱氨酸诱导的平滑肌结构和功能受损。高同型半胱氨酸血症小鼠血浆ADMA缺乏升高提示DDAH1的这些保护作用可能与ADMA无关。
新颖性和意义
高血中氨基酸同型半胱氨酸水平是心血管疾病（CVD）的既定危险因素，但几项大型临床试验未能证明同型半月氨酸降低治疗对心血管有任何益处。一种可能的解释是，同型半胱氨酸升高可能是另一种致病风险因素的生物标志物，如不对称二甲基精氨酸（ADMA）。本研究的目的是利用转基因小鼠模型来确定二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶（DDAH），一种代谢ADMA的酶，是否能保护其免受同型半胱氨酸升高的不良血管影响。该研究最重要的发现是，DDAH的过度表达可以保护大脑血管壁内血管肌肉的结构和功能免受同型半胱氨酸的有害影响。有趣的是，在高同型半胱氨酸水平的小鼠中，ADMA没有升高，这表明DDAH提供的一些血管保护可能与ADMA无关。这项工作为进一步研究DDAH的ADMA依赖性和ADMA非依赖性血管效应提出了几个问题，DDAH可能是治疗心血管疾病的一个有前景的治疗靶点。
已知内容
本研究提供的新信息
致谢
作者要感谢Brett Wagner的技术援助。
资金来源
这项工作得到了美国退伍军人事务部研究与发展办公室、美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）HL63943、NS24621和CA98303拨款的支持，后者是美国心脏协会（American Heart Association）的产前奖学金（0515537Z），以及加利福尼亚再生医学研究所（California Institute for Regenerative Medicine）（RS1-00183）。
非标准缩略语和缩写
| ADMA公司 | 不对称二甲基精氨酸 |
| 加拿大标准协会 | 横截面积 |
| 迪拜国际机场 | 二甲基精氨酸二甲氨基水解酶 |
| HM/LF（高/低频） | 高蛋氨酸/低叶酸 |
| NF1型 | 神经纤维蛋白1 |
| 不 | 一氧化氮 |
| Tg（千克） | 转基因 |
| 同型半胱氨酸 | 总同型半胱氨酸 |
| 重量 | 野生型 |
脚注
出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。
期刊主题代码：[95]内皮/血管类型/一氧化氮，[47]脑循环和代谢，[145]转基因小鼠
披露
库克博士是斯坦福大学拥有的NOS通路诊断和治疗应用专利的发明者，他从中获得专利使用费。
工具书类
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