DNA甲基转移酶-3A启动子的功能多态性改变胃癌的易感性，但不改变食管癌的易感性

研究对象

我们招募了208名GC患者、96名EC患者和346名健康人（对照组）。对56例GC患者的组织样本进行免疫组织化学分析。2006年9月至2008年6月，所有患者均经组织病理学确诊，并获得患者和对照组的知情同意，以及东南大学中大医院和江苏省肿瘤医院机构审查委员会的批准。对照组是从同一家医院定期体检或同期自愿参与流行病学调查的无癌患者中选出的。我们将健康志愿者定义为在健康检查中被发现没有疾病（包括无癌症史）的人。对照组的年龄和性别与患者相匹配（表1和2).所有患者和对照均为华人，居住在中国江苏省或其周边地区。

SNP选择和荧光素酶测定

在DNMT3A的候选SNP中，我们重点研究了启动子区域的SNP（启动子中的rs1550117；GenBank登录号。NT_022184.14:g.4381840A/G）。使用携带DNMT3A启动子区域野生型或多态性等位基因的供体基因组DNA，通过聚合酶链反应（PCR）合成DNMT3A-启动子区域的片段（从-1009到+646，外显子1A的转录起始位点计为t1）。用于外显子1A启动子区域的PCR引物为5'-GGAGGACCTGGAGAGCATTG-3’（正向）和5'-TTACCGTGGCGTGG-3’（反向）。将PCR产物插入荧光素酶基因上游的pGL3-基本质粒（Promega，Madison，WI）中，通过DNA测序验证所有克隆的正确序列。启动子活性是使用Lucifierase Reporter Assay System（美国威斯康星州普罗米加）测量的。中国仓鼠卵巢（CHO）细胞在添加10%胎牛血清的最低必需培养基中生长。 5 × 10⁵将细胞铺在六孔板中，并使用Lipofectamine 2000™（Invitrogen，CA，USA）用DNMT3A启动子SNP片段和空载体pGL3-basic转染。转染后48小时收集细胞，然后在细胞裂解液中进行荧光素酶报告试验。实验分三次进行五次，结果报告为平均值±标准偏差（SD）。

DNMT3A基因分型

将样品收集到含有乙二胺四乙酸（EDTA）的血液真空管中，并保存在4°C下。如前所述，在样品采集后1周内通过蛋白酶K消化提取基因组DNA[20].DNMT3A SNP的A>G转变产生了塔阿用PCR-限制性片段长度多态性（RFLP）检测DNMT3A启动子-448A>G（GenBank登录号：。NT_022184.14:g.4381840).DNMT3A-448A>G多态性通过PCR-RFLP分析测定。PCR反应在总共25μL的基因组DNA中进行，其中包含100 ng基因组DNA、0.1 mM dNTPs、2.0 mM MgCl2、10μM引物5’-ACACACCGCTCCACCCCCT-3’（正向）和5’-TCCAGACCCCCTGCCCACAA-3’（反向），以及1.25 U Taq聚合酶（中国上海Biocolor BioScience and Technology Co，Shanghai）。PCR循环条件包括初始熔融步骤95°C 5 min，然后32个95°C循环20 s，66°C循环20s，72°C循环20min，最后延伸步骤72°C 10 min。然后用塔阿I（Takara Biotechnology Co.，Ltd，Dalian，China）在65°C下2 h，在2.0%琼脂糖凝胶上分离消化产物，并用溴化乙锭（EB）染色在紫外光下观察RFLP带。野生型G等位基因包括塔阿I限制性位点产生三条带（153 bp、94 bp和87 bp），而变体A等位基因产生四条带（247 bp、153 bp，94 bp和87bp）。为了进行质量控制，对病例/对照状态进行基因分型分析，并对所有受试者重复两次。基因分型结果100%一致。为了确认基因分型结果，随机选择PCR-扩增DNA样本(n个对每个基因型分别≥3个）进行DNA测序，结果也100%一致。

免疫组织化学

我们对56例患者的福尔马林固定石蜡包埋组织标本的4μm厚切片进行脱蜡和脱水。为了提取抗原，将切片在高压釜中120°C下加热10分钟，并用5%的正常马血清阻断非特异性反应。将所有切片与识别DNMT3A小鼠单克隆抗体稀释度为1:75（Imgenex，IMG-268A）的特异性一级抗体孵育，然后在室温下与生物素化二级抗体（抗羊IgG，抗鼠IgG稀释度为1:200；美国加州齐根实验室）孵育30分钟。然后用Vectastain Elite ABC试剂（Vector Laboratories，CA，USA）处理切片。所有切片均用苏木精进行复染。对于阴性对照制剂，反应序列中省略了一级抗体。

统计分析

使用Student’st吨-连续变量和卡方检验（χ²)分类变量测试。Hardy-Weinberg平衡用良好的fχ检验²测试和1°自由度比较受试者的观察基因型频率和预期基因型频率。利用χ²测试或菲舍尔精确测试。使用STATA 10.0软件（美国德克萨斯州STATA Corp）计算优势比（OR）和95%置信区间（CI）。P（P）<0.05被认为具有统计学意义。

一种新的功能性DNMT3A多态性的鉴定

DNMT3A基因中的几个候选SNP已保存在公共数据库中http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP网站虽然这些多态性的功能效应尚未阐明，但我们假设其中一些变体可能影响DNA甲基化的DNMT3A活性，尤其是位于基因启动子区域的DNA甲基化。通过荧光素酶分析，我们选择并研究了-448A>G多态性对DNMT3A启动子活性的影响。与-448G等位基因相比，-448A等位基因的启动子活性显著升高（超过两倍）(P（P）<0.001，图1).

SNP的基因分型

采用PCR-RFLP技术首次在中国健康对照组和GC、EC患者中检测到DNMT3A基因启动子-448A>G多态性。在GC和EC患者及对照组中检测到DNMT3A基因型AA、AG和GG。PCR-RFLP分析的基因分型通过DNA测序分析完全确认（图2).346名健康对照者中-448A>G基因型的分布为GG 63.0%、GA 34.1%、AA 2.9%，A等位基因频率为19.9%，如表所示三在病例对照研究中评估了DNMT3A启动子的-448A>G多态性以及与GC组相关的风险。病例和对照组之间的平均年龄和性别分布没有显著差异，表明基于这两个变量的匹配是足够的（表1).GC患者的平均年龄为65岁（范围34~80岁），对照组为71岁（范围32~80年）。所有患者和对照组均成功进行了DNMT3A多态性基因分型。DNMT3A-448A>G多态性分布在Hardy-Weinberg平衡中。

与DNMT3A-448A>G基因型相关的胃癌风险如表所示4和5GC患者和对照组中-448A的等位基因频率分别为32.9%和19.9%。GC组-448A>G基因型的分布（GG 49.0%，AG 36.1%，AA 14.9%）与对照组有显著差异(P（P）= 0.000).使用更常见的纯合变异基因型作为参考组（-448个GG基因型）计算OR及其95%CI。与参考组相比，AA纯合子的GC风险增加了6倍以上（OR 6.625；95%CI=3.128-14.034，P（P）= 0.000).当按患者的年龄和性别进行分层分析时，AA基因型与GC风险显著增加相关（OR 9.500，95%CI=3.029-29.796P（P）=0.000）≤60岁时为2.13倍，>60岁时更高（OR 4.452，95%CI=1.598-12.404P（P）= 0.002).AA基因型与GC风险显著增加相关（OR 10.313，95%CI=1.156-91.974P（P）=0.012），并且比男性大1.6倍（OR 6.273，95%CI=2.793-14.089P（P）= 0.000).

随后，为了探讨该SNP是否也与EC相关，我们分析了-448A>G的频率。与DNMT3A-448A>G基因型相关的食管癌风险如表所示6和7EC患者和对照组的-448A等位基因频率分别为21.9%和19.9%。EC组的-448A>G基因型分布（GG 63.5%，AG 29.2%，AA 7.3%）与对照组无显著差异。与参考组相比，AG+AA基因型（OR 0.929，95%CI=0.569-1.517P（P）=0.769）和AA纯合子（OR 2.850，95%CI=0.920-8.825P（P）=0.115）没有更大的EC风险。当按患者的年龄和性别分层分析时，只有AA基因型与EC风险增加相关（OR 7.667，95%CI=1.300-45.230P（P）=0.026）>60年。

因此，我们的数据揭示了重要的证据，即-448A的存在表明GC患者发生癌变的可能性很大，但EC患者不发生癌变，至少在中国人群中是如此。DNMT3A启动子的功能多态性改变了GC的易感性，可能是GC的风险预测因子，尤其是在中国主要受影响人群≤60岁组。

胃癌及癌旁组织中DNMT3A的免疫组化分析

DNMT3A的免疫反应性在细胞质中检测到，但在癌细胞的细胞膜中未检测到（图三).为了从背景水平信号泄漏的病例中确定阳性病例，如果组织样本中30%以上的细胞出现细胞质染色，则认为该样本显示阳性免疫反应。DNMT3A免疫反应阳性率为69.64%（39/56）。