癌症研究。作者手稿；PMC 2010年12月15日提供。
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低氧调节的Delta-like 1同源基因增强癌细胞干细胞和致瘤性
,1 ,1 ,2和1
尤里·金
1康涅狄格州纽黑文耶鲁大学医学院放射治疗学系
丹尼尔·泽尔特曼
2耶鲁大学医学院流行病与公共卫生系，康涅狄格州纽黑文
1康涅狄格州纽黑文耶鲁大学医学院放射治疗学系
2耶鲁大学医学院流行病与公共卫生系，康涅狄格州纽黑文
转载请求：钟云，耶鲁大学医学院放射治疗学系，邮政信箱208040，纽黑文，CT 06520-8040。电话：203-737-2183；传真：203-785-6309；ude.elay@nuy.gnohz - 补充资料
补充。
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摘要
氧合减少或缺氧会抑制分化并促进干细胞维持。缺氧通常发生在实体瘤中，并促进恶性进展。缺氧性肿瘤具有侵袭性，表现出干细胞样特征。然而，目前尚不清楚缺氧是否以及如何调节癌细胞分化和维持癌细胞干细胞。这里，我们表明缺氧增加了干细胞基因的表达数据链路1，或德尔塔样1同源物(果蝇属)在神经肿瘤细胞中。抑制数据链路1增强自发分化，降低克隆原性，并减少体内肿瘤生长。的过度表达数据链路1抑制分化并增强致瘤潜能。我们进一步表明，DLK1细胞质域，尤其是酪氨酸339和丝氨酸355，是维持克隆性和致瘤性所必需的。因为升高了数据链路1在许多肿瘤类型中都有表达，我们的观察表明缺氧和数据链路1可能是调节肿瘤干细胞样功能和致瘤性的重要干细胞途径。
介绍
肿瘤是如何发生、维持其生长以及向恶性肿瘤发展的，这仍是一个备受关注的话题。癌症干细胞模型假设肿瘤的生长是由一小部分癌症细胞维持的，这些细胞与正常干细胞一样，能够自我更新和分化(1). 相比之下，随机或克隆进化模型表明，生长肿瘤中的大多数肿瘤细胞能够自我更新，异质性是由克隆间变异引起的(2). 在大多数情况下，大多数肿瘤，尤其是实体肿瘤，可以用这两种流行模型的结合来解释(2). 在任何一种情况下，肿瘤微环境都可能对肿瘤干细胞的维持方式或具有生长和存活优势的亚克隆的进化和选择产生深远影响。目前，人们对肿瘤微环境在维持干细胞特性、细胞状态决定和低分化癌细胞致瘤潜能方面的作用知之甚少。
实体肿瘤包含缺氧或缺氧区域，肿瘤缺氧预示着较差的临床结果(三). 缺氧肿瘤细胞具有高致瘤性，干细胞标记物的表达导致分化较差(4,5). 低氧诱导因子-1α在低分化胰腺癌中的表达升高(6). HIF-2α似乎优先在神经母细胞瘤（NB）和脑肿瘤的干细胞样人群中表达(7,8). 这些观察结果揭示了缺氧途径与肿瘤干细胞特征之间的密切关系。我们和其他人已经证明缺氧可以抑制胚胎干细胞和祖细胞的分化(9–12). 有趣的是，我们发现(11)低氧使脂肪前体细胞处于未分化状态，并增加了DLK1或δ样1同源物的表达(果蝇属)，一种I型跨膜蛋白，优先在胚胎组织和未成熟细胞中表达(13). DLK1的高表达也见于多种肿瘤类型，尤其是神经肿瘤，如NB和胶质瘤(14–19). 然而，DLK1在肿瘤发展或进展中的作用仍有待研究。以NB细胞为模型，我们发现DLK1的表达因缺氧而增加，并在维持未分化NB表型、其克隆形成潜能和致瘤性方面发挥重要作用体内这种先前未知的低氧调节干细胞途径可能具有调节肿瘤干细胞特性维持和促进肿瘤进展的潜力。
材料和方法
细胞培养与缺氧
SK-N-BE（2）C[BE（2）C]、SK-N-ER（ER）和SH-SY5Y（SY5Y）细胞维持在MEM和F12（1:1）中，IMR32细胞维持在补充10%胎牛血清、1mmol/L丙酮酸钠和25mmol/L HEPES的MEM中，pH 7.4。逆转录病毒感染之前有描述(11,12). 全部-反式-用维甲酸（RA）或溴脱氧尿苷（BrdUrd）诱导分化。缺氧（1%O2)实验在缺氧室内进行（Invivo2400，Ruskinn Technology）和缺氧实验在Bactron厌氧室（Sheldon MFG，Inc.）中进行。使用甲磺酸去甲罗丹明（Sigma-Aldrich）模拟21%O时的缺氧效应2(11,12). 每隔一天更换缺氧室内的培养基。
肿瘤球培养
将细胞以30000个细胞/mL的速度接种在球形培养基中（参见补充材料和方法详细信息）。为了促进球体的形成，用聚甲基丙烯酸羟乙基酯（polyhydroxy-ethydramacrate，polyHEMA；Sigma-Aldrich）涂覆组织培养皿，如补充材料和方法通过重复移液或用0.05%胰蛋白酶解离细胞以获得用于传代或用于细胞计数的单细胞悬浮液。
质粒
逆转录病毒DLK-FL（全长DLK1）和DLK-Δ细胞（无细胞质结构域）构建物包含GFP公司该基因由R.Bhatia博士提供（加利福尼亚州杜阿尔特市希望城国家医疗中心；参考。19). 使用QuikChange定点突变试剂盒（Stratagene）创建DLK1细胞质域Y339F、S355A和Y339F/S355A的突变。组成活性HIF-1α突变体（P402G/P564A）如前所述(20). 组成活性HIF-2α突变体（Pro531A）来自F.Lee博士（宾夕法尼亚大学医学院，宾夕法尼亚州费城；参考文献。21)并亚克隆到pLZRS逆转录病毒载体中。
将慢病毒短发夹RNA（shRNA）构建物（shDLK-2H和shDLK-4H）克隆到CS-CDF-EG-PRE-K1f中(22)siRNA寡核苷酸（siDLK-05和siFLK-07）来自Dharmacon。详细的克隆信息和核苷酸序列如所示补充材料和方法.
实时逆转录PCR
从总RNA合成第一链cDNA。根据制造商推荐的协议，使用Power SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）对StepOne Plus（AppliedBiosystoms）进行实时PCR。引物序列可以在补充材料和方法.
染色体免疫沉淀
BE（2）C细胞在1%O培养2并根据我们之前公布的方案用于染色体免疫沉淀（ChIP）(20). 详细程序和ChIP引物序列见补充材料和方法.
Northern印迹
总RNA在1%琼脂糖凝胶中分离，并在65°C的Church’s Buffer中与[α-32P] dCTP–标记DLK1/pref-1 cDNA探针，由pCMV-Sport6.1-pref-1制备（图像6393667）。在Storm 860荧光成像仪（GE Healthcare）上观察到放射性斑点。
蛋白质印迹
如前所述进行Western blot(11)具有以下抗体：多克隆兔抗DLK1抗体（1:3000；Chemicon International）；抗Sox2（1:1000；Chemicon International）；c-kit（1:500；Zymed实验室）；CD-133（1:100；Abgent）；Notch1（1:2000）、HIF-1α（1:200）和HIF-2α（1:1000；Novus Biologicals）；增殖细胞核抗原；磷酸化细胞外信号调节激酶（ERK）和总ERK（1:1000；细胞信号），或β-肌动蛋白（1:2000；Sigma-Aldrich）。
细胞增殖试验（MTS）
用慢病毒转导BE（2）C细胞48小时，然后以2×10的密度重新接种496 well板中每孔的细胞数。然后每天使用MTS分析（Promega）分析细胞生长。
免疫荧光
将细胞用−20°C甲醇固定10分钟，然后与小鼠抗DLK1（1:100；R&D Systems）或兔抗β-微管蛋白III（1:100；Sigma-Aldrich）孵育，然后与Alexa 594–刚果化驴抗小鼠（1:500；Invitrogen）或Alexa 488–刚果化山羊抗兔（1:500；Invitrogen）孵育。使用Hoechst 33342（2μg/mL）进行核染色。
克隆测定
将NB细胞以每孔300至500个细胞的速度在6孔板中培养10至14天，菌落用结晶紫染色。电镀效率=每个输入细胞的菌落数（每个菌落≥50个细胞）×100%。
肿瘤异种移植物
通过胰蛋白酶消化收获NB细胞，重悬于冷PBS中，然后与等体积的Matrigel（BD Bioscience）混合，然后在五人一组的前背部两侧皮下注射（100μL/位点）新加坡国立大学/日本小鼠（6周龄雄性；杰克逊实验室）。每周监测两次肿瘤生长。当检测到可触及的肿瘤时，记录肿瘤摄取量。用精密卡尺测量肿瘤大小作为最长表面长度（mm；L（左）)和宽度(W公司). 肿瘤体积(V（V）; 毫米三) =LW公司2/2 (23). 所有方案均由耶鲁大学动物护理和使用委员会审查和批准。
统计
两组之间的统计差异由双尾、未配对学生的t吨使用Prizm 3.0（GraphPad Software，Inc.）进行测试。所有结果均以平均值±SEM表示。对于肿瘤生长的统计分析，使用的通用统计模型为：
哪里α和β是常数，并且t吨是经过的时间。大值α与所有日期的肿瘤大小一致。斜坡β在这个对数刻度上测量增长率。采用时间线性回归进行统计分析。
结果
缺氧加剧数据链路1表达
DLK1在mRNA和蛋白质水平上均显著增加(补充图S1A类和)在1%O下2（缺氧）或在去铁胺的存在下，去铁胺是一种在NB细胞系中的低氧化合物MYCN公司放大[BE（2）C和IMR32]或不放大MYCN公司放大（ER和SY5Y）。缺氧也可以诱导DLK1的表达(补充图S1B类). 我们选择了1%O2因为它接近pO2阈值（5–10 mmHg或0.7–1.3%O2)在临床研究中广泛用于定义肿瘤缺氧体内(三). 我们进一步发现，缺氧也增加了胶质母细胞瘤细胞和正常神经元祖细胞中DLK1的表达(补充图S1B类和C类)，建议对数据链路1缺氧在神经元前体细胞和神经元肿瘤中的表达。DLK1主要表达为一种全长蛋白，相对运动力约为50 kDa(,左边). 在ER细胞中发现了约45kDa形式的DLK1(,车道5–6)，可能是由于其细胞外结构域的酶切(24).
缺氧诱导DLK1表达。A、，定量逆转录-PCR(左边)的数据链路1mRNA。在1%、21%O下孵育16小时后，从NB细胞制备总RNA2或在100μmol/L去铁胺存在下。数据标准化为高效放射治疗mRNA在缺氧条件下无变化(柱，≥3个实验的平均值；酒吧，扫描电镜；*，P（P）< 0.05). DLK1的Western印迹(正确的)HIF-1α作为缺氧控制，β-肌动蛋白或PCNA作为负荷控制。未注明。，未确定。B、，DLK1的Western blot。BE（2）C细胞经逆转录病毒转导，逆转录病毒含有组成活性HIF-1α、组成活性HIF-2α或空载体(ctrl；左边)或表达shHIF1α、shHIF2α的慢病毒，或同时感染shHIF1(正确的). 细胞在1%（缺氧，H（H）)或21%O2(N个).C、，使用@HIF-1α或@HIF-2α抗体的ChIP。BE（2）C细胞在1%O培养2诱导HIF-α亚单位。使用两组不同的引物（DLK1-3D和DLK1-4P）检测数据链路1启动子基因RAD51系列引物作为阴性对照和VEGFA（血管内皮生长因子）引物作为阳性对照。使用终点PCR对具有预测大小的扩增子进行28个周期的验证(左边). 用qRT-PCR分析启动子结合的相对水平(正确的).D、，北方(左边)和Western印迹(正确的)对于在1%（+）或21%（−）O培养的BE（2）C细胞中的DLK12加入或不加入1μmol/L RA 24小时。
缺氧诱导所有NB细胞株HIF-1α蛋白表达(,左边). 缺氧还诱导了其他低氧诱导基因，如血管内皮生长因子（VEGF）和葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）(补充图S2A类和B类). 然而，只有BE（2）C和SY5Y细胞表达HIF-2α(补充图S2C类和D类)HIF-2α的表达与MYCN公司状态。HIF-α表达与MYCN公司这种状态可能解释NB细胞中DLK1表达的不同水平。
重要的是，仅HIF-1α或HIF-2α就足以增强DLK1的表达(左边)然而，需要同时删除HIF-1α和HIF-2α才能消除DLK1表达的低氧依赖性增加(正确的). 近端5′启动子/增强子区数据链路1该基因包含三个假定的低氧反应元件（HREs），其保守基序为5′-ACGTG-3′(25)分别为−758、−402和−248 bp。为了通过ChIP分析确定HIF结合，我们设计了两组分别位于−758 bp（DLK1-3D）和−248 bp（DLK1-4P）的HRE侧翼的引物。HIF-1α和HIF-2α与该近端共免疫沉淀数据链路1用预测大小的扩增子确定缺氧处理细胞中的启动子/增强子区域(,左边)并通过qRT-PCR(,正确的). 使用对照IgG未发现启动子结合。抗HIF-1α和抗HIF-2α抗体均未沉淀RAD51系列启动子，一个HIF非依赖性基因(26)进一步证明HIF对数据链路1发起人。与文献一致(7,27)，HIF-1α似乎结合VEGFA（血管内皮生长因子）启动子效率高于HIF-2α。这些数据清楚地表明缺氧加剧数据链路1通过HIF依赖机制转录。
数据链路1有助于维持未分化的NB表型
我们关注BE（2）C细胞，因为它们具有高水平的DLK1表达()并具有肿瘤干细胞特征(28,29). 我们发现了数据链路1信使核糖核酸(,车道3)和蛋白质(,车道7)在RA诱导的分化中显著降低。有趣的是，数据链路1缺氧（1%O2)即使在RA在场的情况下(,车道4和8). 这一结果与缺氧减少RA诱导的轴突生长的观察结果一致，这是神经元分化的标志(补充图S3). 除RA外，BrdUrd是非神经元分化的诱导剂(28,29)间接免疫荧光显示，DLK1表达也显著降低(补充图S4A类). 我们进一步发现()DLK1的表达与其他神经干细胞标记物的表达高度相关，包括c-kit、CD-133和SOX2(29,30). 这些观察结果表明，DLK1是未成熟NB细胞的真正干/祖细胞标志物。
DLK1维持未分化的NB表型。A、，用1μmol/L RA或10μmol/LBrdUrd诱导BE（2）C细胞分化5d。Western blot检测DLK1、Sox2、C-kit和CD-133。B、，BE（2）C细胞感染表达shDLK-2H、shDLK-4H或空慢病毒载体的慢病毒(控制).左侧：使用DLK1抗体对感染细胞进行染色(红色)或神经元特异性β-微管蛋白III(绿色)核染色为Hoechst 33342(蓝色). 放大倍数，×200。正确的，通过蛋白质印迹分析DLK1的表达，并从五到六个随机区域计数具有β-微管蛋白III阳性轴突的细胞(柱，均值；酒吧，扫描电镜；*，P（P）<0.0001与对照组）。C、 左侧，荧光激活细胞分选（FACS）–选择表达全长DLK1的BE（2）C细胞(DLK-FL公司)或空逆转录病毒载体(控制)在有或没有1nmol/L RA的情况下培养3天，然后如B类放大倍数，×200。正确的，从五到六个随机区域中计数神经节阳性细胞(柱，均值；酒吧，扫描电镜；*，P（P）=0.0001与RA处理的对照）。D、，以空逆转录病毒载体为对照，对表达全长DLK1的ER细胞中CD133和Notch1进行Western blot(控制).
检查数据链路1在NB细胞分化中，我们设计了两种基于慢病毒的shRNA干扰结构，shDLK-2H和shDLK-4H，其靶向两个不同的区域数据链路1mRNA。两种shDLK结构均抑制内源性数据链路1BE（2）C电池()，尽管shDLK-4H在减少数据链路1mRNA。有趣的是，BE（2）C细胞数据链路1神经元特异性β-微管蛋白III的免疫荧光显示，在正常培养条件下敲除自发形成的神经元过程(). 仅在表达shDLK-2H或shDLK-4H的细胞中观察到自发分化，但在对照感染细胞中未观察到(补充图S4B类). 我们使用两个单独的siRNA寡核苷酸进一步证实了这一观察结果(补充图S4C类). 我们还发现交感神经肽神经递质基因神经肽酪氨酸的表达(NPY（净现值）; 裁判。5)在用RA处理或用shDLK-4H转导的BE（2）C细胞中增加(补充图S5A类和B类). 然而HASH-1型(ASCL1公司)，一个参与早期交感谱系承诺的基因(5)，在RA诱导分化过程中减少(补充图S5A类)，但不在慢病毒shDLK-4H的转导上(补充图S5B类)，提示RA和shDLK诱导的分化可能涉及非重叠途径。这些结果清楚地表明数据链路1使NB细胞易于自发分化。
另一方面，DLK-FL的过度表达显著抑制了RA诱导的轴突形成(P（P）<0.0001与经RA处理的对照组相比；)并导致干细胞标记物CD133和Notch1水平升高()表明干细胞特征增强。总的来说，这些数据表明数据链路1维持未分化NB细胞表型。
此外，我们发现DLK1可能会影响神经干细胞中积极参与的其他细胞质途径，包括表皮生长因子受体（EGFR）、成纤维细胞生长因子受体和Notch(31–36). EGFR、FGFR1和Notch水平显著降低(补充图S6A、 C类，以及E类)在用RA或BrdUrd处理的细胞中，以及数据链路1击倒(补充图S6B、 D类，以及F类). 另一方面，RA或BrdUrd处理的BE（2）C细胞ERK磷酸化显著增加(补充图S6克)，以及shRNA(补充图S6H（H）)这与神经元祖细胞分化过程中ERK磷酸化增加一致(37). 总之，这些观察结果表明，shDLK诱导NB细胞自发分化过程中可能涉及多种信号通路。然而，DLK1是否直接调控这些不同的途径尚待确定。此外，值得注意的是NPY（净现值）表达式(补充图S5B类)和ERK磷酸化(补充图S5C类)在缺氧条件下，shDLK转导的细胞中仍然发生，这表明缺氧不能完全阻断shDLK诱导的自发分化。
数据链路1调节肿瘤球的形成
在球形培养基中作为非粘附球体生长的能力已被广泛用于评估癌症干细胞特征(30,38). 本研究中使用的四种NB细胞株都能形成肿瘤球(补充图S7A类)尽管程度不同。与含血清培养基中的粘附细胞相比，肿瘤球中DLK1的表达强烈增加(,左边). 在组织培养皿中培养时，BE（2）C细胞在球形培养基中逐渐形成肿瘤球(补充图S7B类). 有趣的是，DLK1的表达随着肿瘤球的生长而增加(,中间的)进一步表明DLK1表达增强与肿瘤球形成之间的关系。
DLK1调节肿瘤球体的形成。A、 左侧，DLK1在球形培养基中培养的NB细胞系中的表达(球)或在标准生长介质中(控制).中部，球形培养液中BE（2）细胞球形形成过程中DLK1表达的动力学(速度（SphM）)1至4天。正确的，在含有生长介质的组织培养皿中培养2 d的BE（2）细胞中DLK1的表达(总经理/技术委员会)、带球形培养基的组织培养皿(转速M/TC)或带有球形介质的聚HEMA涂层盘子(SphM/pHEMA公司).B、，BE（2）C细胞感染慢病毒[shDLK-2H、shDLK-4H或载体(控制);左边]或转染siRNA寡核苷酸[siDLK-05、siDLK-07或非靶向siRNA（ctrl）；正确的]. 48小时后将细胞接种到聚HEMA涂层的六孔板中，并在球形培养基中培养4天。收集球体，然后用胰蛋白酶进行细胞计数(柱，均值；酒吧，扫描电镜；n个= 6; *,P（P）<0.0003与对照组）。Western blot证实DLK1基因敲除。C、，BE（2）C细胞感染表达shDLK-2H、shDLK-4H或载体的慢病毒(控制). 使用MTS分析每天测量细胞生长(点，均值；酒吧，扫描电镜；n个= 4; *,P（P）与对照组相比<0.05，单向方差分析）。D、，FACS分拣的SY5Y细胞[DLK-FL或空载体(控制)]和未感染细胞(没有人)在球形培养基中培养5天。计数肿瘤球中的细胞(柱，均值；酒吧，扫描电镜；n个= 6; *,P（P）<0.04（与对照组相比）。Western blot证实DLK1表达。
为了确定增加了数据链路1我们比较了DLK1在三种不同条件下的表达，这是由于球体形成而产生的，而不仅仅是球体介质的影响(一)作为单层在具有规则生长介质的组织培养皿中(总经理/技术委员会), (b条)作为粘附细胞和非粘附细胞的混合物，在带有球形培养基的组织培养皿中(转速M/TC)，或(c（c）)用球形培养基在涂有polyHEMA的盘子中进行完全非粘附培养(SphM/pHEMA公司). 如所示(正确的)与GM/TC对照相比，球形培养基通常增强了DLK1的表达。在迫使肿瘤球形成的SphM/pHEMA条件下，DLK1表达更强劲地增加。我们使用缺氧标记物盐酸吡莫尼唑（hypoxyprobe-1）进一步确定肿瘤生长球中是否出现缺氧。6天大的肿瘤球中只有≤16%的细胞缺氧(补充图S7C类)表明肿瘤球中DLK1表达增加不太可能是由缺氧引起的。因为“球形培养”条件有助于干细胞和/或祖细胞的扩增或富集，所以作为球形生长的NB细胞可能具有增强的干细胞特性。因此，在“球形培养”条件下DLK1表达增加可能与干细胞特性增强有关。
BE（2）C细胞只能形成松散的细胞聚集体(补充图S7A类)这使得很难准确测量球体/聚集体的尺寸或数量。因此，我们检查了数据链路1通过计算肿瘤球中的细胞总数来调节肿瘤球的生长。我们发现它被撞倒了数据链路1shRNA结构的表达(,左边)或siRNA寡核苷酸(,正确的)导致肿瘤球体生长显著减少。当细胞维持在常规培养基中时，shDLK结构也会降低细胞生长()与促进自发分化的作用一致。相反，SY5Y细胞中DLK-FL的表达（DLK1-low）促进了肿瘤球的生长(). 然而，在常规培养条件下，DLK-FL的过表达并没有改变SY5Y细胞的生长速度(补充图S7D类). 尽管如此，这些结果表明数据链路1在调节NB细胞作为锚定非依赖性肿瘤球的生长能力方面起着重要作用，这是肿瘤干细胞特性的一个重要方面。
数据链路1促进克隆形成在体外
克隆形成性衡量单个细胞形成克隆的能力或自我更新的潜力。如所示在常氧和缺氧条件下，ER细胞中DLK-FL的过度表达（DLK-low）显著增强了克隆形成性（%平板效率），而shRNA介导的内源性数据链路1在BE（2）C细胞中（DLK1-high），克隆原性显著降低(). 同样，用siRNA寡核苷酸瞬时转染也显著降低BE（2）C细胞的克隆形成生长(补充图S8)尽管不如慢病毒shRNAs有效。这种差异可能是由于寡核苷酸与组成性表达的shRNAs相比具有短期效应。
DLK1调节克隆生长体外试验。A、，ER细胞经FACS分类以稳定表达DLK-FL或空载体(控制).B、，BE（2）C细胞感染慢病毒表达shDLK-2H、shDLK-4H或空载体(控制).左侧，殖民地的代表性形象。中部，电镀效率=每次输入菌落百分比±SEM(n个= 6; *,P（P）<0.0001与各自的对照）。正确的，蛋白质印迹。
DLK1细胞内结构域（约50个氨基酸）包含两个推测的磷酸化位点Y339和S355，在哺乳动物中高度保守()表明DLK1细胞质结构域可能是其生物功能所必需的。为了验证这一假设，我们创建了以下逆转录病毒结构：(一)DLK1细胞质结构域缺失（DLK-ΔCyto）(b条)具有单一突变的全长DLK1，Y339-对苯丙氨酸（F）或S355-对丙氨酸（a），以及(c（c）)两种突变的全长DLK1（Y339F/S355A）。在常氧和缺氧条件下，稳定表达DLK-ΔCyto、Y339F、S355A或Y339F/S355A的BE（2）C细胞的克隆原性显著降低()以及肿瘤球的生长减少(). 这些结果表明，DLK1细胞质结构域可能在促进克隆形成生长和肿瘤球体形成中发挥重要作用。然而，在常规组织培养条件下，DLK-ΔCyto和Y339F/S355A似乎对自发分化或细胞生长没有显著影响。这两个DLK1突变体可能仅在某些应激条件下发挥其显性负效应，例如在肿瘤球培养基或克隆形成条件下。
DLK1细胞质结构域是克隆生长和肿瘤球体形成所必需的。A、，不同哺乳动物DLK1细胞质结构域的比较。箭头，假定的磷酸化位点[酪氨酸（Y）-339和丝氨酸（S）-355]。B、，BE（2）C细胞被FACS分类为缺乏细胞质结构域的DLK1(DLK-Δ细胞；左边)、DLK1点突变[Y339F（苯丙氨酸）、S355A（丙氨酸）或Y339F/S355A；正确的]或空向量(控制). 克隆测定按. *,P（P）<0.0002与对照组相比。C、，FACS分选的BE（2）C细胞在球形培养基中培养4d(). *,P（P）与对照组相比<0.002。
数据链路1促进致瘤性体内
利用裸鼠皮下异种移植试验，我们发现BE（2）C细胞通过shRNA介导的数据链路1表达表现出更长的肿瘤延迟(,左边). shDLK-2H和shDLK-4H肿瘤在生长过程中体积明显较小(P（P）每组与对照组相比<0.002；,中间的)实验结束时的重量(P（P）各组与对照组相比均<0.05；,正确的). 有趣的是，在BE（2）C细胞中DLK-Δ细胞和Y339F/S355A突变体的过度表达降低了总体肿瘤摄取率并延缓了肿瘤生长(). 据统计，Y339F/S355A肿瘤较小(P（P）=0.044），增长速度较慢(P（P）=0.022），在生长的前21天内比载体对照高。在肿瘤生长后期，肿瘤生长速度相似。DLK-Δ细胞瘤的平均生长速率与Y339F/S355A肿瘤的平均生长速率几乎相同。然而，DLK-Δ细胞与对照组之间的差异没有统计学意义，可能是由于单个肿瘤大小的差异。然而，这些数据表明DLK-ΔCyto和Y339F/S355A突变体可能具有显性负功能。
DLK1调节致瘤性体内试验。A、，BE（2）C细胞感染表达shDLK-2H、shDLK-4H或空载体的慢病毒(控制).B类和C、，对BE（2）C和ER细胞进行FACS分类，以获得每个结构的表达。皮下注射细胞(n个=10）裸鼠双侧前背部：2.5×105用于ER电池（对照或DLK-FL）和4×105BE（2）C细胞（对照，shDLK-2H，shDLK-4H，DLK-ΔCyto，Y339/S355A）。肿瘤摄取量（%）=形成肿瘤数/注射部位数×100(左边). 肿瘤体积（mm三)=（长×宽2) × 1/2 (A、 中间或B类–C、 权利). 肿瘤重量=平均值±扫描电镜；*，P（P）<0.05与对照组(A、 右). 有关统计的讨论，请参阅文本。
另一方面，ER细胞中DLK-FL的过度表达（DLK1-low）加速肿瘤摄取或缩短肿瘤潜伏期(). 患有DLK-FL的ER细胞产生的肿瘤更大(P（P）<0.01）并且增长更快(P（P）<0.04）比控制电池(). 然而，DLK-FL组和对照组之间的生长速度差异在第16天之后似乎缩小。然而，我们额外的异种移植实验结果也表明，DLK-FL增强了致瘤性，而DLK-ΔCyto和Y339F/S355A降低了致瘤率(补充图S9). 这些结果表明，DLK1在调节致瘤性中起着重要作用体内.
讨论
缺氧是一个重要的环境因素，似乎有利于未分化的干细胞或祖细胞，包括人类胚胎干细胞、神经元和其他间充质祖细胞(9,10,12,20). Jögi及其同事(5)已经表明缺氧NB细胞获得了一个不成熟的表型，而缺氧处理的NB细胞生长稍快体内最近的基因组学研究进一步揭示，低分化人类肿瘤显示出与正常胚胎干细胞相似的基因表达特征(39)或血统承诺的祖细胞(40). 然而，干细胞基因如何调节肿瘤进展，以及它们的表达如何受肿瘤微环境的调节，这在很大程度上尚不清楚。
数据链路1，是的成员缺口/三角形/锯齿家族，优先在具有再生潜能的未成熟细胞中表达(13,15).数据链路1抑制脂肪生成(24)而且似乎还可以调节造血干细胞的分化(17,19)和淋巴祖细胞(41,42). 提升的表达数据链路1在多种肿瘤细胞中发现，包括NB(18)、胶质瘤(16)，小细胞肺癌(43)和白血病(17,19). 其他证据表明数据链路1可能抑制肿瘤细胞分化并增加增殖(16,19). 尽管如此数据链路1目前对肿瘤的进展仍知之甚少。
在这份报告中，我们发现缺氧加剧数据链路1通过HIF依赖机制表达。数据链路1敲低导致NB细胞的自发分化增强，肿瘤球体生长减少，克隆形成性降低在体外和致瘤性降低体内另一方面数据链路1抑制分化并促进致瘤性。我们的数据进一步揭示了DLK1细胞质结构域的重要作用，特别是保守的推定磷酸化位点Y339和S355。与我们的研究结果一致，李和同事(19)已经发现DLK1细胞质结构域是阻断RA诱导的人早幼粒细胞HL-60细胞分化所必需的。我们的观察提供了强有力的证据数据链路1作为一类新的干细胞基因，在调节肿瘤干细胞特性和致瘤性方面发挥着重要作用。
我们的数据表明，DLK1可以对包括EGFR、FGFR和Notch在内的几种促进神经干/祖细胞维持或自我更新的膜相关信号通路产生潜在影响(31–36)以及ERK磷酸化(37). 显然，DLK1功能的机制可能涉及多个途径。我们不能排除这种可能性，即这些信号通路的变化是由shDLK诱导的自发分化引起的，而不是直接由与DLK1的相互作用丧失引起的。DLK1功能的确切机制值得进一步研究。
最近的研究表明，少数未成熟的NB肿瘤细胞位于血管周围间隙体内对HIF-2α显示出强烈的免疫化学染色(7,44). 这些HIF-2α+细胞似乎也对MYCN公司放大(44). 然而，我们发现HIF-2α在NB细胞系中有差异表达，尽管HIF-1α普遍表达，并且与MYCN公司放大。HIF-1α和HIF-2α可能由不同的机制调节，特别是在体内条件。与这个概念一致，我们之前的研究(11)发现HIF-2α仅在分化的脂肪细胞中表达，而在祖细胞中不表达，并且在21%的氧浓度下稳定2HIF-2α表达升高似乎优先与NB肿瘤的干细胞样人群相关(7,44)或胶质瘤(8). 因为我们的数据表明HIF-1α和HIF-2α都能够增强数据链路1转录，确定HIF-2α表达升高，尤其是在血管周围小生境中，是否对数据链路1表达体内。我们的观察结果与其他人一起支持了一种新的范式，即缺氧信号通过上调干细胞基因（包括数据链路1有助于维持或选择具有干细胞特征的癌细胞。
致谢
拨款支持：NIH拨款R01CA125021（Z.Yun）。Y.Kim的部分资助来自NIH的机构博士后培训拨款（5-T32-CA009259）和耶鲁大学医学院的Anna Fuller基金奖学金。
我们感谢斯隆-凯特琳纪念癌症中心的Nai-Kong V.Cheung博士研究SK-N-ER细胞，感谢福特汉姆大学的Robert Ross博士研究BE（2）C细胞，感谢耶鲁大学的A.N.Van den Pol博士研究成人大脑和胚胎组织的人类星形细胞祖细胞，感谢。希望之城国家医学中心的Ravi Bhatia负责全长DLK1和DLK1-ΔCyto，宾夕法尼亚大学的Frank Lee博士负责HIF-2αP531A，东京都市医学科学研究所的Kazufumi Katayama博士负责慢病毒shRNA载体，Yun实验室的成员，特别是任永明博士，感谢建设性建议和技术援助，以及Lisa Cabral出色的编辑协助。
工具书类
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