植物细胞。2003年12月;15(12): 2929–2939.
拟南芥异染色质建立过程中5S rDNA染色质组织和转录的变化
,一 ,b条 ,一 ,c(c) ,c(c) ,b条和1,一
奥利维尔·马修
一UnitéMixte de Recherche Centre National de la Recherche Scientifique,法国奥比埃尔塞德克斯,布莱斯·帕斯卡大学,BIOMOVE,6547号,邮编63177
祖扎娜·贾斯坎科娃
b条德国Gatersleben D-06466植物遗传学和作物研究所细胞遗传学系
伊莎贝尔·维伦特
一UnitéMixte de Recherche Centre National de la Recherche Scientifique,法国奥比埃尔塞德克斯,布莱斯·帕斯卡大学,BIOMOVE,6547号,邮编63177
安妮·瓦莱里·根德雷尔
c(c)法国国家农业研究所-国家科学研究中心,法国埃弗里·塞德克斯,邮编:91057,Recherche en Génomique VéGétale
文森特·科罗特
c(c)法国国家农业研究所-国家科学研究中心,法国埃弗里·塞德克斯,邮编:91057,Recherche en Génomique VéGétale
英戈·舒伯特
b条德国Gatersleben D-06466植物遗传学和作物研究所细胞遗传学系
西尔维特·图尔门特
一UnitéMixte de Recherche Centre National de la Recherche Scientifique,法国奥比埃尔塞德克斯,布莱斯·帕斯卡大学,BIOMOVE,6547号,邮编63177
一UnitéMixte de Recherche Centre National de la Recherche Scientifique,法国奥比埃尔塞德克斯,布莱斯·帕斯卡大学,BIOMOVE,6547号,邮编63177
b条德国Gatersleben D-06466植物遗传学和作物研究所细胞遗传学系
c(c)法国国家农业研究所-国家科学研究中心,法国埃弗里·塞德克斯,邮编:91057,Recherche en Génomique VéGétale
收稿日期:2003年9月16日;2003年9月26日接受。
摘要
在拟南芥新品种哥伦比亚中,5S rDNA位于染色体3、4和5的着丝粒周围异染色质中。一个主要和一些次要的5S rRNA物种都是从第4和第5染色体表达的,而第3染色体上的基因没有转录。在这里,我们表明,与4天龄或更老的气生植物组织相比,2天龄幼苗中的5S rDNA甲基化降低,并且小的5S r RNA物种在此阶段表达最丰富。类似地,当5S rDNA通过5-氮杂胞苷处理或通过DNA甲基化减少1(ddm1型)突变后,小5S rRNA的表达增加。我们还发现,在成熟野生型植物的叶核中,5S rDNA的转录部分形成了发自色心的环。这些环在成熟细胞核中扩大ddm1型与异色色心相比,植物富含组蛋白H3,组蛋白H3Lys-9乙酰化,Lys-4甲基化。发芽后4天,异染色质尚未完全发育:5S rDNA位于前染色中心,不形成明显的环,并且显示出最低的转录水平。我们的结果表明,5S rRNA基因的表达和染色质组织在异染色质形成过程中发生了变化。
结果
5S rDNA甲基化
在植物和哺乳动物中,异染色质的DNA含有大量的5-甲基胞嘧啶(5mC),拟南芥中5S rDNA高度甲基化(Mathieu等人,2002b). 5S rDNA胞嘧啶残基的甲基化频率通过HpaII消化后基因组DNA的DNA凝胶印迹分析进行估算,并量化与5S rDNA单体单位相对应的0.5-kb带,其强度与甲基化频率成反比(; 每个实验点重复五次)。Hpall被序列5′-CCGG-3′中任一C的甲基化所抑制。正如所料,在ddm1型突变体(Vongs等人,1993年)以及用胞嘧啶甲基化抑制剂化合物5-氮杂胞苷(5-azaC)处理的野生型植物(琼斯,1985年;哈夫,1995)与未经处理的野生型植物叶片相比,5S rDNA甲基化的程度要低得多(Mann-WhitneyU型测试[U],1%显著性水平)。在成株野生型植物中,5S rDNA在叶片、茎和绿色西力克中甲基化程度相同(U,P>0.01)。与3周龄野生型叶片相比,5S rDNA在根中甲基化较少,在花中甲基化较多(U,P<0.01)。4日龄叶片(从4日龄幼苗中移除根)的5S rDNA甲基化水平与3周龄叶片相当(U,P>0.01)。然而,在萌发后不久(2天),5S rDNA甲基化与4天和3周龄叶片相比显著降低(U,P<0.01)。
5S rDNA甲基化、5S rDNA定量转录和在TFIIIA表达模式。
(A)5S rDNA的DNA甲基化。从不同组织和发育阶段以及5-azaC和ddm1型植物,用Hpall消化,并在凝胶印迹上用5S rDNA探测。5S rDNA甲基化是通过量化0.5-kb条带的强度(用全线放射性标准化)来估算的,该条带对应于5S rDNA的单体单位(箭头)。凝胶下方的直方图中显示了五个独立实验的量化结果,平均值的标准偏差显示在每个条形图上。WT,野生型。
(B)5S rRNA在不同器官、发育阶段和低甲基化植物中的含量。使用5S rDNA探针对总RNA进行杂交。使用18S rRNA或RAS相关核蛋白对每行中的RNA数量进行标准化(Haizel等人,1997年)探针和溴化乙锭(EtBr)剖面图以及5S rRNA的数量也相应地进行了量化。五个独立实验的结果显示在相应的直方图中,平均值的标准偏差显示在每个条形图上。由于使用了另一种RNA纯化方法(见方法),因此种子中获得的结果单独列出。为了进行比较,还使用该方法纯化了野生型成熟叶片的总RNA。
(C)的表达式模式在TFIIIA mRNA在TFIIIA通过半定量RT-PCR进行。本构表达式APT1型基因被用来使cDNA数量正常化。
5秒。rRNA数量和5S rRNA异质性
为了研究5S rDNA转录,我们进行了RNA凝胶印迹实验和逆转录酶介导(RT)PCR分析。RNA凝胶杂交显示,成熟的3周龄叶片、茎和4天龄叶片中的5S rRNA数量保持不变(U,P>0.01),而2天龄幼苗中只有30%的5S r RNA数量出现(U,P<0.01)。花、角果和根的5S rRNA含量是叶片的两到三倍,种子的5S rRNA含量是叶片的六倍(U,P<0.01)。在成熟叶片中ddm1型在5-azaC处理的植物中,5S rRNA的数量与野生型叶片中的相同()(U,P>0.01)。
为了分析异质5S rRNA物种的相对表达水平,我们对总RNA样本进行了RT-PCR实验(). 对于每个样品,在测序之前,先进行两到四次独立的RNA纯化,然后进行RT-PCR。通过DNase I处理完全去除污染5S基因组rDNA(参见方法)。成熟的野生型叶、绿色西力克叶、花和4天龄叶含有少量(~3.25%)的5S rRNA。在3周龄的成熟野生型叶片组织中,次要5S rRNA基因受到抑制,异染色质完全形成(见下文);因此,这一阶段被用作参考。值得注意的是(Fisher精确检验;见方法),在2天龄的幼苗、根系和5-azaC处理的和ddm1型植物(13.2至22.7%)。在成熟种子中,13.6%的5S rRNA是胚胎发生过程中积累的小RNA。
表1。
样品 | 数量 小调5S rRNA 克隆 | 总计 克隆一 | 的百分比 次要5S rRNA | 重要性 水平b条 |
---|
野生型 | | | | |
3周龄叶片 | 2 | 103 | 1.9 | 参考 |
2日龄幼苗 | 9 | 53 | 17 | 0.001* |
4天大的叶子 | 1 | 56 | 1.8 | 0.717 |
种子 | 6 | 44 | 13.6 | 0.009* |
根 | 7 | 53 | 13.2 | 0.008* |
Silique公司 | 3 | 51 | 5.9 | 0.203 |
花 | 2 | 58 | 3.4 | 0.456 |
ddm1型 | | | | |
3周龄叶片 | 12 | 54 | 22.2 | 0.00005** |
2日龄幼苗 | 11 | 55 | 20 | 0.0002** |
5-氮杂碳(1mM) 3周龄叶片 | 10 | 44 | 22.7 | 0.0001** |
这些结果表明,在低甲基化植物中(5-azaC处理和ddm1型)在一些组织(根)和萌发后不久(2天),当5S rDNA甲基化较低时,转录了额外的5S rRNA基因以产生较小的5S r RNA物种。相比之下,4天龄和3周龄野生型叶片的5S rRNA数量和5S rDNA甲基化水平相同,但含有相同比例的小5S rRNAs。
5S rRNA异质性、5S rDNA甲基化与植物发育的相关性
5S rRNA异质性、5S rDNA甲基化和5S rRNA数量结果总结于使我们得出以下结论。(1) 5S rRNA数量与5S rDNA甲基化之间没有相关性。(2) 5S rRNA的数量与次要5S rRNAs的比例没有相关性。(3) 次要5S rRNA比例与5S rDNA甲基化水平呈负相关。换言之,5S rDNA甲基化越少,小5S rRNA比例越高,尽管这种关系不是严格的线性关系。(4) 与4日龄或3周龄叶片相比,2日龄幼苗的5S rDNA甲基化水平较低,次要5S rRNA比例较高。
表2。
相对5S rRNA数量、次要5S rRNAs比例和5S rDNA甲基化水平
| 野生型
| ddm1型
|
---|
功能 | 根 | 二维一 | 第4天b条 | 叶子c(c) | 阀杆 | 花 | Silique公司 | 种子 | 二维一 | 3瓦d日 | 5-氮杂碳e(电子) |
---|
相对5S rRNA量 | 2.3(f) | 0.3(f) | 1.1 | 1 | 1.1 | 2(f) | 3.1(f) | 6.3(f) | 第克 | 1.1 | 1.1 |
次要5S rRNA(%) | 13.2小时 | 17小时 | 1.8 | 1.9 | 第 | 3.4 | 5.9 | 13.6小时 | 20小时 | 22.2小时 | 22.7小时 |
相对5S rDNA甲基化(%)我 | 44.4(f) | 59.5(f) | 89.3 | 100 | 88.5 | 125.5(f) | 103.9 | 第 | 1.1(f) | 1.8(f) | 9(f) |
在TFIIIA mRNA水平与5S rRNA水平相关
由于5S rRNA的数量既与次要5S rRNAs的比例无关,也与5S rDNA甲基化无关,因此我们探讨了5S rDNA-特异性转录因子在TFIIIA公司(Mathieu等人,2003年)可能是5S rDNA表达的限制因素。RNA凝胶印迹分析无法检测到该转录物。相反,在通过半定量RT-PCR对5S rDNA转录分析的相同RNA样品的TFIIIA mRNA数量进行估算,每个实验有五个独立的重复。
结果显示在TFIIIA mRNA()和5S rRNA总量(). 例如,含有最高5S rRNA的西力克和种子也积累了最高数量的在TFIIIA mRNA。花和根的含量略高在TFIIIA mRNA水平和5S rRNA两倍于叶片。虽然在ddm1型和5-azaC处理的叶片中,转录了额外的小5S rRNA基因在在这些低甲基化背景和野生型叶片之间观察到TFIIIA mRNA数量。这一结果与5S rRNA在ddm1型5-azaC处理的野生型叶片(). 总之,这些结果表明在TFIIIA是5S rRNA基因转录的限制因子。这种普遍模式的一个例外是在2天龄的幼苗中发现的,其中含有类似水平的在TFIIIA mRNA表达到更成熟的组织,但其表达量仅为5S rRNA的30%。
2日龄幼苗的细胞核含有前染色单体和少量异染色质
2日龄幼苗中总5S rRNA转录物表达减少的一个可能解释是,在此阶段未完全形成最佳5S rDNA转录的适当染色质结构。因此,我们使用细胞学方法研究了发芽后2天与后期5S rDNA的染色质结构。四日龄和三周龄的叶核ddm1型根据4′,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色强度,平均染色中心(CC)比相应的野生型细胞核小。在野生型和ddm1型植株中,CCs小于相应的4天龄和3周龄叶核中的CCs,被认为代表前染色中心(前CCs)(). 通过测量CCs/pre-CCs相对于整个细胞核的面积和染色强度来定量异染色质含量(). 与以前的数据一致(Soppe等人,2002年),与野生型细胞核相比,色心分数减少了近三分之一ddm1型3周龄植物的叶核。野生型和ddm1型2日龄细胞核约为4日龄和3周龄野生型植物叶核测量值的一半()揭示了组成异染色质的发育动态,并表明在拟南芥叶片萌发后4天CCs完全发育。我们的结果还表明,异染色质在野生型和ddm1型2到4天之间,尽管此过程在ddm1型其中成熟CC保持较小规模。
2日龄发芽后幼苗的细胞核比4日龄和3周龄植物叶片的细胞核含有更少的异染色质。
(A)来自2日龄幼苗和4日龄幼苗以及3周龄野生型(WT)和ddm1型植物。ddm1型3周龄植物的叶核比相应的野生型细胞核含有更小的色心。在2天龄幼苗的细胞核中,可以看到小而弱染色的前染色中心(箭头)。棒=5μm。
(B)拟南芥野生型2日龄、4日龄和3周龄细胞核的显色分数ddm1型.百分数来自每个核60至68个的测量值,平均值的标准误差显示在每个棒上。在野生型和ddm1型4日龄和3周龄细胞核的色心分数相等(P>0.05),而2日龄细胞核的色心分数差异显著(P<0.05)。全部ddm1型值与野生型值显著不同(P<0.05),但野生型2日龄与野生型相比ddm1型2日龄植株(P>0.05)。
由于与4天龄和3周龄的叶核相比,2天龄的植株含有较低的5S rDNA甲基化水平、较低的总5S rRNA量、较高的次要5S rRNA比例和较小的异染色质组分,因此我们得出结论,在萌发后的第2天和第4天,5S rDNA转录活性发生了转换,与成熟异染色质的建立相关。
5秒。3周龄CCs中的rDNA“环”放射,但2天龄细胞核中没有
以下较小的CCddm1型由于低拷贝着丝粒周围序列分散在远离CCs的地方,3周龄的叶核中含有较少的DNA(Soppe等人,2002年). 小5S rRNA比例较高,5S rDNA甲基化水平较低,CCs较小ddm1型与野生型3周龄细胞核相比,我们不禁要问,5S rDNA是否也在ddm1型3周龄的植物。用5SrDNA进行荧光原位杂交(FISH)在CCs内外产生信号ddm1型3周龄的核,但令人惊讶的是,在野生型3周龄核中(). 对CCs处的5S rDNA信号与CCs外的信号进行计数表明,环形成的5S r DNA信号显著(χ2测试,P<1%)更频繁ddm1型(n个=54个细胞核)比野生型(n个=58个核)(非环与环5S rDNA信号的比率分别为1:3.1和1:1.8)。通过5S rDNA和45S rDNA信号的存在,可以观察到CC4(染色中心4)以及其他无法从细胞学上区分的5S rDNA-携带CCs的CCs,如CC3和CC5。
5S rDNA环从3周龄植物细胞核中的嗜铬粒中释放出来。
用5S rDNA探针(绿色)在3周大的孩子身上钓鱼(A)和2日龄(C)野生型(WT)和ddm1型植物(中箭头指示的循环[A]).(B)图中显示了一个野生型细胞核(插图)的扩大,它来自一个3周龄的植物,5S rDNA环(间断白线)从色心(圆圈)发出。5S rDNA信号的部分位于异色色心(小箭头),其他部分在常染色质内形成环路(大箭头)。在萌发后2天的幼苗细胞核中(C),5S rDNA位于前染色中心(箭头)。用DAPI进行反染色(左进[A]和[中]),使用5S rDNA探针进行FISH(中间[A]和[中])以及两者的合并(【B】就在里面[A]和[中])如图所示。棒材=5μm。
在野生型和ddm1型2天龄植株,5S rDNA探针仅与异色前CC杂交(). 环形成信号的缺失表明,在这些细胞核中,5S rDNA的重要部分没有从异染色质分散开来。这一观察结果与以下观点一致:由于尚未形成适当的染色质结构,5S rDNA在2日龄植株中的表达降低。
H3K9乙酰化和H3K4甲基化在2天预培养基中无法检测到
在Lys-9乙酰化的组蛋白H3(H3AcK9)和H3mK4是两种组蛋白修饰,通常与转录活性染色质有关。野生型和非野生型2日龄和3周龄细胞核的免疫标记ddm1型使用特异性识别H3AcK9或H3mK4的抗体的植物在CCs/pre-CCs处没有信号(). 无信号区域的大小与CC和前CC的大小相关。剩余的染色质可能包括3周龄叶细胞核中的5S rDNA环,显示出持续更强的H3AcK9和H3mK4信号。在2天龄野生型和ddm1型尽管异染色质尚未完全发育(如上所示),但标记模式表明,在这两种情况下,与常染色质相比,前CCs在H3K9处乙酰化较少,在H3K处甲基化较少,成熟叶片的较大CCs也是如此。
2日龄和3周龄幼苗细胞核和5S rDNA环的染色质修饰。
(A)组蛋白H3K9乙酰化(绿色)。在3周龄植物的叶细胞核中,野生型(WT)和ddm1型未被H3AcK9抗体标记。
(B)组蛋白H3K4二甲基化(红色)。至于H3AcK9,野生型和2日龄幼苗细胞核的异染色质ddm1型保持未标记状态,而常染色质显示出较强的标记强度。
(C)组蛋白H3K9二甲基化(红色)。在野生型和ddm1型在3周龄细胞核中,H3mK9免疫信号优先定位于异染色质。
在(A)到(C)图中显示了DAPI染色(左)、免疫信号(中)以及两者的合并(右)。箭头表示前色心。棒材=5μm。
(D)5S rDNA环缺乏H3K9二甲基化。3周龄野生型细胞核的H3mK9标记在染色中心显示出强烈的免疫信号。图中显示了H3mK9免疫信号(红色)和5S rDNA FISH信号(绿色)的合并。5S rDNA环的扩大表明,常染色的5S rDNA环与二甲基化的H3K9(小箭头)弱相关或不相关,而与二甲基化合的H3K9(大箭头)相关的异色5S r脱氧核糖核酸呈黄色(由绿色和红色信号叠加而成)。棒材=5μm。
H3mK9存在于2日龄细胞核的前C细胞中,但在3周龄叶核的5S rDNA环中减少
H3K9的强甲基化被发现是野生型异染色质的典型特征(见引言)。在3周大时,用针对H3二甲基化K9的抗体获得的免疫信号聚集在CCs()而信号的面积和强度在ddm1型信用证(Soppe等人,2002年)与野生型相比。5S rDNA环未被标记或用H3mK9标记较少,表明为常染色结构(). 在2天大的时候,野生型和ddm1型前CC的细胞核显示出异色特征,如H3mK9以及H3mK4和H3AcK9的缺失(). 在这个阶段,5S rDNA并没有形成环,并且大部分和异色前CC共定位。这种染色质组织可能是在2日龄植株中观察到的效率较低的5S rRNA转录的基础().
小的2天龄前癌细胞已经DNA甲基化
我们比较了甲基化DNA在2天龄和3周龄野生型和ddm1型使用抗5mC抗体的植物。野生型3周龄细胞核显示出强信号,特别是在CCs,而在ddm1型3周大的细胞核,免疫信号分散,而不是像之前观察到的那样聚集在CC上(Soppe等人,2002年). 在2天龄的野生型和ddm1型植株,免疫信号几乎均匀分布,不限于前CC(). 虽然在萌发后2天出现了DNA甲基化,但前CC还没有完全发育,并且比成年叶片中的前CC小。
2日龄细胞核的DNA甲基化模式。
5-甲基胞嘧啶(5mC;绿色)的免疫信号强烈聚集在野生型(WT)3周龄细胞核(顶部)的色心,而在ddm1型3周龄细胞核,免疫信号分散,不再聚集在色心(未显示;参见Soppe等人,2002年). 在野生型和ddm1型,免疫信号不聚集在前染色中心。显示DAPI染色(左)和免疫信号(右)。箭头表示前色心。棒材=5μm。
转录的5S rDNA位点与H3mK9的相关性较小ddm1型核
5S rDNA的低甲基化ddm1型背景()与小5S rRNA比例增加相关(),指示额外5S rRNA基因的转录。之前显示ddm1型异染色质,DNA甲基化强烈降低,H3mK9被H3mK4取代。在重新激活的基因和转座子中观察到了这种模式(Gendrel等人,2002年;Johnson等人,2002年)以及从CC分散的区域(Soppe等人,2002年). 我们分析了野生型和野生型5S rDNA的组蛋白H3甲基化模式ddm1型ChIP使用针对K9处二甲基化H3和K4处二甲基化H3的抗体培育成熟植物。为了验证免疫沉淀步骤,使用了四种不同的对照:磷酸果糖激酶β亚基基因(At4g04040)、Cinful-like反转录转座子(T5L23.29)、肌动蛋白基因和Ta2转座子。因为我们的ChIP-PCR为所有四个序列生成了前面描述的模式(Gendrel等人,2002年;Johnson等人,2002年),我们将免疫沉淀用于随后的5S rDNA特异性PCR程序。
在野生型植物中,5S rDNA主要与H3mK9相关,而较小部分与H3mK相关(). 在ddm1型与野生型相比,组蛋白甲基化模式发生了改变,与H3mK9的相关性降低,与H3mK4的相关性增加。然后,我们研究组蛋白H3甲基化的变化是否均匀分布在5S rDNA区域,是否有可能在第4染色体和第5染色体的大位点上转录,而不是在第3染色体上转录。为此,对三个独立的ChIP实验的ChIP PCR产物进行测序,并通过转录区下游的T延伸特征将其分配到相应的5S rDNA位点() (Cloix等人,2002年). 该分析显示来自转录位点的5S rRNA基因显著(Z与野生型(89.7%)相比,P=0.05)与H3mK9的相关性更强ddm1型(70.8%). 相反,H3mK4 ChIP PCR结果显示,来自这些基因座的5S rDNA显著(Z试验,P=0.05)与H3mK4ddm1型(82.5%)比野生型(60%)高。这些结果表明ddm1型,更多来自转录位点的5S rRNA基因获得常染色质特征,这与存在更大/更多常染色5S rDNA环相一致ddm1型因此,在ddm1型,通常存在于野生型异染色质中的额外小5S rRNA基因可能整合在常染色5S rDNA环中,为转录提供了一个许可的环境。
5S rRNA基因的ChIP分析。
对野生型(WT)和ddm1型植物分析5S rRNA基因的H3K4或H3K9二甲基化状态(顶部凝胶)。显示了三个独立ChIP实验的代表性图像。在野生型中,5S rDNA与H3mK9的相关性比与H3mK 4的相关性大得多。5S rDNA与H3mK9的结合在ddm1型与野生型相比,与H3mK4的相关性增加。磷酸果糖激酶(PFK)β亚基基因(At4g04040)、Cinful-like反转录转座子(T5L23.29)、肌动蛋白基因和Ta2转座子被用作已知H3mK4和H3mK9模式的对照。在每种情况下,均显示总染色质提取物(输入;IP)和无抗体沉淀提取物(无AB)。
表3。
野生型和野生型5S rDNA位点组蛋白H3二甲基化模式ddm1型背景
| H3米K4
| H3mK9型
|
---|
5S rDNA位点 | 野生型 | ddm1型 | 野生型 | ddm1型 |
---|
染色体3 (未转录) | 40% | 17.5% | 10.3% | 29.2% |
染色体4和5 (转录) | 60% | 82.5% | 89.7% | 70.8% |
总计 | 100% | 100% | 100% | 100% |
已排序的克隆数 | 40 | 57 | 58 | 48 |
通过H3mK9 ChIP,从3号染色体上的单元中恢复了较高比例的5S rDNA序列ddm1型与野生型背景相比。反过来,H3mK4 ChIP在野生型中恢复了来自3号染色体的5S rDNA序列的比例高于ddm1型背景。因为3号染色体上的5S rDNA位点由于存在大量突变而无法在体内转录(Cloix等人,2002年),该位点的ChIP结果与5S rDNA表达无关。
讨论
在本研究中,我们报道了5S rRNA基因在叶片发育过程中染色质组织和转录发生变化。在叶片中,在萌发后的第2天到第4天,色心处异染色质的形成完全建立,伴随着DNA甲基化、染色质组织和5S rDNA转录的变化。在萌发后2天,异染色质部分由较少浓缩的前CC组成,比4天和3周龄叶核中观察到的CC小得多(). 这一结果提供了证据,证明在拟南芥的叶片发育过程中,组成型异染色质的出现是动态的。有趣的是,哺乳动物早期发育过程中,着丝粒周围异染色质的形成与细胞分化之间也存在相关性(Cammas等人,2002年;Rangasamy等人,2003年).
2日龄细胞核(根和子叶)中5S rDNA的染色质组织与3周龄叶片中的不同。与发育后期相比,5S rDNA环不存在,5S r DNA甲基化不足。在2天龄时,位于前CC中的主要和次要5S rRNA基因被转录,但产生的rRNA总量仅为成熟野生型叶片中检测到的总量的30%。从4天开始,大部分主要的5S rRNA从叶细胞核中回收。在成年植物的叶核中,5S rDNA既存在于浓缩的CC中,也存在于从CC向外延伸的环中。与周围常染色质相比,环显示相同的H3mK4和H3AcK9免疫信号,5mC或H3mK9免疫信息没有富集,表明它们代表5S rRNA基因的转录部分。沉默的5S rDNA可能存在于浓缩的CC中。为了支持这一观点,我们之前报道过一小部分5S rDNA单元降低了DNA甲基化水平(Mathieu等人,2002b). 这些低甲基化单位可能对应于位于环中的5S rRNA基因。我们之前也报道过裸体5S rRNA基因的体外转录不受DNA甲基化的影响(Mathieu等人,2002b). 同样,Santoro和Grummt(2001)据报道,DNA甲基化介导的小鼠rDNA转录抑制对染色质有效,但对裸DNA模板无效。这些发现表明,抑制5S rRNA基因子集需要与DNA甲基化相关的特定染色质状态。因此,我们认为,在萌发后2至4天,染色质组织的变化导致主要5S rRNA基因优先并入5S rDNA环并转录,导致次要基因浓缩和抑制。
5-azaC或ddm1型突变丰富了小5S rRNA基因的表达。这个ddm1型已知突变会导致CCs显著去凝聚(Probst等人,2003年). 与通常位于CC内的其他序列一样(Soppe等人,2002年),一部分5S rDNA从CCs中分散,产生比野生型细胞核更大的5S rDNA环。因为小5S rRNA的表达在ddm1型叶片中,较小的5S rRNA基因可能包含在较大的环中。与此观点一致的是,染色体4和5上转录的5S rDNA片段的ChIP数据显示,与H3mK4的相关性增加,与H3mK9的相关性减少ddm1型与野生型相比。3号染色体上非转录5S rDNA单元的ChIP结果呈现相反的模式。对这种模式的一个可能解释是,非转录位点上的组蛋白甲基化标记在ddm1型但ChIP恢复的这些基因座的相对比例因4号和5号染色体基因座恢复的变化而改变。以下数据支持此视图Johnson等人(2002)他发现,在各种DNA甲基化突变体中,非转录序列保留了H3K9甲基化。
5S rDNA转录揭示了器官和发育阶段之间的数量和质量差异。少量5S rRNA的比例与DNA甲基化呈负相关,但与整体5S rRNA转录水平无关(,). 相反,5S rRNA转录物的总体水平与在TFIIIA金额。由于无法使用在TFIIIA特异性抗体,我们监测在通过半定量RT-PCR发现TFIIIA mRNA积累与在TFIIIA mRNA和5S rRNA数量。虽然是低甲基化的ddm1型和5-氮杂碳处理的成年植物转录额外的小5S rRNA基因,它们包含的5S rRNA总量与未处理的野生型植物相同。这一发现支持了以下观点:在TFIIIA是5S rDNA转录的限制因子。
总之,我们已经表明,在拟南芥异染色质形成过程中,DNA甲基化和组蛋白修饰水平的表观遗传标记的变化伴随着5S rDNA染色质组织,导致次要5S rRNA基因的转录抑制。在ddm1型异染色质没有完全发育,产生较小的成熟CCs,导致小5S rRNA基因转录的去抑制。
方法
植物材料
拟南芥野生型和ddm1型这些植物来自哥伦比亚生态型。野生型种子(Col-4)从ABRC获得(库存号CS933;俄亥俄州立大学,哥伦布),Eric J.Richards(华盛顿大学,圣路易斯,密苏里州)为ddm1型突变体。种子在萌发培养基(MS Salt[Sigma],添加3%蔗糖和0.8%细菌琼脂)上生长3周,在生长室中使用16h-光(120μmol·m−2·秒−1)/23°C下的8-h暗区。如前所述进行5-氮胞苷(5-azaC)治疗(Mathieu等人,2002b). 为了获得发芽后的植株,种子在生长室中的水中发芽(光照16小时/暗照8小时),发芽后2天直接收集,或转移到发芽培养基上,发芽后4天收集。从4天龄的植株上去除根。
核酸的分离和凝胶电泳分析
使用DNeasy试剂盒(加利福尼亚州巴伦西亚市齐根)从2日龄和4日龄植株的不同组织中分离出总基因组DNA。在推荐的缓冲液(马萨诸塞州贝弗利新英格兰生物实验室)中用20单位限制性内切酶消化基因组DNA(500 ng)。消化后的DNA在0.8%琼脂糖凝胶上电泳过夜,在0.25 N HCl中脱尿,并在Hybond-N上进行毛细管印迹+膜(Amersham)。
总RNA提取根据Logemann等人(1987)稍作修改(Mathieu等人,2002b). 对于种子,根据Vicient和Delseny(1999)为了进行RNA凝胶印迹分析,在1%琼脂糖/1.9%甲醛凝胶上分馏每道500 ng总RNA,并将毛细管印迹在Hybond-N膜上(Amersham)。
DNA探针标记有α-32使用随机六聚体启动法的P-dCTP(Megaprime DNA标记系统;Amersham)。为了量化0.5-kb波段强度,将0.5-kb波段放射性(对应于5S rDNA的单体单位)与全线放射性标准化(). 用于计算中所示的相对5S rDNA甲基化,将在3周龄野生型叶片(用作参考)中获得的比率除以每个测试样本获得的比率,并以百分比表示。在荧光成像仪(分子成像仪FX;Bio-Rad)上进行定量。
逆转录PCR和测序
如上所述分离总RNA,并通过DNase I处理(法国梅兰罗氏)去除污染基因组DNA,然后进行苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)提取。在20μL中使用1μL Expand Reverse transcriptase(Roche)和2μL己二核苷酸混合物(用于5S rRNA逆转录;Roche在TFIIIA-专用底漆在根据制造商的说明,TFIIIA2(5′-CTAGCAAGTTTCGTGTTCTTCTG-3′)加上25至50 pmol的apt2引物(5′-CCTTTCCCTTAAGCTCTG-3’)(罗氏)。通过验证使用位于5S rRNA基因(5Suniv1,5′-CTTTCGGGCNTTTTNGTG-3′;5Suniv2,5′-CGAAAAGGTCACATGCC-3′)非转录间隔区的引物的PCR步骤(40个周期)未产生扩增,控制了反向转录样品中5S基因组rDNA的完全去除。
使用引物RTPCR5S1(5′-GGATGCGATACCAG-3′)和RTPCR552(5′-GAGGGATGCAMCACSAG-3′)对50 ng cDNA样品进行5S cDNA扩增,扩增5S rRNA基因的整个转录区。对于在TFIIIA cDNA扩增,用引物对350 ng cDNA样品进行PCR在TFIIIA4(5′-CTTACACATAAAGGGAGCTC-3′)和在TFIIIA5(5′-CCGTAGATGTCTTGATG-3′)跨越第三内含子。作为内部对照,编码腺嘌呤磷酸核糖基转移酶的APT1 cDNA(Moffatt等人,1994年)用引物apt1(5′-TCCAGAAATCGCTAAGATTGC-3′)和横跨第四内含子的apt2从150 ng cDNA样品中扩增。PCR条件如下:在94°C、20(APT1)或30下4分钟(在TFIIIA)在94°C下45 s的循环,在54°C下1 min(在TFIIIA)或52°C(APT1),在72°C下90秒,在72℃下10分钟。5S cDNA的PCR条件为94℃下4 min,94℃下35个周期45 s,50℃下45 s,72℃下45s,72°C下5 min。
统计
较小的5S rRNA频率与Fisher精确检验的2×2列联表进行了比较(范·塔塞尔,1981). 概率是通过单尾检验计算出来的。使用非参数Mann-Whitney对5S rDNA甲基化和5S rRNA数量进行统计分析U型用平均值比较进行测试。
细胞遗传学
使用5S rDNA和45S rDNA探针进行异染色质定量和荧光原位杂交(FISH),使用乙醇:乙酸(3:1)固定。为了对修饰组蛋白进行免疫检测(结合5S rDNA FISH),将组织固定在Tris缓冲液(10 mM Tris,10 mM Na)中4%的多聚甲醛中2EDTA和100 mM Triton X-100,pH 7.5)。按照说明生产核悬浮液(Jasencakova等人,2000年,2001). 细胞核用4′,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色。
鱼
使用了以下探针:拟南芥BAC T15P10(AF167571)含有45S rDNA重复序列,使用缺口翻译试剂盒(Roche)标记生物素16-dUTP,以及使用基因特异性引物通过PCR标记地高辛11-dUTP的5S rDNA。FISH实验根据舒伯特等人(2001)当单独使用地高辛标记的5S rDNA探针时,先使用小鼠抗地高辛(1:250;Roche),然后使用与生物素结合的山羊抗鼠抗体(1:500;宾夕法尼亚州西格罗夫的Jackson ImmunoResearch)和与德克萨斯红结合的亲和素(1:1000;加利福尼亚州伯灵盖姆的Vector Laboratories)进行检测。当地高辛标记的5S rDNA和生物标记的45S rDNA一起使用时,使用与德克萨斯红(1:1000;Vector Laboratories)结合的亲和素,然后使用与生物素结合的山羊抗亲和素(1:200;Vectors Laboratory)和亲和素-德克萨斯红(1-1000)检测生物素标记探针,用羊抗地高辛荧光素异硫氰酸盐(FITC)(1:20;Roche)和兔抗羊FITC(1:100;Jackson ImmunoResearch)检测地高辛标记探针。
组蛋白和5-甲基胞嘧啶免疫检测
使用以下初级抗体:抗乙酰组蛋白H3(Lys-9)、抗二甲基组蛋白H3(Lys-4)和抗二甲基组蛋白H3(Lys-9)(1:100;均来自纽约州普莱西德湖Upstate Biotechnology)。组蛋白的免疫标记程序如下所述(Jasencakova等人,2000年,2001). 在4%多聚甲醛/PBS中固定后,在PBS中洗涤,并在37°C下封闭后,将载玻片在4°C下暴露于初级抗血清过夜。在PBS中洗涤后,在37°C下与二级抗体抗兔FITC(1:80;Sigma)或抗兔罗丹明(1:100;Jackson ImmunoResearch)孵育。
对于H3-二甲基K9和5S rDNA的联合检测,首先进行组蛋白免疫检测。在评估和图像捕获后,如前所述,对幻灯片进行后续FISH处理(Jasencakova等人,2000年,2001). 使用抗5-甲基胞苷(1:100;Eurogentec,Seraing,Belgium)的单克隆抗体在100 mM Tris-HCl、pH 7.5、150 mM NaCl和0.5%封闭试剂(Roche)中检测5-甲基胞嘧啶,然后是兔抗鼠FITC(1:1000;Sigma)和羊抗兔Alexa-488(1:200;分子探针,Eugene,OR)。用DAPI(Vectashield;Vector Laboratories中2μg/mL)对细胞核进行复染。
显微镜和图像处理
为了进行微观分析,使用了配备冷却电荷耦合器件相机(Photometrics,亚利桑那州图森)的蔡司Axiophot 2荧光显微镜(德国耶拿)。通过适当的激发滤波器分别采集每个荧光色素的荧光图像。使用Adobe Photoshop(Adobe Systems,Mountain View,CA)对图像进行假彩色、合并和处理。
显色分数的测量
使用免费软件NIH Image 1.62分析灰度数字图像。编写了特殊的宏指令来测量细胞核和色心的大小和平均染色强度。色心值除以全核值,得出色心分数。
染色质免疫沉淀分析
两周龄的植物(野生型和ddm1型)收集并在1%甲醛中真空浸泡15分钟。按所述进行染色质免疫沉淀(ChIP(Gendrel等人,2002年;Johnson等人,2002年)使用抗二甲基istone H3(Lys-4)或抗二甲基stone H3(Lys-9)抗体(分别为07-030或07-212;Upstate Biotechnology)。每个免疫沉淀都进行了三次独立的试验。
对于ChIP-PCR,使用的引物对如下:对于5S rDNA,RTPCR5S1(5′-GGATGCGATACCAG-3′)和5Suniv2;磷酸果糖激酶β亚基基因(At4g04040)、T24H24.15F(5′-GCCACAGAAACCACAGAC-3′)和T24H2415R(5′-CCGGAATTCGATCACT-3′);对于Cinful-like反转录转座子(T5L23.29)、T5L23.39F(5′-CTCGATGCGTATTCGCTTGA-3′)和T5L23.2 9R(5′-GCAACTAACGTCGT-3′);对于肌动蛋白基因,Actin2/7-F(5′-CGTTTTC-GCTTTCCTAGTGTAGCT-3′)和Actin2/7-2R(5′-AGCGAACGGATCTAGACTCACCTTG-3′);对于Ta2转座子,Ta2-F(5′-AAAACGATGTGGGATGTC-3′)和Ta2-R(5′-ATACTCCACTTTCGTTTTTTTA-3′)。对5μL 1:10稀释的ChIP样品(At4g04040,T5L23.29,肌动蛋白和Ta2)或2μL 1:100稀释液(5S rDNA),最终体积为25μL。PCR条件如下:在95°C下5分钟、25次(5SrDNA)或30次循环(At4g04040、T5L23.29、,肌动蛋白,和Ta2)在94°C下45 s,在54°C(5S rDNA)或60°C(At4g04040,T5L23.29,肌动蛋白,和Ta2),30秒(5S rDNA)或1分钟(At4g04040,T5L23.29,肌动蛋白,和Ta2),72°C下5分钟。
根据要求,本出版物中的研究结果所包含的材料将以类似的条款及时提供给所有研究人员,用于非商业研究目的。要获取材料,请联系Sylvette Tourmente,rf.tnomrelcpb-vinu@etnemruot.ettevlys(电子邮箱).
致谢
我们感谢Achim Bruder、Martina Kühne、Nathalie Maroncel和Claudine Cuvillier的帮助,感谢Armin Meister和Isabelle Jouan在统计和流式细胞术方面的帮助,以及Judith Bender和Charles White对手稿的批判性阅读。这项工作得到了国家Recherche科学中心(CNRS)、表观遗传群和布莱斯·帕斯卡大学的支持。V.C.得到了Genopole和CNRS的专项资金支持。Z.J.和I.S.得到了Land Sachsen-Anhalt(3233A/0020T)的拨款支持。O.M.、I.V.和A.-V.G.得到了教育部主管和教育部的奖学金支持。
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