巨噬细胞中HIF-α亚型的差异激活和拮抗功能对NO稳态至关重要

Th1和Th2细胞因子对HIF-1α和HIF-2αmRNA表达的调节不同

为了分析HIF亚型在极化中的功能，我们询问HIF-αmRNA对不同的细胞因子，尤其是Th1和Th2细胞因子的反应是否不同。在这些实验中，我们使用BMDM作为预激活状态的代表。如图所示图1B与对照组相比，IFNγ和LPS在12 h内增加BMDM中HIF-1αmRNA的表达，但显著抑制HIF-2αmRNA表达。然而，Th2细胞因子IL-4的作用方式几乎相反；它对HIF-1αmRNA的表达无影响，但可增加HIF-2αmRNA表达。其他Th2细胞因子，如IL-13，也增加了HIF-2αmRNA的丰度（数据未显示），表明Th2细胞素导致HIF-2βmRNA的逐渐增加，而Th1细胞因子抑制HIF-2γmRNA的表达。有趣的是，Th2细胞因子诱导HIF-2αmRNA表达的动力学与LPS或IFNγ诱导HIF-1αmRNA的动力学不同，IL-4诱导的HIF-2βmRNA对HIF-2γ表达的影响延长。

Th1和Th2细胞因子对HIF-α的转录调控

为了确定细胞因子如何调节HIF-αmRNA行为，我们首先定义了BMDM中mRNA的稳定性；这是通过测量放线菌素D治疗后一段时间内信使核糖核酸的水平来完成的(图1C). 这些数据表明，HIF-1αmRNA非常不稳定，在12小时内丰度下降约4-5个数量级，半衰期为～200分钟。另一方面，HIF-2αmRNA很稳定，我们无法在本试验中确定其确切的半衰期；HIF-2α半衰期仅受LPS治疗的影响。相对于HIF-2αmRNA，LPS对mRNA稳定性的影响在破坏HIF-1αmRNA的稳定性方面也显著更大。

接下来，我们通过定量PCR，使用在HIF-1α的第12外显子和第13内含子以及HIF-2α的第11和第12内含子结合的引物来测量前体mRNA。从这些位点扩增纯化的核RNA可以通过检测预处理的RNA来确定HIF-αmRNA的合成速率。LPS和IFNγ在6-12 h促进HIF-1αmRNA合成，而它们强烈降低HIF-2αmRNA生成(图1D).

然而，IL-4显著诱导了HIF-2αmRNA的合成，尽管与Th1细胞因子刺激的HIF-1αmRNA转录作用相比，时间进程再次延迟。总之，这些结果表明HIF-1αmRNA具有较高的转换率，并且主要通过调节其转录来控制。相反，HIF-2αmRNA是稳定的，周转率较低，其在细胞中的累积存在受其稳定性和转录率的影响。

HIF-1α和HIF-2α蛋白水平受Th1和Th2细胞因子的差异调节

炎症在HIF-1α诱导中的作用非常复杂，有证据表明其具有转录、翻译和翻译后作用(Sandau等人，2001年;Zhou等人，2003年;Frede等人，2007年;Rius等人，2008年). 为了确定Th1和Th2细胞因子如何最终影响HIF-α蛋白水平，我们首先检测了缺氧期间HIF-1α和HIF-2α蛋白的丰度。我们用细胞因子处理原代巨噬细胞48小时，然后使其缺氧4小时。单独缺氧在BMDMs中诱导少量HIF-1α蛋白；然而，IL-4显著增加了HIF-2α的丰度(图2A).

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图2。

HIF-1α和HIF-2α蛋白合成与LPS/Th1和Th2细胞因子呈负相关。(A类)LPS或IFNγ增加了BMDM患者在常氧和缺氧条件下HIF-1α蛋白的表达。除IL-4存在外，HIF-2α蛋白的表达水平较低。(B类)TEPM具有高HIF-2α蛋白表达。LPS和IFNγ降低HIF-2α蛋白丰度。(C类)收集野生型小鼠的TEPM，用双吡啶处理2 h，诱导HIF-1α和HIF-2α蛋白表达。细胞与环己酰亚胺（100μM）、LPS（1μg/mL）、IFNγ（20 ng/mL）或IL-4（20 ng/mL）一起培养，并收集用于Western blotting。LPS或IFNγ和IL-4不影响HIF-1α或HIF-2α蛋白的稳定性。n个= 3. (*)P（P）与对照组相比<0.05。

部分M2极化的TEPM与BMDM相比HIF-2α表达更高(图2A、B); 这与HIF-2αmRNA水平一致(图1B). 即使在常氧条件下，也可以检测到TEPM中HIF-2α蛋白的表达。LPS和Th1细胞因子IFNγ诱导BMDM和TEPM中HIF-1α蛋白表达，但显著降低HIF-2α蛋白表达。这些蛋白水平也与HIF-1α或HIF-2αmRNA对LPS或IFNγ的反应一致(图1B).

然后我们试图确定LPS、IFNγ或IL-4是否影响HIF-α蛋白的稳定性(图2C). 我们用脯氨酸羟化酶活性抑制剂双吡啶处理TEPMs 2 h以诱导HIF-1α和HIF-2α蛋白表达，然后给药环己酰亚胺以抑制翻译。HIF-1α和HIF-2α蛋白半衰期分别为41.5分钟和27.3分钟(图2C). 在存在LPS、IFNγ或IL-4的情况下，HIF-1α和HIF-2α蛋白降解率几乎与非细胞因子治疗的对照组相同，表明LPS、干扰素γ和IL-4均不影响HIF-α蛋白的稳定性(图2C).

巨噬细胞中HIF-1α和HIF-2α表达的计算模拟

基于上述参数，构建了M1或M2极化刺激下HIF-1α和HIF-2αmRNA动力学的数学模型(图3A). 然后利用该模型计算和预测细胞因子对HIF-1α或HIF-2α蛋白总水平的净影响(图3B).

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图3。

HIF-1α和HIF-2α表达的计算模拟表明，HIF-α蛋白丰度受其mRNA水平变化的影响。(A类)LPS、IFNγ或IL-4调节HIF-1α和HIF-2α的网络图，用于构建数学模型。(B类)Th1或Th2细胞因子对HIF-1α和HIF-2αmRNA水平起反作用的计算模拟，这些mRNA水平不受缺氧影响。转录率改变到实验测量的Th1和Th2细胞因子反应程度，并计算得到的mRNA和蛋白质水平。模拟结果表明，即使在正常氧条件下，HIF-1α和HIF-2α蛋白水平也受到细胞因子介导的mRNA合成和稳定性控制的调节；这种调节作用在缺氧条件下增强。(C类)TEPM来自甚高频^{flox/flox公司}/LysM公司cre公司^+/−小鼠在常压下表达HIF-1α和HIF-2α蛋白。LPS和IFNγ增加HIF-1α，但降低HIF-2α蛋白。IL-4增加了VHL缺陷巨噬细胞中的HIF-2α蛋白。

硅内模型预测，Th1或Th2细胞因子诱导的HIF-1α和HIF-2αmRNA合成和降解的动态变化将强烈影响HI-α蛋白的丰度。为了对其进行实验建模，我们分析了von Hippel-Lindau（VHL）-零TEPM；这些细胞缺乏HIF-α蛋白翻译后降解所需的基本蛋白质。

VHL缺乏的巨噬细胞常氧状态下存在HIF-1α和HIF-2α蛋白(图3C). 然而，与转录控制对HIF-α水平影响的计算模型一致，LPS和IFNγ增加HIF-1α，但几乎完全抑制HIF-2α蛋白的积累。另一方面，IL-4增加HIF-2α水平。这些结果表明，极化细胞因子影响HIF-1α或HIF-2α蛋白丰度不是通过调节降解，而是通过诱导mRNA合成。

iNOS表达受HIF-1α控制；相反，精氨酸酶1的表达主要由HIF-2α调节

上述数据表明HIF-2α仅由Th2细胞因子诱导。为了进一步研究这一令人惊讶的发现，我们收集了来自HIF-2α^{flox/flox公司};Tie2核心^+/−小鼠（HIF-2αKO），并使用cre重组酶阴性的同窝小鼠分离对照TEPM。初步分析表明，HIF-2α的缺失不会影响许多M2基因，包括菲兹1和Ym-1型（补充图1）。我们还发现HIF-2α的缺失并不影响这些细胞中经典HIF-1α靶基因的低氧诱导，包括葡萄糖转运蛋白1(葡萄糖转运蛋白1)和乳酸脱氢酶-A(乳酸脱氢酶-A)（补充图2）。然而，在HIF-2αKO巨噬细胞中，精氨酸酶1的mRNA和蛋白水平均显著降低(图4A). HIF-2α-KO巨噬细胞中基础精氨酸酶1的表达和低氧诱导减弱，表明即使在常氧条件下，HIF-2β也是精氨酸蛋白酶1诱导的必要成分。iNOS和精氨酸酶1都是调节总NO水平的伙伴；已知两者都是由缺氧诱导的，因此我们假设这两种HIF-α亚型可能会在巨噬细胞中不同地诱导这些基因。为此，我们生成了HIF-1α^{flox/flox公司};Tie2核心^+/−小鼠（HIF-1αKO）和HIF-1α^{flox/flox公司} HIF-2α^{flox/flox公司};Tie2核心^+/−双基因敲除小鼠（HIF-1/2αDKO）和HIF-2αKO，然后收集原代巨噬细胞（TEPMs），比较缺氧iNOS和精氨酸酶1的诱导。在HIF-1αKO巨噬细胞中iNOS基因诱导显著减少，但在HIF-2αKO巨噬细胞中没有，这表明缺氧iNOS基因诱导主要依赖于HIF-1α(图4B). 相反，HIF-1αKO和HIF-2αKO巨噬细胞的低氧精氨酸酶1诱导在一定程度上降低，HIF-1/2αDKO完全消除(图4B). 这些结果表明iNOS和精氨酸酶1基因受到两种HIF-α亚型的不同调节。这一概念促使我们对比缺氧条件下IFNγ刺激与HIF-α亚型、iNOS或精氨酸酶1 mRNA表达的剂量反应曲线。iNOS mRNA表达的诱导增加直接反映了IFNγ剂量的增加；然而，精氨酸酶1基因表达受到抑制(图4C). 有趣的是，HIF-1αmRNA的表达随着IFNγ的增加而增加，而HIF-2αmRNA的表达降低；这种对IFNγ的剂量依赖性反应直接反映了iNOS和精氨酸酶1各自的变化(图4D).

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图4。

iNOS表达受HIF-1α控制；相反，精氨酸酶1的表达主要由HIF-2α调节。TEPM收集自HIF-1α^{flox/flox公司};Tie2核心^+/-（HIF-1αKO），HIF-2α^{flox/flox公司};Tie2核心^+/-（HIF-2αKO），或HIF-1α^{flox/flox公司} HIF-2α^{flox/flox公司};Tie2核心^+/-（HIF-1/2αDKO）小鼠或野生型小鼠作为对照。(A类)用IL-4（20 ng/mL）或缺氧（1%）（H）处理野生型（Wt）和HIF-2KO（KO）TEPM 14 H。IL-4正常诱导HIF-2αKO TEPM中精氨酸酶1表达。然而，缺氧诱导的精氨酸酶1 mRNA和蛋白在HIF-2αKO TEPM中显著降低。(B类)将TEPM暴露于低氧（1%）（H）中14 H，并收集其进行基因表达分析。缺氧诱导iNOS在HIF-1αKO中被废除，但在HIF-2αKO TEPM中没有。缺氧诱导精氨酸酶1在HIF-1αKO TEPMs中受到抑制，但在HIF-2αKO TEMs中受到更强烈的抑制。缺氧诱导的iNOS和精氨酸酶1在HIF-1/2αDKO TEPMs中均被完全抑制(n个= 4). (*)P（P）< 0.05; (**)P（P）与野生型相比，<0.01。(C类)用不同剂量的IFNγ（0.02–20 ng/mL）处理野生型TEPMs 12 h，然后在低氧（1%）中孵育16 h。iNOS表达增加，而精氨酸酶1表达随着IFNγ剂量的增加而降低。(D类)HIF-1α的表达也被诱导，而HIF-2α在增加IFNγ剂量后减少。HIF-2αKO巨噬细胞中精氨酸酶1的表达受到影响，但iNOS的表达没有受到影响。HIF-2αKO TEPM中精氨酸酶1表达的减少被消除。

收获BMDM和TEPM

为了分离BMDM，采集野生型小鼠的股骨和胫骨骨髓。将细胞置于补充有10%热灭活FBS和30%条件培养基（表达L-929细胞的M-CSF的7-d上清液）的DMEM中。通过混合液A（10 mM EDTA在PBS和含有20%FBS的RPMI 1640培养基中的1:1混合液）培养15分钟并在培养7天后轻轻刮取成熟贴壁BM细胞。注射巯基乙酸4天后，从腹腔分离出TEPM。从Sigma中获得LPS（L3012）、放线菌素D和环己酰亚胺。IFNγ和IL-4来自eBioscience。

逆转录和实时定量PCR RNA分析

如前所述，使用RNeasy方法（Qiagen，Inc.）从培养细胞中分离出总RNA(武田等人，2007年). 根据制造商的协议，由SuperScript系统（Invitrogen）使用0.5或1μg总RNA进行第一链合成。在实时PCR分析中，使用ABI Prism 7700序列检测系统（Applied Biosystems）在SYBR Green或TaqMan Universal Master Mix（应用生物系统）中扩增cDNA。使用ΔCt方法，表达水平与18秒相关。引物序列见补充材料。

蛋白质印迹分析

将细胞收集在缓冲液A（pH 7.9下的10 mM HEPES、10 mM KCl、0.1 mM EGTA、0.1 mM-EDTA、1 mM DTT、1 mM-PMSF，所有来自Sigma的化学物质）和完整的PI片（罗氏）中，并在冰上孵育10分钟。在与0.6%NP-40孵育30秒并涡旋30秒后，裂解产物在12000下旋转克30秒后，收集上清液作为细胞质组分。将颗粒重新悬浮在缓冲液C中（20 mM HEPES，pH 7.9，420 mM NaCl，1.5 mL MgCl₂、0.2 mM EDTA、25%甘油、1 mM DTT、1 mM PMSF、完整PI），并在冰上培养30分钟。14000离心后克收集上清液15min作为核提取物。将10微克核蛋白用4%–8%的三醋酸三钠凝胶（Invitrogen）分离，然后进行免疫印迹。用来自Amersham的二级抗体探测HIF-1α（B1049-49，Novus Biologicals）、HIF-2α（AF2997，R&D）和β-肌动蛋白（AC-15，Sigma）的一级抗体。使用ECL Plus（GE Healthcare）可视化化学发光。

格里斯分析

使用Griess试剂系统（Promega）测量培养巨噬细胞上清液中的NO，并根据制造商的方案进行。在实验之前，将细胞以2×10的电镀密度镀在96块板上⁵每口井。为了测量血浆NO水平，我们在与Griess试剂反应之前通过硝酸还原酶将硝酸盐转化为亚硝酸盐，因为亚硝酸盐会被氧合血红蛋白快速氧化为硝酸盐。还原后，使用10kDa截止过滤器（Millipore）对样品进行脱蛋白。使用NO比色分析试剂盒（BioVision）测量硝酸盐+亚硝酸盐。

计算模拟

基于本研究和先前研究中的测量结果，构建了基于质量作用的ODE模型(表1;Hoffmann等人，2002年;Bansal和Ochoa 2003;Werner等人，2005年). 在Matlab 2008b版（Mathworks）中使用内置的代码15默认设置为银色。基于LPS和细胞因子对HIF-1α和HIF-2αmRNA水平的影响的测量实验结果，进行了涉及细胞因子或LPS诱导的HIF-1α和HIF-2α转录率变化的模拟。

我们感谢托尔斯滕·克莱默（Thorsten Cramer）、卡罗尔·佩森诺克斯（Carole Peyssonnaux）、阿南达·戈德拉斯（Ananda Goldrath）、维克多·尼泽特（Victor Nizet）和迈克尔·卡琳（Michael Karin）的有益讨论。N.T.进行了实验工作，A.D.发起了组织特异性缺失的设计和分析，E.L.O.和A.H.进行了建模研究，M.C.S.提供了HIF-2α条件敲除小鼠，所有合著者都参与了数据分析和手稿撰写。我们感谢日本科学促进会对N.T.和M.A.的支持；这项工作得到了NIH拨款CA082515和CA118165以及科门拨款KG081021的支持。