鲜血。2010年2月11日；115(6): 1254–1263.
血小板与造血
血小板生成素受体c-Mpl的泛素化和降解
,1 ,1 ,1 ,1和
1 Veena Sangkhae公司
1加州大学圣地亚哥分校医学系
肯尼思·考桑斯基
1加州大学圣地亚哥分校医学系，拉霍亚
1加州大学圣地亚哥分校医学系
通讯作者。 收到日期：2009年6月10日；2009年10月6日接受。
摘要
生长因子和细胞因子信号的调节对于维持循环造血细胞的生理数量至关重要。血小板生成素（Tpo）通过其受体c-Mpl发挥作用，是造血干细胞维持和巨核细胞生成所必需的。因此，Tpo信号的负调控在造血的许多方面都至关重要。在本研究中，我们确定了c-Mpl降解在Tpo信号负调控中的机制。我们发现，在Tpo刺激后，c-Mpl被溶酶体和蛋白酶体途径降解，并且c-Mpl迅速泛素化。通过定点突变，我们能够确定c-Mpl在其细胞内赖氨酸（K）残基（K）上泛素化553和K573). 通过将这些残基突变为精氨酸，泛素化和降解显著降低，并导致表达这些突变受体的细胞株过度增殖。使用短干扰RNA和显性负性过表达，我们还发现，被Tpo激活的c-Cbl在c-Mpl的泛素化中充当E3泛素连接酶。我们的发现确定了一种先前未知的Tpo信号负调控途径，这可能会显著影响我们对影响造血干细胞和巨核细胞生长和分化机制的理解。
介绍
造血受到多种细胞因子和生长因子的严格调节，以确保正常情况下循环血细胞的数量保持不变。在许多血液病中，细胞因子和生长因子信号传导功能失调，导致一个或多个血细胞系的过度生产或生产不足。血小板生成素（Tpo）是一种造血细胞因子，通过其受体c-Mpl支持造血干细胞的维持和增殖，是巨核细胞生成的主要调节因子。1,2缺乏Tpo信号导致血小板减少，可移植干细胞数量减少，最终导致人类再生障碍性贫血。三–5相反，过度的Tpo信号转导，通常是由于c-Mpl或其次级信号蛋白的突变，导致许多细胞系的过度增殖，导致骨髓增生综合征。6–8因此，控制Tpo介导的信号对维持循环血细胞的生理数量至关重要。
蛋白磷酸酶、细胞因子信号转导（SOCS）蛋白抑制剂和抑制性细胞内介质都是细胞因子信号负调控的机制。9–12然而，受体内化和降解过程是对活化受体进行负调控的最快和最有效的方式之一。最近，我们通过衔接蛋白2与位于Y的YRRL基序的相互作用，证明了Tpo刺激c-Mpl内化的机制521和Y591c-Mpl胞内结构域；这些位点的消除显著降低了受体的降解。13
泛素化是一种翻译后修饰，涉及小（～8kDa）蛋白泛素与目标蛋白的赖氨酸残基的共价连接。泛素依赖于3组酶的活性；泛素激活酶（E1）、泛素载体蛋白（E2）和泛素蛋白连接酶（E3）。14单一泛素分子与靶蛋白的结合（单泛素化）先前已被证明可介导蛋白质运输和细胞内信号传导。15然而，活化的泛素也能够通过7个赖氨酸残基中的1个（通常是赖氨酸48）与其他泛素分子形成直接相互作用。一旦4个或更多的泛素结合在多泛素链中，蛋白质就被靶向蛋白酶体并降解。跨膜生长因子受体的泛素化和蛋白酶体降解过程是一种常见的调节机制，已在几个不同的系统中得到鉴定（在Marmor和Yarden中进行了综述16). 对表皮生长因子受体和血小板衍生生长因子受体、集落刺激因子-1、ErbB-2和Met的泛素化和降解的研究已确定c-Cbl是负责受体泛素化反应生长因子刺激的E3连接酶之一。17–21在这些示例中，刺激受体导致Cbl的招募，要么直接通过受体中的磷酸化酪氨酸残基，要么间接通过衔接蛋白。22,23然后，Cbl被磷酸化，刺激其E3连接酶活性。
在当前的研究中，我们进一步探索了c-Mpl降解的分子机制，特别是在c-Mpl表达细胞系、小鼠巨核细胞和人类血小板中测试泛素化作为Tpo信号负调控因子的作用。然后，我们确定了c-Mpl细胞内域中的哪些赖氨酸是泛素化的，并确定了它们对c-Mpl降解、依赖Tpo的细胞生长以及对Tpo反应的受体磷酸化水平的影响。最后，使用短干扰RNA（siRNA）和显性负向过度表达，我们确定c-Cbl通过其E3泛素连接酶活性显著促进c-Mpl泛素化和降解。我们的发现确定了一种以前未知的Tpo信号负调控机制，该机制可能会显著影响我们对影响造血干细胞和巨核细胞生长和分化机制的理解。
方法
化学品和试剂
蛋白酶体抑制剂MG-132和Janus激酶2（JAK2）-特异性抑制剂JAKI购自Calbiochem。溶酶体抑制剂NH4Cl、环己酰亚胺和小鼠单克隆抗Na+/K（K）+-ATP酶α1抗体购自Sigma-Aldrich。N末端特异性兔抗人c-Mpl多克隆抗体由Amgen Pharmaceuticals提供，c末端特异性多克隆兔抗人c-Mpl抗体由Millipore购买。小鼠单克隆抗泛素抗体购自Biomol。兔抗c-Cbl、兔抗磷酸信号转导子和转录激活物5（STAT5）和兔抗STAT5购自Cell Signaling Technologies。单克隆小鼠抗凝集素购自Sigma-Aldrich。二级抗体、羊抗兔辣根过氧化物酶和兔抗鼠辣根过氧化物激素购自圣克鲁斯生物技术公司，荧光标记羊抗兔488购自Invitrogen公司。膜-不透硫-N个-羟基琥珀酰亚胺-生物素和中性白介素偶联琼脂糖珠购自Pierce。重组人（rh）Tpo是Don Foster（西雅图，西雅图）赠送的礼物。
细胞系、细胞培养和血小板分离
表达人c-Mpl（BaF-Mpl）的白细胞介素-3（IL-3）依赖性前淋巴细胞系BaF3被保存在含有10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养基（Invitrogen）中，并补充IL-3（来自产生IL-3的幼仓鼠肾细胞的2μL/mL条件培养基）。逆转录病毒包装细胞系铂-E保存在补充有10%FBS的Dulbecco改良Eagle培养基中。为了生成BaF-Mpl克隆，在收集病毒上清液之前，使用Lipofectamine 2000转染试剂（Invitrogen）用pMX-puro-c-Mpl构建物转染亚流铂-E细胞48小时。然后将BaF3细胞系在补充有IL-3的病毒上清液中培养48小时，然后用嘌呤霉素（2μg/mL；Invitrogen）进行选择。克隆种群是通过限制稀释产生的。如前所述，通过Western blot测定总c-Mpl蛋白表达，并通过流式细胞术确认膜定位c-Mpl的细胞表面表达。13采集健康志愿者的静脉血后分离血小板，并将其重新悬浮在Walsh缓冲液中（137mM NaCl，20mMN个-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸、5.6mM葡萄糖、1mg/mL牛血清白蛋白、1mM氯化镁2，2.7 mM KCl，3.3 mM NaH2人事军官4pH 7.4）。
受体结构
野生型人类c-Mpl公司将（NM_005373.1）克隆到逆转录病毒表达载体中pMX-欧元使用生态RI和Xho公司我克隆网站。这个c-Mpl公司细胞内结构域点突变（c-Mpl K553R、 c-Mpl K公司573R、 和c-Mpl K553 + 573R） 使用QuikChange突变试剂盒（Stratagene）引入了以下寡核苷酸：K553R正向引物：5′-CCTGAGCGCCCAGGCCACAGTC-3′，K553R反向引物：5'-GACTGTGGGCCGCGCTGCTCAGG-3′，K 573R正向引物：5'-CTTGAAAATCCCAGGTCCAGAGGATCC-3′；K573R反向引物：5′-GGAGTCCTCTCTCGAGGACCTGGGGATTCAAG-3′。通过对从单个克隆中分离的基因组DNA进行测序，确认了突变。从BaF3-Mpl的cDNA中扩增野生型小鼠c-Cbl（NM_007619.2）cDNA，并使用不是我和Xho公司我克隆网站。这个c-Cbl公司RING-finger域中的点突变(c-Cbl公司C类379A） 使用QuikChange突变试剂盒（Stratagene）引入以下寡核苷酸：C379正向引物：5′-GCTATACAAGAGGGAGGTGCACTCTGGCTAACCCTGGGCC-3′，C379反向引物：5′-GGCCAGCGGTTAGCAGTGGCACCTCCGTTGATAGC-3′。
免疫印迹和免疫沉淀
在化学处理或Tpo刺激后，BaF-Mpl细胞系在Nonide P40（NP-40）裂解缓冲液（50mM三（羟甲基）氨基甲烷-HCl，pH 7.4，1%NP-40，150mM NaCl，1mM乙二胺四乙酸，10mMβ-甘油磷酸，1mM Na）中进行裂解三VO（旁白）4，10mM NaF），含1%蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich）。变性蛋白质通过十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移到聚偏氟乙烯膜上。通过与特定抗体孵育检测蛋白质表达，并使用化学发光检测试剂（ECL-plus；GE Healthcare）进行可视化。使用ImageJ分析软件（美国国立卫生研究院，http://rsbweb.nih.gov/ij). 对于免疫沉淀，细胞在NP-40裂解缓冲液中进行裂解。在抗体孵育过夜之前，用蛋白A珠（Millipore）在4°C下预孵育1小时，以预处理上清。在Laemmli缓冲液（125mM三（羟甲基）氨甲烷-HCl，4%十二烷基硫酸钠，20%甘油，10%2-巯基乙醇，0.004%溴酚蓝）中再次悬浮之前，清洗免疫沉淀物，并在100°C下煮沸5分钟。样品均经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并转移到聚偏氟乙烯膜上。
c-Mpl周转分析
BaF Mpl和BaF MplK553+573在用磺酸盐标记膜蛋白之前，将IL-3对数期生长的R细胞在磷酸盐缓冲液中洗涤3次-N个-如前所述，在4°C条件下放置1小时。13生物素化反应通过添加100mM甘氨酸进行猝灭，通过反复洗涤去除未结合的生物素化试剂。然后将细胞放回含有10%FBS且不含细胞因子的培养基中0至6小时，然后进行细胞溶解。生物素化蛋白用中性白细胞介素标记的琼脂糖珠提取，沉淀物用Western blot分析c-Mpl。通过复制普遍存在的膜定位Na来控制膜蛋白的负载+/K（K）+ATP酶α1。
MTT增殖试验
对数期生长的BaF-Mpl克隆用磷酸盐缓冲盐水洗涤3次，以去除IL-3，再悬浮在添加2%FBS的RPMI1640中，并以1000个细胞/孔的浓度电镀到96个平板中。然后以1 pg/mL至100 ng/mL的浓度添加rhTpo。细胞在用2 mg/mL 3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）试剂（Sigma）处理之前培养48小时，并在37°C下培养5小时。裂解细胞，并将甲赞晶体溶于100μL MTT裂解溶液（dH2O、 20%十二烷基硫酸钠，40%N、 N个-二甲基甲酰胺、2%乙酸、0.2%HCl）在37°C下保持6小时。然后在570 nm的比色板阅读器上读取吸光度。每个数据点表示为最大剂量的小鼠IL-3（4μL/mL小鼠IL-3上清液）刺激的增殖百分比。每个实验都是用两个不同的克隆对每个野生型或突变型c-Mpl构建体进行三次实验。
RNA干扰
小鼠c-Cbl的siRNA购自Thermo Scientific。使用了4种特定siRNA的组合（siGenome SMARTpool M-040165-00-0005）：（1）GAUCUGACCAUGAUU，（2）GGAGACACUUCCGGAUUA，（3）GGCGAAAACCUGAAUU，和（4）GAAGAGGACAGAUAUA。如前所述，使用Amaxa核转染器（Lonza）将siRNA转染到细胞中。13转染48小时后用Western blot分析蛋白敲除情况。
结果
Tpo刺激介导c-Mpl的蛋白酶体和溶酶体降解
首先，我们确定在Tpo刺激后c-Mpl是否通过蛋白酶体和/或溶酶体途径降解。在饥饿培养基（RPMI，不含细胞因子的2%FBS）中培养12小时后，用蛋白酶体抑制剂MG-132或溶酶体抑制剂NH处理BaF-Mpl细胞4Cl，与环己酰亚胺（Chx）结合以防止从头开始蛋白质合成，以及rhTpo，时间为.
Tpo刺激的c-Mpl被蛋白酶体和溶酶体降解。（A） 用Chx处理BaF-Mpl细胞0至240分钟，以抑制与rhTpo、MG-132和NH结合或不结合的新蛋白的合成4Cl.c-Mpl降解是通过是否存在成熟的85-kDa形式的c-Mpl来确定的。（B） 在骨髓衍生的小鼠巨核细胞和人类血小板上也进行了类似的实验。所示数据代表了3个独立实验。
成熟细胞表面c-Mpl受体由于广泛的糖基化而显示出85 kDa的分子量，而分泌途径是80-kDa形式。13,24在缺乏rhTpo的情况下，BaF-Mpl细胞缓慢降解c-Mpl蛋白的表面受体形式(A） ●●●●。相比之下，经rhTpo处理的细胞在60分钟内表现出成熟c-Mpl蛋白的广泛降解，而MG-132预处理则大大抑制了这种降解。尽管c-Mpl的表达在对照BaF-Mpl细胞和溶酶体抑制剂NH预处理的细胞之间没有变化4在向培养物中添加Tpo后的前60分钟内，在60至120分钟内观察到的受体降解显著减少。为了在更具生理相关性的环境中证实这些发现，我们从C57/Bl6小鼠中纯化并研究了小鼠巨核细胞(B左面板）。与BaF-Mpl细胞相比，小鼠巨核细胞表现出的成熟85-kDa蛋白比几乎不存在的未成熟细胞内80-kDa形式多得多。在Tpo刺激60分钟后，巨核细胞c-Mpl蛋白显著降低，而MG-132和NH的加入可阻断该蛋白的表达4Cl.有趣的是，经Tpo刺激分离的人类血小板后，c-Mpl没有降解(B右侧面板）。
Tpo刺激导致c-Mpl泛素化
由于蛋白质的蛋白酶体降解需要多泛素化，我们接下来研究了Tpo刺激对c-Mpl泛素化的影响。用MG-132处理BaF-Mpl细胞135分钟，并在用MG-132孵育结束前10至120分钟加入Tpo。对照细胞与MG-132单独孵育135分钟。用抗Mpl抗体免疫沉淀全细胞裂解物，并用抗泛素抗体进行Western blotting分析。在Tpo刺激10至30分钟后，作为高分子量涂片检测到泛素化c-Mpl(A） ●●●●。使用小鼠巨核细胞，我们还发现Tpo刺激60分钟后c-Mpl泛素化增加(B） ●●●●。接下来，我们通过在Tpo刺激前用JAK2抑制剂JAKI预处理BaF-Mpl细胞30分钟来确定Janus激酶2（JAK2）在Tpo-刺激的c-Mpl泛素化中的作用。我们发现JAKI存在时，Tpo刺激的c-Mpl泛素化没有显著差异(C） ●●●●。JAKI的有效性通过对磷酸化-STAT5进行蛋白质印迹来确定，磷酸化-SATAT5由活性JAK2直接磷酸化。我们发现抑制剂能够有效地完全阻断STAT5磷酸化。
Tpo刺激c-Mpl的泛素化。（A） 用MG-132和rhTpo处理BaF-Mpl细胞0至120分钟，并用抗单/多泛素抗体通过c-Mpl免疫沉淀（IP）和免疫印迹（IB）分析c-Mpl泛素化。泛素化被视为高分子量涂片。所示数据代表了3个独立实验。通过用抗c-Mpl抗体复制IB来分析蛋白质负载的等效性。（B） 骨髓衍生巨核细胞用MG-132预处理0或60分钟，有或没有rhTpo。巨核细胞c-Mpl泛素化分析如图A所示，所示的印迹是2个独立实验的代表。（C） BaF-Mpl细胞在Tpo刺激（50 ng/mL，60分钟）前用载体对照（DMSO）或JAK2抑制剂JAKI预处理30分钟，并分析C-Mpl泛素化。JAKI抑制JAK2活性的有效性通过分析磷（p）–STAT5的水平来确定。数据是两个独立实验的代表。
为了进一步研究单泛素化和多泛素化对c-Mpl功能的影响，我们突变了2个细胞内赖氨酸（K）残基K553和K573精氨酸野生型受体（R；A） ●●●●。接下来我们产生了2个野生型c-Mpl和2个突变型c-MplK553+573R克隆和经Western blotting证实的c-Mpl蛋白的相等总表达(B） 以及通过流式细胞术获得相等的细胞表面表达（数据未显示）。受体只有1个突变（c-MplK553R和K573R） 表现出正常的泛素化，表明这两种赖氨酸都是泛素化位点(C） ●●●●。通过突变细胞内赖氨酸残基，我们阻止了Tpo刺激的c-Mpl泛素化(D） 。所有3个突变细胞系（K553R、 K（K）573R、 和K553+573R） 与对照细胞相比，显示出正常的Tpo刺激的c-Mpl内化（数据未显示）。接下来，我们利用表达野生型（WT）–Mpl和MplK的细胞，确定c-Mpl的泛素化是否参与在没有Tpo的情况下成熟的细胞表面定位受体的转换553+573R。为了检测细胞表面c-Mpl的水平，我们开发了一种敏感的膜蛋白生物素化试验，其中所有表面蛋白首先进行生物素化，在不同的时间间隔后，对细胞进行裂解，用亲和素珠特异性捕获剩余的表面蛋白，并通过Western blotting识别c-Mpl。我们发现c-MplK的正常细胞表面周转率显著降低553+573R与WT c-Mpl相比(E） ●●●●。例如，4小时后，c-MplK的58%（±12%）553+573R留在细胞表面，而WT c-Mpl仅为22%（±2%）。在6小时时观察到类似的模式（c-MplK553+573R 34%（±7%）与WT c-Mpl 6%（±1%）。
c-Mpl在K处泛素化553和K573.（A） 人类c-Mpl细胞内结构域的示意图，显示2个细胞内赖氨酸（K）残基相对于酪氨酸（Y）和框1和框2的位置。（B） 2个WT c-Mpl克隆和2个c-MplK中总c-Mpl表达的Western blot分析553+573R克隆。（C） 表达C-Mpl的细胞具有单一的K到R突变（C-Mpl K553R和c-Mpl K573R） 显示正常水平的c-Mpl泛素化，以响应Tpo刺激。（D） 表达WT c-Mpl或c-MplK的BaF细胞经60分钟Tpo刺激后c-Mpl泛素化553+573R.所示数据代表了3个独立实验。（E） 表达WT c-Mpl和c-MplK的BaF细胞中成熟的膜定位c-Mpl的生物素化553+573R确定6小时内的正常营业额。所示的Western blot是3个独立实验的代表。该图显示了两种细胞系中成熟的85-kDa c-Mpl的周转量的定量，这是通过密度测定法测定的，而时间为0（100%）。蛋白质负荷通过与表面钠的比较进行标准化+/K（K）+ATP酶α1表达。数据点代表3个独立实验的平均值±SE(*P（P）< .05, ***P（P）< .001; 学生t吨测试）。
BaF-MplK公司553+573R细胞对Tpo反应过度增殖
接下来，我们使用了BaF-Mpl和BaF-MplK553+573R细胞确定c-Mpl泛素化对Tpo刺激的增殖和信号传导的生物学意义。用rhTpo处理后，所有克隆中的细胞都以浓度依赖的方式增殖。总的来说，BaF MplK553+573与BaF-Mpl细胞相比，R细胞显示Tpo刺激的增殖增加。在rhTpo（0.1 ng/mL）的次最大浓度下，BaF-MplK553+573与BaF-Mpl中的28%（±1.5%）相比，R达到了IL-3诱导的最大细胞增殖的53%（±1.3%）。在rhTpo的最大浓度（1 ng/mL）下，BaF-MplK553+573R细胞增殖至IL-3诱导的最大浓度的98%（±3.5%），而BaF-Mpl细胞增殖至80%（±2.8%）(A） ●●●●。确定Tpo是否诱导c-MplK的信号传导553+573R细胞与BaF-Mpl细胞不同，我们检测了Tpo正常刺激的几种主要信号通路，包括JAK2、STAT5、细胞外信号相关激酶1/2和磷脂酰肌醇-3激酶/AKT。测定了180分钟内Tpo浓度增加时的激活水平和信号动力学，并且在这些信号通路中未观察到显著差异（数据未显示）。然而，经MG-132预处理的BaF-Mpl细胞在Tpo刺激60分钟后c-Mpl磷酸化延长(B） ●●●●。此外，与BaF-Mpl细胞相比，BaF-MplK553+573Tpo刺激后，R细胞的c-Mpl磷酸化显著增加（5分钟），延长（60分钟）。相反，MG-132对延长BaF-MplK的磷酸化没有影响553+573R电池。接下来我们研究了c-MplK的作用553+573c-Mpl降解的R。BaF-Mpl和BaF-MplK553+573R细胞用Chx预处理60分钟，然后用rhTpo刺激0至120分钟，然后通过Western blotting分析c-Mpl蛋白(C-D）。60分钟后，49%的野生型c-Mpl蛋白仍然存在，而89%的c-MplK553+573在Chx和Tpo处理的细胞中仍然存在R。c-MplK的降解553+57360分钟后R继续，120分钟后只有32%的c-Mpl仍能检测到。
c-MplK公司553+573R表现出Tpo诱导的增殖和降解的改变。（A） 使用表达WT c-Mpl或c-Mpl的BaF细胞进行MTT增殖试验553+573用浓度增加的rhTpo处理R.细胞长达48小时。数据代表了3个单独实验的平均值（±SE），每组使用2个稳定表达的克隆(*P（P）< .05, ***P（P）< .001). （B） 使用和不使用MG-132的Tpo诱导的c-Mpl磷酸化的蛋白质印迹分析。这些数据代表了3个单独的实验。（C） Tpo诱导WT C-Mpl和C-MplK C-Mpl降解的Western blot分析553+573R细胞在Tpo刺激前用Chx预处理60分钟，最多120分钟。（D） c-Mpl降解的图形表示，使用密度测定法比较时间0时的成熟（85-kDa）c-Mpl。
C-Cbl在C-Mpl的泛素化中充当E3连接酶
E3泛素连接酶需要将泛素共价连接到目标蛋白的赖氨酸残基上。C-Cbl以前被证明是E3连接酶，在巨核细胞和其他造血细胞中表达。C-Cbl也可由Tpo激活。25,26为了检测c-Cbl是否参与c-Mpl的降解，我们首先使用特异性siRNA来减弱BaF-Mpl细胞中c-Cbl-蛋白的表达(A） ●●●●。与非靶向siRNA处理的对照BaF-Mpl细胞相比，Tpo刺激后c-Cbl蛋白表达降低导致c-Mpl泛素化显著降低(B） ●●●●。然后，我们通过将非靶向细胞和c-Cbl siRNA处理的细胞与Chx预孵育30分钟，然后再使用Tpo刺激60分钟，来确定c-Cbl-siRNA对Tpo-刺激的c-Mpl降解的影响。60分钟后，82%的成熟（85-kDa）c-Mpl残留在c-Cbl siRNA处理的细胞中，而非靶向siRNA处理样品中的残留率为49%(C-D顶部面板）。在BaF-MplK上也进行了c-Cbl-siRNA实验553+573不能泛素化的R细胞(D） 。在这些细胞中，c-Cbl-siRNA对Tpo刺激的降解没有显著影响(C-D底部面板）。为了证实c-Cbl是c-Mpl的E3连接酶，而不是间接泛素化途径的一部分，我们测定了c-CblC的作用379关于c-Mpl周转的A，一种c-Cbl的RING-finger域E3功能失活突变体。稳定WT-c-Cbl或c-CblC379A–BaF-Mpl细胞过度表达(A） MG-132预处理30分钟后60分钟，首次分析Tpo刺激的c-Mpl泛素化。我们发现c-CblC过度表达的细胞泛素化显著降低379A类(B） 与野生型c-Cbl相比。检测c-CblC是否过度表达379A将模仿BaF-MplK中发现的过度增殖表型553+573R电池(A） ，我们对过度表达2种形式的c-Cbl的BaF-Mpl细胞进行了MTT增殖试验。我们发现BaF-Mpl/c-CblC中1和10 ng/mL rhTpo的细胞生长显著增加379与过度表达野生型c-Cbl的细胞的比较(C） ，与我们在BaF-MplK中的发现一致553+573R电池。
c-Cbl-siRNA减少Tpo诱导的c-Mpl泛素化和降解。（A） 转染48小时后，c-Cbl-siRNA显著降低BaF-Mpl细胞中c-Cbl的表达。（B） 与非靶向siRNA处理的细胞相比，经c-Cbl处理的细胞中c-Mpl泛素化减少。所示数据代表了4个单独的实验。（C） 使用BaF-WT-Mpl和BaF-MplK的裂解产物，通过Western blot分析Tpo刺激的C-Mpl降解553+573用c-Cbl特异性和非靶向siRNAs处理R细胞，并用Chx预处理60分钟，然后再刺激Tpo达60分钟。（D） 降解的图形表示，比较用c-Cbl特异性siRNA与非靶向siRNA处理的细胞中成熟（85-kDa）形式的c-Mpl。数据点表示3个独立实验的平均值±SE(*P（P）< .05, **P（P）< .01; 学生t吨测试）。
c-Cbl在Tpo刺激的c-Mpl泛素化中充当泛素E3连接酶。（A） BaF-Mpl细胞过度表达WT-Cbl或E3连接酶死亡CblC379A.（B）WT-Cbl-和CblC379用MG-132预处理A表达细胞，然后用或不用rhTpo处理60分钟，用IP和Western blot分析c-Mpl泛素化。所示数据代表了3个独立实验。（C） 在增加rhTpo浓度的情况下，使用MTT法分析这些细胞的增殖情况。所示数据代表3个独立实验的平均值（±SE）(*P（P）< .05, ***P（P）< .001).
讨论
在配体诱导生长因子受体活化后，一些负反馈机制调节细胞内信号事件的强度和持续时间，以获得适当的细胞反应。27–29缺乏或获得功能可导致细胞生长失控和恶性肿瘤。30虽然对几种不同的膜受体的负调控机制进行了广泛研究，但Tpo刺激后激活的c-Mpl的调控机制，尤其是受体降解的机制，在很大程度上尚不清楚。在这项工作中，我们证明，在Tpo刺激后，c-Mpl通过蛋白酶体和溶酶体途径降解，并且抑制受体泛素化（从而抑制蛋白酶体降解）导致造血细胞系中的过度增殖表型。
先前关于促红细胞生成素受体（EpoR）的研究表明，c-Mpl与Epo具有显著同源性，在用Epo刺激后，该受体的蛋白酶体和溶酶体降解也具有类似的作用。31实际上，激活后受体的降解和泛素化动力学也类似。然而，Walrafen等人发现c-Cbl特异性siRNA和突变c-Cbl-的过度表达对EpoR泛素化没有影响。31在本研究中，我们证明c-Cbl可以作为E3连接酶，对Tpo介导的c-Mpl泛素化很重要。综上所述，这两个发现表明，不同的分子途径介导了这两个受体的泛素化。尽管我们无法通过共免疫沉淀证明c-Mpl和c-Cbl之间的直接相互作用（数据未显示），但这可能是由于c-Cbl与其靶标之间相互作用的瞬态性质，或者可能表明需要衔接蛋白来连接c-Cbl和c-Mpl受体。磷酸酶SHP2已被鉴定为IL-6受体信号亚单位gp130和c-Cbl的衔接蛋白，可通过c-Cbl.实现受体的泛素化。32我们发现SHP2可以被招募到激活的c-Mpl（I.S.H.，未公开的数据），这使得类似的c-Cbl招募到c-Mpl的机制似乎可行。有趣的是，我们还发现Tpo刺激的c-Mpl泛素化似乎是JAK2依赖性途径。JAK2诱导的依赖性c-Mpl泛素化也支持我们的发现，c-Mpl的泛素化和降解发生在缺乏细胞因子的情况下。结果显示于E表明表面定位的c-Mpl具有一定的背景转换水平，其中大多数成熟受体大约每6小时被替换一次。据推测，通过刺激相同或不同的内化和降解途径，Tpo刺激极大地增加了这种转换的动力学。应该指出，通过siRNA或c-CblC过度表达，c-Cbl功能降低379A、 减少而不是完全阻止c-Mpl泛素化。因此，其他泛素E3连接酶（其中有数百种）也很可能参与c-Mpl泛素化。我们目前正在研究非刺激和Tpo刺激的c-Mpl转换、c-Mpl和c-Cbl相互作用的信号通路，并鉴定其他可能参与c-Mpl泛素化的E3连接酶。
因为一些膜受体的单泛素化以前被描述为对其内在化至关重要（在Hitchcock等人13)，我们使用BaF-MplK解决了这个问题553+573R细胞模型，不能在细胞内泛素化。使用该细胞系，我们发现c-Mpl对Tpo的内化反应是正常的，表明c-Mpl内化需要其他机制。我们最近描述了细胞内基序Y的重要性591RRL用于招募衔接蛋白，允许c-Mpl以网格蛋白依赖的方式从细胞表面快速内化。33–37其他受体，如表皮生长因子、生长激素、瘦素和转铁蛋白的受体，需要泛素化以实现氯氰菊酯依赖的内化。38,39这些受体包含保守的细胞内酪氨酸、丝氨酸和赖氨酸残基，这些残基是泛素依赖性内化所必需的。6对于c-Mpl，用精氨酸替换细胞内的两个赖氨酸残基并没有改变内化动力学。因此，我们得出结论，c-Mpl的泛素化并不是其内化所必需的。
我们还确定了c-Mpl泛素化作为Tpo信号负反馈调节器的作用。BaF-MplK公司553+573R细胞不能在细胞内域进行泛素化，对Tpo反应过度增殖。尽管我们发现c-MplK之间的主要信号通路没有显著差异553+573R和WT-c-Mpl（数据未显示），我们确实发现受体磷酸化增加并延长。其他信号蛋白磷酸化对接位点的持续存在，特别是在细胞内Y625和Y631STATs和适配器蛋白生长因子受体结合蛋白2、sevenless之子和SHC的已知结合位点（在Rathinam等人40)，可以解释观察到的过度增殖表型。证实了我们对突变的c-Mpl的观察结果，我们发现c-Cbl过度表达后具有一个禁用的RING-finger结构域，有一个类似但没有那么强的过度增殖表型。这些发现与Rathinam等人的研究一致，他们在该研究中描述了缺乏内源性c-Cbl的造血干细胞中的过度增殖表型，而是用非活性的RING-finger结构域表达c-Cbl。研究人员描述了Tpo刺激后STAT5磷酸化水平增加，随后c-Myc表达增加。41,42我们的数据不仅支持这些发现，还假设c-Cbl的作用之一是作为泛素E3连接酶直接作用于c-Mpl，从而在Tpo刺激后介导信号传导。我们目前正在研究c-Cbl在造血干细胞和初级成熟巨核细胞c-Mpl泛素化中的作用。
有趣的是，最近在急性髓细胞白血病患者中描述了影响c-Cbl E3连接酶功能的新突变，这表明c-Cbl作为造血癌基因具有重要作用。在这方面，确定c-Cbl的相同或不同突变是否存在于依赖Tpo信号传导的骨髓增生性疾病中，如原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化，将是非常有趣的。
我们的研究为Tpo信号的调控机制提供了新的见解，确定了在Tpo刺激后泛素化的c-Mpl的细胞内赖氨酸残基，并确定了c-Cbl作为c-Mpl E3泛素连接酶的作用。我们的发现为Tpo信号的调节和c-Mpl的降解提供了新的见解。类似的机制也可能在调节众多造血生长因子的信号传导方面发挥重要作用，严重影响造血谱系的增殖和分化。
确认
本研究得到了美国国立卫生研究院拨款R01DK049855和P01 HL078784-04的支持。
脚注
内部血液本文的分析出现在这个问题的前面。
这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，仅为了表明这一事实，根据《美国法典》第18卷第1734节，本文特此标记为“广告”。
作者
贡献：所有作者都对论文内容做出了实质性贡献，并同意以当前格式提交；V.S.进行研究并分析数据；A.E.G.和K.K.设计了实验，解释了数据，并编辑了手稿；S.J.S.和I.S.H.设计并进行了研究，分析了数据，并撰写了手稿。
利益冲突披露：作者声明没有相互竞争的财务利益。
通讯员：Ian S.Hitchcock，加州大学圣地亚哥分校医学系，9500 Gilman Dr，MD 0726，La Jolla，CA 92093；电子邮件：ude.dscu@kochctihi.
工具书类
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