心脏特异性删除立方厘米B1揭示钙调神经磷酸酶调节心脏生长和功能的多种机制^*♦

肌角收缩性与钙²⁺瞬态

肌角蛋白长度测量和Ca²⁺根据之前描述的程序，使用PTI系统（Photon Technology International，Birmingham，NJ）进行瞬态(34)。简单地说，新鲜分离的成年心肌细胞在平板培养基（含有1.8 m的培养基199）中培养2 h米钙²⁺实验前30min，将1%青霉素和链霉素、5%小牛血清、1mg/ml 2,3-丁二酮-2-单辛）切换至培养基（培养基199、1%青霉素、链霉素、1μg/ml牛血清白蛋白）。为了进行测量，在60伏、0.5赫兹的频率下对肌细胞进行电刺激。使用视频边缘检测测量肌细胞收缩，并在10个收缩周期内取平均值。用于钙的肌细胞²⁺瞬变物首先在含有5μ米Fura-2 AM（分子探针，Invitrogen）。钙²⁺在10个周期内平均瞬态，并如前所述分析动力学(34).

细胞培养与感染

从胚胎第13.5天开始获得原代小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）CnB1-氧化物胚胎和培养如前所述(35)。第4代MEF感染β-半乳糖苷酶、Cre、组成活性CnA（ΔCnA）或NFAT-luciferase报告腺病毒24小时。感染后，在实验前将MEF切换到含有0.5%热灭活牛小牛血清的Dulbecco改良Eagle's培养基中72小时。

组织学分析、免疫染色和电子显微镜

在指定的时间采集心脏，将其固定在10%福尔马林（磷酸盐缓冲盐缓冲）中，脱水，并包埋在石蜡中。从用苏木精和伊红染色的纵向5μm去石蜡切片确定整体心脏构型。分别用Masson三色法和周期性酸性-Schiff染色法检测心肌纤维化和糖原含量。对于细胞面积测量，5μm心脏切片脱蜡并用异硫氰酸荧光素或TRITC标记的凝集素（Sigma）和TO-PRO-3碘（分子探针，Invitrogen）染色。立即用4%多聚甲醛固定5周龄的分离成年心肌细胞，将其涂布在聚赖氨酸涂层玻片（Sigma）上，并用双苯甲酰亚胺（100μg/ml）孵育1小时，以显示细胞核。使用ImageJ 1.33软件（Scion Corp.，Frederick，MD）对每个实验组至少500个来自三种不同动物的心肌细胞进行量化。在TAC后1天或异丙肾上腺素刺激后3天，使用TMR Red测定末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）就地检测试剂盒符合制造商的说明（罗氏诊断）。用异硫氰酸荧光素标记的凝集素和TO-PRO-3碘对膜和细胞核进行复染(31)。每个实验组至少分析来自三种不同动物的100000个心肌细胞。如前所述，对心室增殖进行量化(36)。简单地说，在BrdUrd标记4小时后收获3天大的心脏。在标记有BrdUrd抗体（1/50，分子探针，Invitrogen）和GATA4抗体（1/50Santa Cruz Biotechnology，Santa Cru，CA）的5μm石蜡切片上鉴定出心肌细胞BrdUrd掺入。如前所述，进行抗磷酸Ser-10-istone H3染色（1/50，Upstate Biotechnology，Billerica，MA）和抗CD31染色（1/100，Chemicon）(36，37)。对于透射电子显微镜，胚胎第18.5天CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^Nkx2.5芯胚胎固定在戊二醛和二甲氨基甲酸酯中，包埋在环氧树脂中并切片，如前所述用乙酸铀酰和柠檬酸铅复染(38).

NFAT报告者分析

将NFAT-luciferase报告基因转基因小鼠或NFAT-lugiferase感染的MEF的心脏在裂解缓冲液（100 m）中均质化米KPO公司₄，0.5%Nonidet P-40，1米米在荧光素酶缓冲液（100m米三氯化氢pH 7.5，10 m米醋酸镁，1 m米EDTA，0.1米米荧光素，0.3米米ATP）。荧光素酶活性表示为每微克蛋白质的相对光单位(30).

西方印迹法

对于Western blotting，心脏在改良的放射免疫沉淀缓冲液（10 m米三氯化氢，pH 7.5，150 m米氯化钠、4%甘油、0.5 m米纳₂S公司₂O（运行）₅，1%Triton X-100，0.1%脱氧胆酸钠，0.05%十二烷基硫酸钠），含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂鸡尾酒I和II（罗氏诊断），并在12000×克15分钟。针对钙调神经磷酸酶A（α/β亚型）的抗体来自Chemicon（Billerica，MA）。抗CnB和抗磷酸化磷蛋白S16（PLN）抗体购自Upstate Biotechnology。针对PLN的抗体来自亲和生物试剂，抗磷酸-PLN-T17来自Badrilla（英国利兹），抗α1c（L型钙²⁺通道孔亚单位）来自Alomone Labs（耶路撒冷，以色列）和抗Na⁺/钙²⁺交换机-1（NCX1）来自Swant（瑞士贝林佐纳）。抗弓形虫网钙²⁺ATP酶（SERCA2）、抗ryanodine受体-2（RyR2）和抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体购自Santa Cruz Biotechnology。

逆转录聚合酶链反应

按照制造商的说明，使用SuperScript III（Invitrogen）对一微克DNA酶I处理的RNA进行半定量RT-PCR。反应包括50℃下50 min的初始RT反应，然后扩增26个PCR循环（94℃20 s；54℃40 s，72℃45 s）。引物用于α1c（5′-acacagcaaataaagcccctg-3′；5′-ggccagctctctctcctt-3′）；L型钙²⁺通道副亚基β2（β2）（5′-ggttcggacactcctacac-3′；5′-tccgattcctacctt-3′）；NCX1（5′-caccatacatgcacataac-3′；5′-ctccatcatgcacatgctc-3′）；β₂-肾上腺素能受体（β₂AR）（5′-cgtcctgattgttctctctctacg-3′；5′-agctgtcccataggttcg-3′）；SERCA2（5′-ctccattgcctccatgt-3′；5′-gaagcggttcatccattg-3′）；RyR2（5′-aagagacacttcccgtacgagc-3′；5′-aaaagagcccttgcgacaga-3′）；印尼国家电力公司（5′-actgtgacgataccagaga-3′；5′-cagcacacatacatagatg-3′）；和L7（5′-aagaccatctatgagaaggc-3′；5′-aagaccagaagctgcagaac-3′）。

心脏纤维力学实验

如前所述，从6周龄小鼠的乳头肌中分离出心肌纤维，并在皂苷（50μg/ml）中渗透30分钟(39)。简单地说，光纤安装在与力传感器（AE 801，Microelectronics，Horton，Norway）相连的不锈钢挂钩上，并浸入含有阶梯状Ca的腔室中²⁺可调溶液（10 m米EGTA，40米米BES（pH 7.1），1 m米游离镁²⁺，10米米牛磺酸，3米米K（K）₂高性能操作₄，0.5米米二硫苏糖醇，3.16米米ATP，160米米甲基磺酸钾，6%右旋糖酐）。在22°C下通过激光衍射测量肌角蛋白长度，并调整至最大值（2.1–2.2μm）。张力（单位：毫牛顿mm⁻²)在游离钙下测量²⁺浓度，1 n米（静压力）和31.6μ米（主动力）。

纤维化和糖原定量

如前所述，使用MetaMorph 6.1软件（Universal Imaging Corp.）对Masson三色或周期性酸-希夫粉红色糖原染色染色的心脏中的蓝色胶原沉积进行定量(14)。在每个实验组至少三只小鼠中，每只小鼠共分析五张覆盖整个心脏切片的图片（放大×100）。

成人心脏中CnB1的显著缺失导致功能改变和最终死亡

CnB1-氧化物小鼠还与αMHC-Cre转基因小鼠杂交，作为在出生后发育过程中删除钙调神经磷酸酶的手段，以便研究对成熟心脏的影响。到2周大时，该策略导致心脏中钙调神经磷酸酶A/B蛋白缺失70-80%(图2A类)。αMHC-Cre转基因继续在青少年和成人心脏中表达，因此随着时间的推移，缺失变得更加广泛。为了更准确地量化这种影响，我们将CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}NFAT-核糖核酸酶报告基因转基因小鼠。心脏分析来自CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}在2个月大时，与仅使用αMHC-C的对照组相比，小鼠的钙调神经磷酸酶-NFAT总活性降低了85%以上(图2B类)。确定CnB1的缺失是否真的削弱了CnA的功能体内，我们分析了CnA蛋白的稳定性和NFAT核糖核酸酶活性立方厘米B1-删除了MEF。使用表达Cre重组酶的腺病毒删除立方厘米B1来自含有LoxP靶向纯合等位基因的MEF，该等位基因将CnA和CnB1蛋白水平降低约90%(图2C类)。用表达活化（截短）形式的CnA的腺病毒同时感染显示出相对稳定的表达，即使在不存在CnB1的情况下也是如此(图2C类)。然而，激活的CnA表达基本上无法显著诱导NFAT-核糖核酸酶活性立方厘米B1-删除的MEF(图2D类)。这些结果表明，CnB1的缺失阻断了所有CnA-NFAT活性。对于基因靶向小鼠，心肌细胞中钙调神经磷酸酶总活性的显著降低与6个月龄时50%的致死率和8个月龄完全致死率相关(图2E类)。超声心动图对心室功能的评估显示，即使在1个月大的时候CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}坚持到死亡的老鼠(图2F类)。心脏功能受损与年轻时左心室扩张和老年小鼠左心室舒张减少有关(图2，G公司和小时)。还出现了其他心脏病指标，如显著的心脏纤维化(图3，A类和B类)。此外，CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}小鼠对心脏应激刺激高度敏感，经TAC压力超负荷刺激仅6天即可完全致死，而所有对照小鼠在此期间及以后存活(图3C类)。在Alzet微型泵中输注异丙肾上腺素（Iso）也导致CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}11天后，注射Ang/PE对小鼠同样致命，而对对照组几乎没有影响(图3，D类和E类)。相反，与对照组相比，游泳运动对心脏的生理刺激并不会导致显著的死亡(图3F类).

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图2。

CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}小鼠在早期发生心力衰竭。 A类，2周龄儿童CnB和pan-CnA蛋白水平的代表性Western blots重量^{αMHC-Cre公司}和CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}心脏(n个=3个独立实验）。B类，2月龄心脏荧光素酶活性的定量重量^{αMHC-Cre公司}(n个=4）和CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}(n个=3）携带NFAT荧光素酶报告基因转基因的小鼠(NFAT-luc-TG公司).RLU（RLU），相对灯光单位。C类WT和WT中CnB、pan-CnA和活化CnA（Δ）蛋白水平的Western blotsCnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）MEFs感染AdCre和AdΔCnA。D类、AdNFAT-luciferase报告感染WT中荧光素酶活性的定量CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）伴有AdCre感染和Ad-β-半乳糖苷酶的MEF(广告β加仑，控制）或AdΔCnA。E类，死亡率CnB1流量/流量^{αMHC-Cre公司}（最初n个=8）和重量^{αMHC-Cre公司}（最初n个=8）只小鼠(第页< 0.001).F类心室缩短分数的月度超声心动图分析(金融服务)英寸CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}和重量^{αMHC-Cre公司}小鼠（最初n个=每组8只小鼠）（*，第页< 0.05).G公司每月超声心动图分析左室舒张末期内径(LVED公司)英寸CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}和重量^{αMHC-Cre公司}小鼠（最初n个=每组8只小鼠）（*，第页< 0.05).H（H）月超声心动图分析左心室收缩末期内径(LVES公司)英寸CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}和重量^{αMHC-Cre公司}小鼠（最初n个=每组8只小鼠）（*，第页< 0.05).

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图3。

心脏病理学与应激性猝死CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}老鼠。 A类3个月大的心脏组织切片的Masson三色染色重量^{αMHC-Cre公司}和CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}老鼠。B类，中描述的Masson经毛染色的组织学心脏切片中纤维化的量化A类(n个=每组3只小鼠，*，第页< 0.05).C类，2个月大的存活率重量^{αMHC Cre公司}(n个=4）和CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}老鼠(n个=7）受TAC影响(第页< 0.0001).D类，2个月大的存活率重量^{αMHC-Cre公司}(n个=7）和CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}(n个=9）小鼠植入释放Iso的Alzet微型泵（60 mg/kg/天，第页< 0.05).E类，2个月大的存活率重量^{αMHC-Cre公司}(n个=6）和CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}老鼠(n个=6）植入含有Ang/PE的Alzet微型泵（Ang/PE分别为432μg/kg/天和100 mg/kg/天，第页< 0.03).F类，2个月大的存活曲线重量^{αMHC-Cre公司}(n个=8）和CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}老鼠(n个=10）每天游泳3周。G公司和H（H）TUNEL法免疫组化检测心脏细胞凋亡重量^{αMHC Cre公司}和CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}接受1天TAC的小鼠(G公司)或Iso输液(H（H）)（至少统计了100000个核；n个=每组3只小鼠，*，第页< 0.05对sham；#，第页< 0.05对WT Iso）。

然而，心力衰竭的恶化似乎并不构成CnB1流量/流量^{αMHC Cre公司}TAC后48小时，未出现因肺水肿而衰老的小鼠，心功能下降状态保持稳定，体重保持稳定，心功能未恶化（数据未显示）。尽管TUNEL的组织学分析显示CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}TAC和Iso刺激后的小鼠(图3，G公司和H（H）)，这可能是由于收缩力降低导致神经体液刺激的代偿性增加。综合这些结果表明，心脏CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}小鼠有一种独特的病理特征，即长期保持功能低下而无失败，但在基线和病理刺激下更容易猝死。

CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^αMHC-Cre小鼠心脏传导和离子处理基因发生显著变化

尽管CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}小鼠在TAC和Iso刺激后心肌细胞TUNEL水平增加，这种改变不太可能解释TAC、Iso和Ang/PE刺激后这些小鼠的急性致死性。我们怀疑CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}小鼠突然死亡，可能是由于心律失常。因此，四只对照组和四只基因缺失小鼠被植入遥测设备，用于连续7天以上的心电图记录（5个月大的小鼠）。所有四只对照小鼠的心律正常，没有出现任何紊乱，但所有四只CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}小鼠出现心律失常，几乎没有稳定的心律周期(图4A类)。重要的是，其中两个CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}小鼠在7天的遥测分析中死亡，其中一天之前出现了严重心律失常(图4A类)。心电图解释显示一级房室结阻滞、快速心律失常和低振幅QRS波群，提示所有患者的电压降低CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}研究的小鼠(图4A类).

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图4。

心律失常和钙改变²⁺-处理基因CnB1流量/流量^{αMHC-Cre公司}老鼠。 A类，5个月大的婴儿连续遥测心电图记录重量^{αMHC-Cre公司}老鼠(顶部面板)和CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}老鼠(下部面板)。显示了具有代表性的痕迹。B类，2个月大婴儿心脏的半定量RT-PCR分析重量^{αMHC-Cre公司}和CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}老鼠(n个=每组2只动物）。核糖体蛋白L7 mRNA用于归一化。应收账β2，肾上腺素能受体β₂.C类，1个月龄婴儿分离蛋白的Western blots重量^{αMHC-Cre公司}和CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}老鼠(n个=每组4只动物）。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH公司)用作加载控件。S16-印尼盾，Ser-16-PLN；T17-PLN（印尼国家电力公司），Thr-17-PLN。D类，距离静止长度的变化百分比（%L（左）)在成人心肌细胞中重量^{αMHC-Cre公司}和CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}（CnB1^Δ)5周龄小鼠（*，第页<0.01，显示分析的细胞数）。E类，钙的定量²⁺瞬态振幅(放大器。)归一化为基线Fura-2荧光重量^{αMHC-Cre公司}和CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}心肌细胞（*，第页<0.01）。F类，50%放松的时间(放松。)从离体心肌细胞的峰值收缩重量^{αMHC-Cre公司}和CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}小鼠（*，第页<0.01）。

鉴于心律失常的观察结果，我们接下来研究了心脏离子处理基因的表达水平CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}老鼠。该分析显示心脏L型钙的α孔形成亚基（α1c）和β辅助亚基的mRNA水平显著降低²⁺通道，NCX1减少，β2-肾上腺素能受体减少，但SERCA2、RyR2或PLN无变化(图4B类)。在蛋白质水平上，我们还通过Western blots观察到1个月大时心脏提取物中α1c、NCX1、SERCA2和RyR2的严重降低CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}老鼠(图4C类).

Ca表达减弱²⁺-处理与分离心肌细胞功能和钙特征降低相关的蛋白质²⁺瞬态。例如，5周龄的分离心肌细胞CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}与同龄WT对照肌细胞相比，小鼠在培养中几乎没有表现出收缩活性(图4D类)。同样，Ca的振幅²⁺瞬态降低了～50%(图4E类)半放松时间增加了2倍以上(图4F类)。这些结果表明，钙调神经磷酸酶活性与调节离子处理基因表达密切相关，而离子处理基因的表达是心脏正常收缩和传导所必需的。

CnB1fl/fl的其他心脏病指标^αMHC-Cre老鼠

CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}小鼠在2个月大时心肌中的毛细血管含量降低，心脏组织切片的周期性酸-Schiff染色显示糖原储存减少(图5，A–C)。我们还对第18.5天的心脏组织切片进行了透射电子显微镜检查CnB1流量/流量^Nkx2.5芯胚胎表现出早期和严重的功能障碍表型。这些心脏中最明显的缺陷是线粒体结构异常，其特征是肿胀和嵴组织全面丧失，这是心脏衰竭的标志(图5D类)。最后，从心脏提取的去皮纤维CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}小鼠主动力生成减少(图5E类)。这些测量是在受控的钙水平下进行的²⁺表明肌丝本身在立方厘米B1-心脏缺失，提供了钙调神经磷酸酶可能影响心肌细胞收缩力的另一种机制。皮肤肌纤维张力发育中的这种缺陷被认为也是由于选择收缩蛋白的分化基因表达减少而引起的。

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图5。

心脏特异性衰竭表型立方厘米B1-删除了老鼠。 A类，通过CD31抗体染色对2个月大的婴儿心脏组织切片中每个心肌细胞的毛细血管进行定量重量^{αMHC-Cre公司}和CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}老鼠(n个=3只动物/组，*，第页< 0.05).B类，1周龄WT心脏组织切片中糖原含量的代表性图片^{αMHC-Cre公司}和CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC Cre公司}被周期性酸盐染色的小鼠(PAS公司).C类，染色定量如所示B类(n个=2只动物/组，*，第页< 0.05).D类，胚胎第18.5天心脏组织切片的透射电镜照片CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^Nkx2.5芯(n个=2）和CnB1fl（立方英尺）/+^{Nkx2.5-中心}胚胎(n个=3）。E类，静息产生的力（pCa9，静息力）或饱和Ca²⁺从5周龄婴儿分离的心肌皮肤乳头肌纤维中的水平（pCa4.5，主动力）重量^{αMHC-Cre公司}和CnB1fl/fl（立方英尺/立方英尺）^{αMHC-Cre公司}小鼠（对于每个基因型，n个=19根来自四种不同动物的纤维，*，第页< 0.05).