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生物化学杂志。2010年2月5日；285(6): 3857–3864.
2009年12月2日在线发布。 数字对象标识：10.1074/jbc。M109.072488
预防性维修识别码：项目经理2823528
PMID：19955570

胰岛素与14-3-3的相互作用促进脂肪细胞中脂蛋白-1的细胞质定位*

米克洛斯·佩特菲,‡§ 瑟尔·哈里斯,‖ 藤田直也,**和凯伦·雷厄‡‡‡,1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

脂蛋白-1是一种参与脂质代谢和脂肪生成的双功能蛋白。脂蛋白-1通过其磷酸酯酶活性在三酰甘油的生物合成中发挥作用，并作为参与氧化代谢的基因的转录辅激活物。脂蛋白-1存在于细胞质中，并转移到内质网膜上催化磷酸酯酶反应。它还具有一个核定位信号，这是其转位到细胞核所必需的，因此可能对脂蛋白-1协同激活物功能很重要。因此，亚细胞定位可能是该蛋白调节的一个重要因素。在这里，我们表明仅核定位信号不足以进行脂蛋白-1核定位，并确定脂蛋白-1与14-3-3的相互作用是其亚细胞定位的决定因素。我们证明了脂蛋白-1与14-3-3蛋白相互作用，14-3-3的过表达促进了脂蛋白-1在3T3-L1脂肪细胞中的细胞质定位。14-3-3的作用通过脂质-1中富含丝氨酸的结构域介导。富含丝氨酸结构域中14-3-3相互作用区域的功能定位表明了几个位点之间的冗余性和协作性，包括五个磷酸化丝氨酸和苏氨酸残基。3T3-L1脂肪细胞的胰岛素刺激导致脂质-1磷酸化增加，与14-3-3的相互作用增强，并且主要是细胞质定位。总之，我们的研究表明，胰岛素可能通过与14-3-3蛋白的相互作用来调节脂蛋白-1的亚细胞定位，从而调节其细胞功能。

关键词：发育分化/脂肪细胞、疾病/代谢、疾病/肥胖、脂质/三酰甘油、代谢/脂质生成、细胞核/核转运

引言

肥胖代表脂肪组织、肝脏和其他组织中脂质储存失调的状态。储存的甘油三酯是由甘油和脂肪酸合成的，当它们的吸收或合成超过线粒体或过氧化物酶体中的氧化利用时，这些脂肪酸就会积累起来。因此，调节甘油三酯的生物合成和脂肪酸氧化对于确定脂质的净储存量非常重要。脂蛋白-1在甘油三酯生物合成和脂肪酸氧化中都有作用，并对甘油三酸酯的储存水平产生重大影响。因此，有必要更好地了解其在这些过程中活动的监管。

脂蛋白-1首先被鉴定为脂肪肝营养不良小鼠模型中缺乏的蛋白质(飞行驾驶员)，突变小鼠(1). 脂蛋白-1缺乏小鼠脂肪细胞分化受损，与未能诱导关键脂肪生成转录因子的表达和甘油三酯合成受损相关(2,三). 相反，脂肪组织中脂质-1表达增强会导致脂肪组织质量增加，每个脂肪细胞的甘油三酯储存量增加(4). Han的证明解释了脂蛋白-1对脂肪组织中甘油三酯储存水平的深刻影响等。脂蛋白-1具有磷酸酯酶（PAP）2磷脂转化为二酰甘油所需的活性，二酰甘油是三酰甘油的直接前体(5). 随后的研究表明，脂蛋白-1几乎占脂肪组织中PAP活性的全部，从而解释了在脂蛋白-1缺乏小鼠中观察到的脂肪营养不良(6,7). 大约在同一时间，芬克等。确定脂蛋白-1也在脂肪酸氧化所需基因的转录共激活中起作用(8). 这些发现表明，脂蛋白-1可能是脂肪酸储存或利用命运的重要决定因素，但也提出了许多问题，即脂蛋白-1的两种看似不同的活性是如何调节的。

脂蛋白-1作为甘油三酯生物合成酶和转录共激活物的不同作用的调节机制可能是通过定位到不同的亚细胞隔室。几十年来，人们已经知道PAP活性主要存在于胞质溶胶中，并转移到内质网膜上，与磷脂酸底物结合并催化磷酸酶反应(9,–12). 研究还表明，PAP从胞浆到内质网膜的转运受磷酸化调节(13). 最近的研究证实，脂蛋白-1在胞浆和内质网之间的分布是通过磷酸化控制的。作为对胰岛素的反应，脂蛋白-1在几个位点被磷酸化106发挥重要作用(7). 磷酸化似乎不会改变脂蛋白-1 PAP的特异性活性，而是增加可溶性与微粒体脂蛋白-1的比率。相反，先前已知能增加微粒体PAP活性的药物，如油酸和肾上腺素(14)导致脂质-1磷酸化降低和微粒体定位增加(7). 因此，磷酸化似乎是脂质-1在细胞质和微粒体之间分配的关键机制，因此也是PAP活性的决定因素。

脂蛋白-1蛋白也定位于细胞核，这就增加了一种可能性，即细胞核分隔对于其作为转录共激活物的作用或调节其作为PAP酶的可用性很重要(1). 我们以前的研究表明，两种主要的脂蛋白-1蛋白亚型（均含有假定的核定位信号（NLS））是通过选择性剪接细胞内的一个外显子而产生的L引脚1基因，并在3T3-L1脂肪细胞中表现出差异表达模式和亚细胞定位。诱导脂肪细胞分化2天后，脂蛋白1α（891氨基酸）表达最为显著，随后逐渐减少，而脂蛋白1β（924氨基酸）在成熟脂肪细胞中表达最高(15). 脂蛋白-1α和脂蛋白-1β都定位于胞质溶胶和细胞核，但在不同区室中的比例似乎取决于脂肪细胞分化的同种型和状态。因此，在前脂肪细胞中，70%的脂蛋白-1α是核的，而在分化的脂肪细胞中则增加到90%(15). 相反，脂蛋白-1β在前脂肪细胞的胞浆和细胞核中分布均匀，但在成熟脂肪细胞中主要分布在胞浆（80%）中。与对脂肪细胞的研究一致，脂质-1α和-1β在大鼠肝癌细胞中的定位也分别主要发生在细胞核和细胞质中(16). 假设的核定位信号在两种脂质-1亚型上都存在，但定位并不局限于核，这一观察表明，其他决定因素在脂质的核-细胞质分布中起作用。事实上，最近发现sumoylation是一种调节神经细胞中脂质-1核定位的翻译后机制(17). 脂蛋白-1酰化在其他组织中的作用尚不清楚，可能还有其他机制也会影响脂蛋白-1的亚细胞定位。

在这里，我们证明脂肪细胞中脂蛋白-1的核质定位是由胰岛素通过与14-3-3蛋白的相互作用调节的。14-3-3蛋白在哺乳动物中由至少七种亚型组成，它们与不同的靶蛋白结合，通常位于磷丝氨酸残基（参考文献。18,–20). 靶蛋白与14-3-3的相互作用可能改变靶的构象，进而影响亚细胞定位、酶活性、稳定性、磷酸化状态或与其他蛋白质的相互作用。我们的研究揭示了控制脂蛋白-1亚细胞定位的额外成分，这可能影响该蛋白的PAP和转录共激活物活性。

实验程序

细胞培养、转染和治疗

HEK293T细胞在添加10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle's培养基中增殖。根据制造商的说明，用FuGENE6转染试剂（罗氏应用科学公司）转染细胞。如前所述，培养3T3-L1成纤维细胞并将其分化为脂肪细胞(15). 分化开始五天后，根据制造商的说明（Nucleofector®程序a-33，Nucleofeter®溶液L），使用Nucleofector®设备（Amaxa Biosystems）通过电穿孔转染3T3-L1脂肪细胞。将电泳细胞置于胶原蛋白涂层的玻璃底细胞培养皿（MatTek公司）中进行共聚焦荧光显微镜分析。为了评估胰岛素信号对脂蛋白-1亚细胞定位的影响，将与脂蛋白-1α和14-3-3θ共电穿孔的脂肪细胞置于Krebs-Ringer Hepes缓冲液中（120 m）米氯化钠，5.4米米KCl，1米米氯化钙2，0.8米米氯化镁2，20米米HEPES，pH 7.4）补充5.5 m米 d日-葡萄糖和1%胎牛血清。电镀后一天，用100n或100n刺激细胞米单用胰岛素1h或100n米100n存在下的胰岛素米雷帕霉素1h，然后用100n预孵育1h米雷帕霉素。

质粒构建与突变

小鼠脂蛋白-1α、人14-3-3（β和θ亚型）和14-3-3θ（R56A/R60A）表达的cDNA构建已在前面描述过(15,21,22). GST-14-3-3β和GST-143-3β（K49E）载体是罗切斯特大学医学院Bradford Berk博士赠送的(23). 使用QuikChange定点突变试剂盒（Stratagene）产生Lipin-1α突变。可根据要求提供用于诱变的引物序列。

GST-14-3-3下拉

将转染脂质-1α-V5的HEK293T细胞收集在裂解缓冲液中（50 m）米Tris，pH 7.5，150 m米NaCl、0.5%Nonide P-40、蛋白酶（Complete Mini，Roche Applied Science）和磷酸酶（Sigma）抑制剂鸡尾酒），并在14000×克在4°C下孵育10分钟。将含有500μg蛋白质的细胞裂解物与10μg GST或GST-14-3-与谷胱甘肽Sepharose结合在一起，在4°C下孵育2小时。用裂解缓冲液洗涤珠子三次，用磷酸盐缓冲盐水洗涤珠子一次。用煮沸的SDS负载缓冲液洗脱结合蛋白，并如前所述通过Western blotting进行分析(15). 将10cm的3T3-L1细胞培养板分化9-14天，然后如前所述将其缺血2小时(24)，然后用雷帕霉素孵育30分钟（20 n米)或沃特曼（100 n米)如图所示，然后用胰岛素（10毫克/毫升）孵育15分钟。如前所述，将脂肪细胞均质化(7)1 ml缓冲液A（50 m米氟化钠，1米米EDTA，1米米EGTA，10米米磷酸钠和50 m米β-甘油磷酸，pH 7.4）补充1 m米苯甲基磺酰氟、10μg/ml亮氨酸蛋白酶、10μ/ml抑肽酶、10μg/ml胃蛋白酶抑制素、0.25μ米微囊藻毒素和0.1%Nonidet P-40。将GST-FKBP12（2μg）或GST-14-3-3β（2μC）与12μl GSH-Sepharose珠在1 ml缓冲液A中孵育60 min，然后在1 ml的缓冲液A内洗涤。将3T3-L1细胞的裂解液（750μl）添加到珠中，并在4°C下孵育2 h，并不断混合。用缓冲液A洗涤珠子四次，并在SDS加载缓冲液中煮沸洗脱。

免疫沉淀、磷酸化分析和Western印迹

在免疫沉淀实验中，细胞裂解物与与兔抗14-3-3抗体（sc-629，Santa Cruz Biotechnology）或非特异性兔IgG结合的琼脂糖珠在4°C下培养过夜。按照上述方法清洗和洗脱珠子。为了分析脂质磷酸化，将细胞裂解物与2μg抗V5抗体（Invitrogen）孵育3 h，然后在4°C下与蛋白A/g PLUS琼脂糖（sc-2003）结合2 h。在用裂解缓冲液进行三次洗涤后，用磷酸酶缓冲液再次洗涤琼脂糖颗粒，并在相同的缓冲液中重新悬浮。样品在30℃下与200单位的Lambda蛋白磷酸酶（新英格兰生物实验室）孵育30分钟，然后用加载缓冲液洗脱，并使用磷酸-14-3-3结合基序特异性抗体进行Western blot分析（1:2000稀释，#9601，细胞信号技术）。脂蛋白-1抗体（LAb1）先前已有描述(25)，GST抗体来自Santa Cruz Biotechnology（sc-459），而磷酸-S6K1（T389）来自Cell Signaling Technology（#9205）。

亚细胞定位的定量分析

共焦免疫荧光显微镜和脂蛋白-1亚细胞定位的定量以前已经有过描述(15). 简单地说，根据转染细胞的染色模式，将其分为三种亚细胞定位类别之一。定位被认为是细胞质（CYTO）或核（NUC），当荧光信号主要在一个或另一个隔室中观察到时，而在两个隔室都有显著染色的细胞被分配到“混合”（CYTO+NUC）类别。典型的染色模式如所示图1A类.

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脂质-1α的亚细胞定位和核定位信号。 A类，野生型脂蛋白-1α在转染3T3-L1脂肪细胞中的共聚焦免疫定位。以细胞核为主的细胞的代表性图像(努克)，细胞质(CYTO公司)或同时存在细胞质和细胞核(CYTO公司+努克)显示了脂蛋白-1染色。B类，野生型脂蛋白-1的结构域示意图和缺乏假定NLS的ΔNLS突变体(黑匣子和氨基酸序列）。N端和C端进化保守区(NLIP公司和削减）。C类定量评估3T3-L1脂肪细胞中脂蛋白-1α和ΔNLS突变体的亚细胞定位。显示脂质-1α分布模式的细胞比例如图所示A类如图所示。

3T3-L1脂肪细胞胞浆和核组分的制备

3T3-L1脂肪细胞被血清饥饿30分钟，然后用雷帕霉素处理（25 n）米)30分钟，然后在雷帕霉素存在下使用1毫克/毫升胰岛素30分钟。用冰镇磷酸盐缓冲盐水缓冲液冲洗细胞两次，并在低渗缓冲液（10米）中在4°C下培养5分钟米三氯化氢，pH 7.6，10 m米氯化钠，3米米氯化镁20.5%Nonide P-40和蛋白酶抑制剂）。从培养皿中刮取细胞并在130×克5分钟。将上清液用作细胞溶质部分，并将颗粒重新悬浮在核提取缓冲液（0.4米氯化钠，5米米HEPES，pH 7.9，26%甘油，1.5米米氯化镁2，0.2米米乙二胺四乙酸（EDTA），0.5米米二硫苏糖醇和蛋白酶抑制剂），并在4°C下培养30分钟，然后在30000×克持续20分钟。将上清液用作核组分进行Western blot分析。

结果

脂蛋白-1的NLS是必要的，但不足以实现核定位

我们之前已经证明，脂蛋白-1在脂肪细胞中以两种交替剪接的同种型表达：脂蛋白-1α和-1β(15). 脂蛋白-1β含有一个在脂蛋白-1α中未发现的33-氨基酸插入物，主要赋予蛋白质细胞质定位。虽然较短的亚型lipin-1α比lipin-1β表现出更多的核存在，但其在转染的3T3-L1脂肪细胞中的亚细胞分布是不均匀的(图1A类). 尽管约20%的转染细胞仅在细胞核中含有脂蛋白-1α(努克在里面图1C类)在50%以上的细胞中，lipin-1α在细胞质和细胞核中的含量相似(CYTO公司+努克在里面图1). 删除假定NLS（KKRRKRRRK）(1)从细胞核中完全排除了脂蛋白-1α，证实了其对蛋白质核转位（Δ荷兰统计局在里面图1C类). 然而，我们的证明表明，脂蛋白-1α有时定位于细胞质，这表明NLS不足以实现脂蛋白-1的核定位，并且可能涉及其他分子机制来调节其核质分布。

脂蛋白-1α与14-3-3的相互作用

14-3-3蛋白通常通过与磷酸丝氨酸残基的相互作用来调节广泛蛋白质的亚细胞定位。脂蛋白-1在酵母和哺乳动物细胞中都是一种高度磷酸化的蛋白质(7,25,27,28)我们探索了与14-3-3的相互作用可能是导致脂质-1α细胞质积累的原因。确定14-3-3是否与脂质-1α结合在体外，我们使用谷胱甘肽-脑苷结合纯化GST-14-3-3融合蛋白进行GST下拉分析。用脂质-1α-V5转染的HEK293细胞的细胞裂解液培养，然后进行Western blot分析，结果表明脂质-1α与GST-14-3-3相关，但与GST无关(图2A类). 此外，没有观察到与GST-14-3-3（K49E）的结合，GST-14-3-3是一种14-3-3的突变形式，不能与配体相互作用(29). 这一结果表明，与其他配体的相互作用类似，14-3-3通过其两亲性配体结合沟与脂质-1α结合。

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脂蛋白-1与14-3-3相互作用。 A类GST下拉实验。从转染了脂质-1α-V5的HEK293细胞制备细胞裂解物，并与GST单独、野生型或突变型（K49E）GST-14-3-3β融合蛋白孵育至谷胱甘肽-糖。用抗V5抗体通过Western blotting分析洗脱物(顶部面板)或考马斯染色(底部面板).B类，转染野生型脂质-1α-V5的联合免疫沉淀(顶部面板)或ΔNLS(底部面板)来自HEK293细胞的内源性14-3-3。

为了确定内源性14-3-3蛋白是否与HEK293细胞中的脂质-1α相互作用，我们进行了联合免疫沉淀实验(图2B类). 在14-3-3的免疫沉淀物中很容易检测到脂蛋白-1α，但没有控制IgG，这证实了这两种蛋白之间的相互作用(图2B类,上部面板).

14-3-3蛋白通过抑制转位到细胞核或增强从细胞核的输出来促进配体的细胞质定位，这取决于相互作用发生在细胞质还是细胞核中(30). 为了研究脂蛋白-1α/14-3-3相互作用的细胞位置，我们利用了ΔNLS脂蛋白1α突变体，该突变体被排除在细胞核之外(图1C类). NLS的缺失对14-3-3-结合没有影响，表明相互作用可以发生在细胞质中(图2B类,下部面板).

14-3-3促进脂蛋白-1α的细胞质定位

为了评估脂质-1α-14-3-3相互作用的功能后果，我们研究了14-3-3表达对脂质-1α亚细胞定位的影响。14-3-3在HEK293细胞中的过度表达导致脂质-1α的细胞分布从细胞核向细胞质发生重大变化(图3A类). 在3T3-L1脂肪细胞中也获得了类似的结果，这是一种与脂蛋白-1α的生理功能高度相关的细胞类型(图3B类). 我们测试了脂肪细胞中表达的两种主要14-3-3亚型，β和θ(31,32). 这两种亚型的表达增强了细胞质定位，并减少了细胞核中含有脂质-1α的细胞比例。R56A/R60A双突变消除14-3-3θ的配体结合活性(33)消除了其在细胞质中保留脂质-1α的能力(图3B类). 实际上，14-3-3θ的表达式R56A/R60A型导致核脂蛋白-1α显著增加，可能是由于内源性14-3-3蛋白通过异二聚体失活而产生的显性负效应。总之，我们的数据表明，与14-3-3蛋白的相互作用导致脂质-1α的细胞质滞留。

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14-3-3影响脂质-1α的核质定位。 A类共聚焦免疫荧光显微镜定量脂蛋白-1α的亚细胞定位。用脂蛋白-1α-V5和空（−）或14-3-3表达载体（+）联合转染HEK293细胞。B类，脂质-1α在3T3-L1脂肪细胞中的亚细胞定位，分析如下面板A野生型14-3-3β和14-3-3θ亚型，或带有R56A/R60A的14-3-3α突变体(A类56/60)双突变，与lipin-1α-V5共转染。*和+表示具有统计显著性(第页<0.05）分别与无或野生型14-3-3转染相比存在差异。

脂蛋白-1α中富含丝氨酸的结构域介导其与14-3-3的功能相互作用

14-3-3蛋白与具有识别基序的靶蛋白结合，识别基序由磷酸丝氨酸和脯氨酸组成（pSX（X）P）(34). 因为lipin-1α包含几个这样的基序(图4A类)，我们使用一种特异识别磷酸化14-3-3结合基序（αP-14-3-3）的抗体来研究它们的磷酸化状态。免疫沉淀的脂蛋白-1α与αP-14-3-3抗体表现出很强的反应性(图4B类). 通过用磷酸酶预处理脂蛋白-1α，这种反应性被完全消除，表明存在一个或多个磷酸化14-3-3结合基序。为了定位脂蛋白-1α中的14-3-3基序，我们将重点放在丝氨酸残基高度富集（37%）的区域（氨基酸218-260）。这个富含丝氨酸的结构域（SRD）包含脂蛋白-1α中6个候选14-3-3基序中的3个，包括丝氨酸248，之前显示为磷酸化的残留物(7). 删除SRD（ΔSRD）完全消除了αP-14-3-3与脂蛋白-1α的反应性(图4C类). 这表明抗体识别的一个或多个14-3-3结合基序位于SRD内。

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脂蛋白-1 SRD中的14-3-3相互作用基序。 A类，脂蛋白-1的示意图，显示富含丝氨酸的结构域(SRD公司).针头指出一致14-3-3相互作用基序的位置（S-X（X）-P） ●●●●。各Ser残基的氨基酸位置为228、245、248、286、294和569。这个实心针头对于Ser248表明已知该残基在脂肪细胞中磷酸化(7). 核定位信号表示为黑色条。B类，lipin-1含有磷酸化的14-3-3相互作用基序。对转染HEK293细胞的脂质-1α-V5免疫沉淀物进行λ-磷酸酶处理或不处理，并使用识别14-3-3相互作用基序的磷酸化特异性抗体进行Western blotting检测(顶部面板)或抗V5(底板).C类磷酸化14-3-3相互作用基序位于SRD中。用缺乏SRD的野生型或突变型脂蛋白-1α转染HEK293细胞，并按面板B.

接下来，我们研究了SRD是否在3T3-L1脂肪细胞中脂质-1α的亚细胞定位中起作用。与野生型蛋白相比，ΔSRD突变体的核定位显著增加(图5B类)证明SRD在脂质-1α细胞质滞留中的作用。重要的是，与野生型脂蛋白-1α相比，ΔSRD突变体对14-3-3的过度表达没有反应，这表明SRD介导脂蛋白1α和14-3-3之间的功能相互作用。

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脂蛋白-1核质定位和14-3-3相互作用的结构决定因素。 A类，突变体lipin-1α构建物用于实验面板B灰色框和线分别表示不同突变体中存在或删除的序列。这个图表上述野生型脂质-1显示ΔSRD突变，其中整个SRD已被删除。上半年至下半年和第1季度至第4季度用SRD中的子删除表示构造，以及针头指出14-3-3相互作用基序的位置，如图4A类。Q4突变体用于产生以下已知突变(7)磷酸化残基：Ser248→ 阿拉(A类248)、Thr249→ 阿拉(A类249)，序列号248→ 丙氨酸/苏氨酸249→ 阿拉(AA公司)，序列号252→ 阿拉(A类252)，序列号254→ 阿拉(A类254)和Ser260→ 阿拉(A类260).B类，使用共焦免疫荧光显微镜定量评估转染3T3-L1脂肪细胞中突变脂蛋白-1α蛋白的核质分布。灰色和开放式酒吧表示有或无14-3-3θ的联合转染。*和+表示具有统计显著性(第页<0.05）分别与野生型lipin-1α或联合转染无14-3-3结构相比存在差异。

SRD中的多种结构决定因素介导14-3-3对脂质-1α亚细胞定位的影响

为了确定14-3-3功能相互作用的结构决定因素，我们采用了一种系统方法，即在SRD中生成亚缺失(图5A类)并测试其对3T3-L1脂肪细胞中脂质-1α核质定位的影响(图5B类). 删除SRD的C端或N端的一半(上半年和氢气分别为，英寸图5)导致核定位显著增加。H1和H2的核分布介于野生型和ΔSRD蛋白之间，表明存在多个影响定位的结构决定簇。与这种可能性一致，H1和H2对14-3-3的表达都有反应，细胞质中的脂质-1α比例增加。携带H1或H2缺失的脂蛋白-1α的中间表型表明SRD中至少有两个功能性14-3-3相互作用位点。对四个额外缺失（Q1-Q4）的分析揭示了进一步的复杂性，因为所有突变体都对14-3-3表达保持反应性(图5). 这些结果表明，14-3-3与脂蛋白-1α的相互作用存在结构冗余，并表明在所测试的四个区域中都存在相互作用位点。

为了确定参与14-3-3反应的单个残基，我们将重点放在Q4区域，该区域包含之前在SRD中识别的所有五个磷酸化残基(7). 使用Q4缺失结构作为起始材料，我们将每个磷酸化的丝氨酸和苏氨酸残基分别或组合突变为丙氨酸。这位爵士252→ 阿拉(A类252在里面图5)，序列号254→ 阿拉(A类254)和Ser260→ 阿拉(A类260)突变完全消除了14-3-3的作用，表明所有三个残基都是14-3-3相互作用所必需的，至少在Q4缺失结构的背景下是如此。相反，Ser248→ 阿拉(A类248)和Thr249→ 阿拉(A类249)保留了对14-3-3表达的反应性，尽管这些反应与Q4相比明显减弱。Ser的同时突变248和Thr249(AA公司在里面图5)取消了14-3-3反应。总之，我们的数据揭示了14-3-3和脂质-1α之间的结构复杂的相互作用，涉及SRD内的多个磷酸化和非磷酸化残基。

胰岛素刺激3T3-L1脂肪细胞与14-3-3的相互作用及脂蛋白-1α的细胞质定位

胰岛素触发脂肪组织中多个Ser/Thr残基的脂蛋白-1磷酸化(25). 为了探讨胰岛素刺激的磷酸化对脂蛋白1-14-3-3相互作用的潜在影响，我们使用胰岛素处理的3T3-L1脂肪细胞进行了GST下拉实验。在这些实验中，用一种不能区分脂蛋白-1α和脂蛋白-1β的抗体检测到与GST-14-3-3结合的脂蛋白-1，因此代表总脂蛋白-1。与之前的研究一致，胰岛素以雷帕霉素和沃特曼敏感的方式刺激内源性脂质-1和p70S6K的磷酸化(图6A类). GST-14-3-3从未刺激的3T3-L1裂解物中特异性降低了脂质-1，证实了脂质-1和14-3-3之间的相互作用(车道C,图6B类). 胰岛素刺激以雷帕霉素和沃特曼素依赖的方式增加了与14-3-3相互作用的脂蛋白-1的数量(车道I,R（右）+我、和W公司+我,图6B类).

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胰岛素刺激磷酸化、与14-3-3的相互作用以及脂质-1的细胞质定位。 A类，胰岛素(我，10毫单位/ml）刺激，而雷帕霉素(R（右），20牛顿米)和沃特曼(W公司，100牛顿米)抑制3T3-L1脂肪细胞内源性脂质-1的磷酸化。用抗脂蛋白-1抗体检测脂蛋白-1(顶部面板)和S6K的磷酸化被一种识别Thr的磷酸化特异性抗体证实389(底部面板).B类GST下拉实验。由如上所述处理的3T3-L1脂肪细胞制备的裂解物与GST-14-3-3β或与GSH-Sepharose连接的对照GST-FKBP12融合蛋白孵育。用抗脂蛋白-1进行Western blotting分析洗脱液(顶部面板)或抗GST抗体(底部面板).C类胰岛素的作用(我)和雷帕霉素(R（右）)使用共焦免疫荧光显微镜分析与脂质-1α-V5和14-3-3θ共转染的缺血清3T3-L1脂肪细胞中的治疗。*和+表示具有统计显著性(第页<0.05）与对照组相比的差异(C类)或仅使用胰岛素。D类，3T3-L1脂肪细胞血清饥饿并用胰岛素处理(我)雷帕霉素和胰岛素，或未治疗(C类). 亚细胞分离后，内源性脂质-1定位于细胞溶质(CYTO公司)和核能(努克)用抗脂蛋白-1抗体进行Western blotting分析。

我们目前的结果表明，胰岛素刺激了脂蛋白-1的磷酸化及其与14-3-3的相互作用。此外，我们还表明，与14-3-3的相互作用促进了脂蛋白-1α的细胞质滞留，增加了胰岛素调节脂蛋白-1亚型核质分布的可能性。为了验证这一假设，我们评估了胰岛素治疗对血清缺乏的3T3-L1脂肪细胞中脂蛋白-1α的亚细胞定位的影响。血清饥饿导致细胞质脂质-1α减少约5倍，核脂质-1α随之增加（与对照组相比图6C类有3个B类). 胰岛素一小时治疗显著增加了脂蛋白-1α的细胞质定位，而雷帕霉素预孵育显著降低了这种作用(图6C类). 我们还通过亚细胞分离和免疫印迹分析评估了胰岛素治疗对内源性脂质-1定位的影响。如所示图6D类胰岛素刺激使细胞质中的脂质-1含量增加，细胞核中的脂质含量减少，呈雷帕霉素依赖性。总之，我们的结果表明，胰岛素刺激与14-3-3的相互作用以及脂肪细胞中脂蛋白-1α的细胞质定位。

讨论

脂蛋白-1是一种多功能蛋白，参与细胞脂质稳态和疾病的各个方面(35,36). 通过其磷脂酸磷酸酶活性，lipin-1是TAG和磷脂生物合成中的关键酶(5,–7). 此外，通过与过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α和核激素受体的相互作用，脂蛋白-1在参与脂肪酸代谢的基因的转录调节中发挥作用(8). 与它的多功能性质一致，脂蛋白-1表现出复杂的亚细胞定位，涉及微粒体、细胞溶质和核室。我们之前已经证明，脂蛋白-1磷酸化与3T3-L1脂肪细胞中可溶性与微粒体脂蛋白-1的比率相关(7). 此外，脂蛋白-1的核质定位已被证明受脂肪细胞中选择性剪接的调节(15)神经细胞中的sumoylation(17). 在目前的工作中，我们描述了通过与14-3-3蛋白的相互作用控制脂蛋白-1亚细胞定位的另一种机制。

14-3-3蛋白参与了信号转导、细胞周期、细胞死亡和其他细胞过程中多种蛋白质的核质转运调控(37). 通过GST下拉和联合免疫沉淀实验，我们证明在培养的脂肪细胞中，脂蛋白-1与14-3-3相互作用。这发生在细胞质中，因为ΔNLS突变将脂质-1α从细胞核中排除对相互作用没有影响。14-3-3的过度表达导致HEK293细胞和3T3-L1脂肪细胞中脂质-1α的核耗竭和细胞质积累。综上所述，我们的结果表明，与14-3-3的相互作用促进了脂蛋白-1α的细胞质滞留。

用K49E或R56A/R60A双突变消除14-3-3的配体结合活性，分别中断与脂质-1α的相互作用，并消除脂质-1α在细胞质中的滞留。这些结果表明，一个或多个典型的pSer-Xaa-Pro14-3-3结合基序介导了两个蛋白质之间的相互作用。与此假设一致，我们在脂蛋白-1的SRD中检测到pSer-Xaa-Pro表位。SRD的缺失显著增加了脂蛋白-1α的核定位，并消除了14-3-3的细胞质滞留效应，表明该区域包含介导14-3-3相互作用的结构决定因子。使用SRD中的子缺失来绘制功能性14-3-3相互作用位点的系统方法揭示了意外的复杂性。亚缺失分析表明，至少涉及四个不同的区域（Q1-Q4）。虽然这些区域中的每一个单独都足以介导脂蛋白-1α的细胞质滞留，但定量分析表明14-3-3相互作用具有加性效应。为了进一步剖析14-3-3相互作用的结构决定因素，我们将重点放在与SRD的C端15个氨基酸相对应的一个区域（Q4）上。该区域包含SRD中所有五个已知的磷酸化残基。对这些残基的系统突变分析揭示了结构复杂性的另一个层次。我们的结果表明252，序列号254和Ser260都是14-3-3交互的关键需求，并表明这些站点之间的强大功能合作。相比之下，两位248和Thr249贡献，但14-3-3交互都不需要。然而，Ser的同时突变248/苏尔249完全消除了相互作用，表明这些残基在14-3-3结合中的结构重要性。总之，脂蛋白-1α和14-3-3之间的功能性相互作用是由几个冗余的协同结构决定因素介导的。

除了Ser248，本研究中发现的重要功能残基均未出现在典型pSer-Xaa-Pro 14-3-3结合基序的背景中。已经描述了几种可选的14-3-3相互作用基序，例如Arg-Xaa1–2-pSer Xaa公司2–3-Cbl中的pSer(38)，角蛋白18(39)和蛋白激酶Cμ(40)和GP1bβ中不相关的pSer序列(41)和p53(42). 由于脂蛋白-1中关键pSer残基的序列背景与之前描述的任何基序都不相似，我们的研究提出了14-3-3相互作用的新的结构决定因素。

我们在这项研究中确定的所有五个负责调节脂蛋白-1与14-3-3相互作用的残基，此前已经证明在胰岛素刺激下被磷酸化(7). 因此，我们假设胰岛素可能通过14-3-3调节脂蛋白-1的核质定位。事实上，胰岛素刺激增加了14-3-3与脂质-1的结合，并促进了脂肪细胞中内源性脂质-1的细胞质滞留。这两种作用都被雷帕霉素抑制，这与雷帕霉素对脂质-1磷酸化的敏感性一致(7,25). 酵母脂蛋白同源物Pah1p被Cdc28/Cdk1磷酸化，并被Nem1p和Spo7p组成的复合物去磷酸化(28). 哺乳动物Nem1p对应物Dullard也被证明能去磷酸化脂蛋白-1(43). 然而，介导胰岛素对哺乳动物脂蛋白-1磷酸化和亚细胞定位影响的激酶的身份尚不清楚。因为Thr249其次是脯氨酸残基，该位点是脂肪细胞中表达的胰岛素刺激脯氨酸导向激酶的潜在靶点，如丝裂原活化蛋白激酶(44)雷帕霉素的哺乳动物靶点(45). 此外，Ser252出现在磷酸化基序（Ser-Xaa2-酪蛋白激酶2的Glu），已知其被脂肪细胞中的胰岛素激活(46,–48). 参与14-3-3相互作用的磷酸化位点的明显多样性表明，多种激酶参与调节脂蛋白-1的核质转运。

参与脂质-1分区的机制的复杂性和明显的冗余性表明，在不同的细胞位置，不同的分子功能受到复杂的调控。众所周知，从膜结合形式到可溶性形式的转变调节了脂蛋白-1作为PAP酶的功能，可以合理假设脂蛋白-1的核质分布影响其转录共激活物活性。从这个角度来看，细胞质脂质-1是一个无活性的库，可用于易位到微粒体膜以进行TAG合成，或易位到细胞核以调节基因表达。有趣的是，胰岛素通过减少与微粒体膜的结合来增加细胞质脂质-1库(7)以及防止向细胞核移位（本研究）。可以想象，与14-3-3蛋白的相互作用是这两个过程的统一机制。然而，雷帕霉素不干扰脂蛋白-1细胞质-微粒体易位，而拮抗胰岛素的核质易位效应。这意味着这两个过程中存在不同的信号通路和脂质-1的结构决定因素。

*这项工作得到了国立卫生研究院HL28481（发给M.P.和K.R.）和DK28312（发给T.E.H.）的全部或部分支持。这项工作还得到了美国糖尿病协会23018号拨款（发给M.P.）和西达斯-西奈医学中心（发给M.P）的支持。

2使用的缩写如下：

保时捷亚太地区
磷酸酯酶
消费税
谷胱甘肽S公司-转移酶
CYTO公司
细胞质的
努克
原子能的
荷兰统计局
核定位信号
SRD公司
富含丝氨酸的结构域。

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文章来自生物化学杂志由以下人员提供美国生物化学和分子生物学学会