损伤相关分子模式分子在醋氨酚诱导小鼠肝损伤中的作用

摘要

介绍

药物性肝损伤（DILI）是美国急性肝衰竭的主要原因，约占所有病例的一半(古纳万等。, 2007;奥斯塔波维奇等。, 2002). 此外，DILI是临床开发期间药物终止以及FDA批准的药物退出市场的主要原因，具有重大的医疗和经济后果(卡普洛维茨，2005年;Lee等人，2005年). 由于缺乏筛选方法、这些反应的发生率相对较低以及对潜在机制的了解有限，目前在药物开发的早期阶段检测DILI仍然很困难(Lee，2003年). 因此，必须更好地了解DILI的分子和细胞机制，以确定易感因素并制定成功的治疗和预防DILI策略。

对乙酰氨基酚（APAP）是一种广泛使用的止痛药和退热药，以治疗剂量（1–4克/天）服用时有效且安全(卡普洛维茨，2001年;Rumack，2004年). 然而，在某些情况下，急性或累积过量（10-15克）会导致严重肝损伤，导致肝衰竭(卡普洛维茨，2001年). 美国每年有56000多例急诊室就诊、2600例住院治疗和458例急性肝衰竭死亡病例是由于APAP过量所致(Lee，2004年). 众所周知，过量服用APAP也会导致实验动物肝脏损伤，其特征与患者相似。APAP诱导的小鼠肝毒性模型是研究DILI发病机制最广泛使用的模型。APAP诱导的肝损伤（AILI）是由APAP代谢为活性代谢物N-乙酰基引起的-第页-苯醌亚胺(纳尔逊，1990年;劳奇等。, 1989). 大量证据支持肝谷胱甘肽（GSH）的耗竭和NAPQI与细胞大分子的共价结合导致蛋白质修饰和线粒体功能障碍，ATP耗竭，最终导致大量小叶中心坏死(卡普洛维茨，2004年;李等。, 1996;彭福德等。, 1997).

除了直接的肝细胞功能障碍和死亡外，APAP诱导的肝毒性的发病机制还包括释放各种可能影响个体敏感性的炎症介质。已经证明巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）(布尔迪等。，2002b年)，干扰素（IFN）-γ(石田等。, 2002)和肿瘤坏死因子（TNF）-α(布拉兹卡等。, 1996)导致AILI的严重程度，而白细胞介素（IL）-6(Masubuchi公司等。, 2003)，环氧合酶（COX）-2(雷利等。, 2001)和IL-10(布尔迪等。，2002a年)已经证明，在最初的肝脏损伤后，可以促进分解和再生。最近的研究也报道了各种先天免疫细胞的激活和参与，包括自然杀伤（NK）细胞和带有T细胞受体（NKT）的NK细胞(线路接口单元等。, 2004;马森等。, 2008)，肝巨噬细胞(Ju公司等。, 2002;拉斯金等。, 2001;迈克尔等。, 1999)和中性粒细胞(封面等。, 2006;石田等。, 2006;线路接口单元等。, 2006)在APAP诱导的肝毒性期间。然而，这些细胞在损伤发病机制中的确切作用仍存在争议。重要的是，目前尚不清楚触发肝内这些细胞募集和激活的具体因素。

受损的肝细胞本身可能通过释放各种介质而引发炎症。一种假说提出了损伤相关分子模式（DAMP）分子在这一过程中的关键作用。大量研究表明，凋亡和坏死细胞释放DAMP分子，如高迁移率族蛋白-1（HMGB1）、S-100蛋白、热休克蛋白（HSPs）、透明质酸、表面活性蛋白、干扰素-α、尿酸、纤维连接蛋白、β-防御素和心磷脂，作为组织损伤后免疫反应的内源性刺激物(东盟等。, 2002;比拉金等。, 2002;洛策等。, 2005;日本岗村等。, 2001;派奇等。, 1988;相等。, 2004;施等。, 2003;特默等。, 2002;沃林等。, 2002;王等。, 1999). HMGB1和HSP-70作为促炎介质的功能近年来得到了广泛研究。HMGB1是一种核结合蛋白，可从坏死细胞被动释放或由活化的巨噬细胞分泌(施等。, 2003). HMGB1已被证明同时作为趋化因子和细胞因子发挥作用，从而在炎症的启动中发挥关键作用(洛兹和特蕾西，2005年;王等。, 1999). HSP-70是一种诱导性应激反应蛋白，在细胞应激或坏死死亡期间，可移位至细胞表面或释放至细胞外环境(沃林等。, 2002). 研究表明，细胞外HSP-70可以刺激树突状细胞和巨噬细胞，促进免疫反应和炎症(东盟等。, 2002;希克曼-米勒等。, 2004;Vabulas公司等。, 2002). 然而，受损肝细胞释放HMGB1和HSP-70及其在DILI发病机制中的具体作用尚未研究。

本研究的目的是检测：i）APAP激发后受损肝细胞是否释放DAMP分子HMGB1和HSP-70体内和在体外以及ii）这些分子是否能够触发肝巨噬细胞Kupffer细胞（KC）的激活。我们的结果证明APAP激发的肝细胞确实释放HMGB1和HSP-70。此外，rHSP-70可以激活分离的原代肝非实质细胞（NPC）和纯化的KC，从而产生促炎介质。

实验程序

结果

APAP治疗后的巨噬细胞活化

为了研究APAP治疗是否能激活肝NPC，在APAP激发后1小时从小鼠肝脏中分离出这些细胞。与从盐水处理的对照小鼠中分离的细胞相比，从APAP激发的小鼠获得的肝脏NPC表现出促炎细胞因子的mRNA表达显著增加，包括TNF-α、IL-6和IL-1β(图1). 肝NPC由KC和LSEC组成。为了确定哪种细胞群是这些增加的炎性细胞因子的主要来源，用FACS进一步纯化KC和LSEC。从APAP治疗小鼠获得的KC被观察到与TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA表达水平的增加有关(图2). KC中促炎细胞因子的上调似乎与图2没有《美国全国人民代表大会》中的那样深刻图1这可能是由于TNF-α和IL-1β的背景表达增加所致(图2)可能是由于在FACSorting纯化步骤中KC的轻微活化。这种差异也可能是因为为了在各组中获得足够数量的KC和LSEC，将从3只小鼠中分离的NPC集中在一起图2.

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图1

体内APAP激发后1小时肝脏NPC激活

（A）在治疗后1小时，从用生理盐水或APAP（350 mg/kg）处理的雌性C57Bl/6J小鼠中分离出NPC。提取总RNA，通过RT-PCR分析检测NPC炎症介质的mRNA表达。密度定量（B）肿瘤坏死因子-α，（C）IL-6和（D）鼻咽癌IL-1βmRNA表达，P（P）与从盐处理小鼠中分离的鼻咽癌相比，<0.05。

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图2

体内APAP激发后1小时激活KC

（A）在治疗后1小时，通过FACS从C57Bl/6J雌性小鼠分离的NPC中纯化KC和LSEC，NPC经生理盐水或APAP（350 mg/kg）处理。提取总RNA，通过RT-PCR分析测定KC和LSEC的炎症介质mRNA表达。密度定量（B）肿瘤坏死因子-α，（C）IL-6和（D）KC对IL-1βmRNA的表达*P（P）与从盐处理小鼠中分离的KC相比，<0.05。

我们假设APAP治疗小鼠的KC激活是由受损肝细胞释放的DAMP分子触发的。为了验证这一假设，在生理盐水或APAP激发后6小时从小鼠体内收集肝脏灌流液。

该灌流液用于处理RAW 264.7细胞（巨噬细胞细胞系）3小时，并通过RT-PCR分析测定促炎细胞因子的诱导。数据表明，来自APAP激发小鼠的肝脏灌流液在RAW细胞中诱导了促炎反应，MCP-1和IL-1βmRNA表达水平的显著上调证明了这一点(图3).

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图3

APAP激发小鼠肝脏灌流液对RAW 264.7细胞的激活作用

（A）将RAW细胞置于48周的细胞培养板中，用生理盐水或APAP（350 mg/kg）激发6小时的小鼠肝脏灌流液处理3小时。仅在RPMI培养基中培养的细胞作为对照。提取总RNA，并通过RT-PCR分析测定RAW细胞炎症介质的mRNA表达。密度定量（B）MCP-1和（C）RAW细胞IL-1βmRNA表达，P（P）与RMPI中培养的细胞和用盐处理小鼠肝脏灌流液处理的细胞相比，<0.05。

APAP激发肝细胞HSP-70的释放

为了确定HSP-70是否代表小鼠AILI期间释放的DAMP分子，使用从接受生理盐水或APAP治疗的小鼠获得的肝脏灌流液进行免疫印迹分析。早在APAP激发后1小时，即可观察到肝中HSP-70的释放（数据未显示），24小时后仍可检测到HSP-70（数据未示出）。HSP-70释放到细胞外环境的水平在3-6小时达到峰值(图4)，此时观察到血清丙氨酸转氨酶（ALT）活性分别显著升高3000和5000IU/L（数据未显示）。多种类型的细胞可能负责肝脏内HSP-70的释放。为了研究APAP诱导的坏死肝细胞是否能释放HSP-70，对小鼠肝细胞系（TAMH细胞）进行了处理在体外含有不同浓度的APAP。治疗15小时后，收集培养上清液，测量天冬氨酸转氨酶（AST）水平并检测HSP-70的释放。经10和30mM APAP处理后，从TAMH细胞收集的培养基中AST水平分别为328和556 IU/L（数据未显示），表明发生了细胞应激和/或死亡。与APAP诱导的细胞毒性相关，从用10和30mM APAP处理的细胞收集的上清液中检测到HSP-70的释放(图5). 数据证实，APAP激发后受损肝细胞可释放HSP-70。

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图4

热休克蛋白70在APAP激发小鼠细胞外环境中的释放

用生理盐水或APAP（350 mg/kg）攻击小鼠3小时和6小时，获得肝脏灌流液。（A）肝脏灌流液用抗HSP70抗体（1:3000）和抗白蛋白抗体（1:000）进行免疫印迹，作为负荷控制。（B）通过密度测定法定量HSP-70在细胞外环境中的释放。*，P（P）与生理盐水组相比，<0.05。

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图5

APAP处理的TAMH细胞培养上清液中HSP-70的释放

用APAP（0、1、10或30 mM）处理TAMH细胞15小时。处理后，收集细胞上清液，浓缩并通过脱盐柱去除残留的APAP。（A）HSP-70释放到细胞上清液中的免疫印迹分析。（B）通过密度测定法定量HSP-70释放到细胞上清液中。*，P（P）与0 mM APAP处理的细胞相比，<0.05。

NPC和KC的促炎激活在体外通过rHSP-70

为了确定坏死肝细胞释放的DAMP分子是否有助于促进AILI期间的进一步组织炎症，我们检测了重组HSP-70（rHSP-70）刺激NPC和KC的能力在体外从幼稚的小鼠中分离出肝脏NPC并进行治疗在体外含有低内毒素的rHSP-70（50 ug/mL）。

治疗后24小时，NPC的TNF-α和IL-1β表达水平显著增加(图6). 为了进一步研究KC是否是促炎细胞因子表达增加的来源，F480进一步从鼻咽癌中纯化KC⁺生物素珠选择。在有或无PMB的情况下，用rHSP-70（50 ug/ml）处理KC 24小时。PMB是已知的脂多糖（LPS）中和剂，用于清除rHSP70内的残余LPS污染，以确保刺激作用是由rHSP-70引起的。KC显示TNF-α、MCP-1和IL-1β的表达水平显著增加(图6)用rHSP-70治疗后。此外，PMB似乎没有降低这种刺激作用，证实LPS没有促进KC诱导促炎细胞因子表达。

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图6

rHSP-70治疗后孤立NPC和KC的激活

从幼稚雌性C57Bl/6J小鼠中分离出NPC，在96孔板中培养，并用rHSP-70处理24小时。仅在RPMI培养基中培养的细胞作为对照。提取总RNA，通过RT-PCR分析测定NPC炎症介质的mRNA表达。密度定量（A）TNF-α和（B）鼻咽癌IL-1βmRNA表达，P（P）<0.05，与单独培养基中的细胞相比（C）KC通过F480纯化⁺从幼稚雌性C57Bl/6J小鼠分离的NPC中选择珠子，在96孔板中培养，在有或无PMB的情况下用rHSP-70处理。通过RT-PCR分析测定KC对TNF-α、MCP-1和IL-1βmRNA的表达。

APAP激发肝细胞HMGB1的释放

在APAP诱导的肝毒性过程中，除了HSP-70外，还可能存在其他DAMP分子释放。HMGB1是一种已知的在释放到细胞外环境中时具有佐剂样作用的分子。为了研究HMGB1在AILI后促炎反应中的作用，使用生理盐水或APAP处理的小鼠肝脏灌流液进行免疫印迹分析。与HSP-70类似，在APAP激发后1小时即检测到肝脏释放HMGB1（数据未显示），在3-6小时达到峰值(图7)并持续24小时（数据未显示）。为了进一步检测APAP诱导的坏死肝细胞释放HMGB1，对TAMH细胞进行处理在体外如上所述，用不同浓度的APAP和培养上清进行免疫印迹分析。在用10和30mM APAP处理的TAMH细胞收集的培养基中检测到HMGB1(图8)诱导细胞损伤和AST释放。数据表明，受损的肝细胞在APAP激发下可以释放HMGB1。

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图7

HMGB1在APAP激发小鼠细胞外环境中的释放

用生理盐水或APAP（350 mg/kg）攻击小鼠3小时和6小时，获得肝脏灌流液。（A）肝脏灌流液用抗HMGB1抗体（1:3000）和抗白蛋白抗体（1:000）进行免疫印迹，作为负荷控制。（B）通过密度测定法定量HMGB1在细胞外环境中的释放。*，P（P）与生理盐水组相比<0.05。

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图8

HMGB1在APAP处理的TAMH细胞上清液中的释放

用APAP（0、1、10或30mM）处理TAMH细胞15小时。处理后，收集细胞上清液，浓缩并通过脱盐柱去除残留的APAP。（A）HMGB1释放到细胞上清液中的免疫印迹分析。（B）通过密度测定法定量HMGB1释放到细胞上清液中。*，P（P）与0 mM APAP处理的细胞相比，<0.05。

讨论

APAP过量是美国每年急性肝衰竭的主要原因。⁸虽然肝细胞损伤是由NAPQI的形成引起的，但使用AILI小鼠模型的研究表明炎症反应在肝损伤进展中的作用(布拉兹卡等。, 1995;布拉兹卡等。, 1996;布尔迪等。，2002b年;布尔迪等。，2002a年;石田等。, 2002;拉斯金和拉斯金，2001年;线路接口单元等。, 2004;线路接口单元等。, 2006;Masubuchi公司等。, 2003;迈克尔等。, 1999然而，先天免疫细胞被激活的机制尚不清楚。最近的一份报告显示，从紫外线照射诱导的凋亡肝细胞中分离的DNA可以通过激活Toll样受体（TLR）9刺激LSEC产生IL-1β和IL-18(伊梅达等。, 2009). 然而，APAP激发的肝细胞是否能释放免疫原性DNA或其他DAMP分子尚未被研究。本研究为以下假设提供了证据：APAP过量后的初始肝细胞损伤通过释放DAMP分子（如HSP-70和HMGB1）导致先天性免疫细胞随后激活。

我们的数据表明，APAP攻击小鼠后1小时，肝脏KC被激活，表达TNF-α、IL-6和IL-1β(图2). 虽然不能排除KC可以代谢APAP，从而直接激活这些细胞，但人们普遍认为APAP是由肝细胞代谢的，NAPQI的产生导致细胞功能障碍。受损的肝细胞可能释放DAMP分子，作为免疫刺激危险信号(Matzinger，1994年)激发肝脏内固有免疫细胞的活化。为了支持这一假设，我们的数据显示，用来自APAP激发小鼠的肝脏灌流液治疗后，RAW细胞中IL-1β和MCP-1的表达受到诱导(图3). 这一结果表明，肝脏灌流液中的某些介质可以刺激巨噬细胞活化。我们的数据进一步证明，经APAP治疗的小鼠肝脏中DAMP分子HMGB1和HSP-70被释放到细胞外环境中(图4和​和7），7)以及APAP激发的肝细胞培养上清液中(图5和​和8）。8). APAP激发对肝细胞的损伤在体外和体内分别通过AST和ALT的释放来评估。这些酶的增加与观察到的DAMP分子释放有关。此外，我们发现rHSP-70可以激活原发性肝KC并上调其促炎介质的表达(图6). 总之，这些结果表明DAMP分子在APAP诱导的肝毒性过程中激活KC中发挥作用。由于APAP主要在肝脏内代谢，预计DAMP分子的释放将在肝脏内达到更高的水平，从而对附近的KC产生更大的影响。然而，DAMP分子可能会全身释放，并可能发生非靶向反应。

在本研究中，我们检测了TNF-α、MCP-1和IL-1β的KC表达，作为这些细胞活化的指标。它们也可能表达抗炎细胞因子，因为已经证明KC是促炎和抗炎介质的主要来源，并在AILI期间发挥促毒和保护作用(Ju公司等。, 2002;拉斯金和拉斯金，2001年;迈克尔等。, 1999). 虽然我们的发现揭示了KC激活的机制，但并没有表明KC在AILI发病机制中的确切作用。除了巨噬细胞，其他先天免疫细胞，特别是NK和NKT细胞，大量存在于肝脏中。尽管它们在AILI中的病理作用仍有争议(线路接口单元等。, 2004;马森等。, 2008)NKT细胞被已知的DAMP激活，如儿茶酚胺(Minagawa村等。, 2000)和NAD⁺(川村等。, 2006). 虽然我们的研究表明肝脏KC是DAMP分子的主要靶点，但在最初的组织损伤后，由于DAMP分子释放，肝脏内的其他固有免疫细胞也可能被激活。

一些DAMP分子已被证明在组织损伤后作为免疫反应的内源性刺激物(东盟等。, 2002;比拉金等。, 2002;洛兹和特蕾西，2005年;日本岗村等。, 2001;派奇等。, 1988;Seong和Matzinger，2004年;施等。, 2003;特默等。, 2002;沃林等。, 2002;王等。, 1999). 热休克蛋白是近年来被广泛研究的一类DAMP分子。HSPs最初被认为可能是DAMP分子，因为它们在各种疾病的细胞应激期间上调(曼布拉等。, 2006;萨波日尼科夫等。, 1999). HSP-60、-70和-90出现在细胞表面(马丁等。, 2003;塞里奥尔特等。, 2005;瓦布拉斯等。, 2001;Vabulas公司等。, 2002)并已证明通过Toll样受体（TLR）的参与激活抗原呈递细胞（APC），特别是巨噬细胞和树突状细胞(东盟等。, 2000;陈等。, 1999;Vabulas公司等。, 2001;Vabulas公司等。, 2002). APAP诱导的肝损伤后，全肝匀浆中HSP-70显著增加(韦尔奇等。, 2006). 然而，在APAP诱导的肝毒性期间，HSP-70向细胞外环境的释放尚未得到评估。APAP激发小鼠肝脏灌流液中HSP-70的检测(图4)是第一个在这种病理状态下证明其释放的人。APAP处理TAMH细胞上清液中HSP-70的检测(图5)进一步证实APAP激发的肝细胞是HSP-70的主要来源。此外，rHSP-70能够刺激促炎反应在体外纯化NPC和KC(图6)这与之前关于热休克蛋白激活APC能力的研究一致(陈等。, 1999;马丁等。, 2003). 为了解决HSP-70的免疫刺激能力可能是由LPS污染物引起的担忧，我们选择使用含有极低水平内毒素（<50 EU/mg蛋白质）的rHSP-70蛋白质。这使得细胞治疗期间出现的内毒素总量小于2.5 EU。此外，一些培养物中含有PMB，以去除任何残留的LPS污染。添加PMB并不抑制rHSP-70诱导的肝KC活化(图6)证实KC的促炎反应是由于HSP-70的刺激能力，而不是由于LPS污染。为了进一步证实HSP70对巨噬细胞的作用，我们在市场上可买到的抗HSP70中和抗体的存在下，用APAP肝脏灌流液处理RAW细胞。虽然HSP70中和抗体能够减弱APAP肝脏灌流液的促炎作用，但在用对照IgG处理的样品中也观察到了减少，因此我们的数据不具结论性（数据未显示）。数据表明，肝脏灌流液中的HSP70在促炎细胞因子的诱导中没有起主要作用。很可能HSP70和HMGB1共同有助于RAW细胞的激活，仅消耗HSP70不足以显著减弱肝脏灌流液的刺激作用。

除HSP-70外，HMBG1还代表另一种DAMP分子，除在病理损伤期间外，该分子将保留在细胞内。HMGB1通常与染色质紧密结合，从而促进DNA的卷曲。HMGB1最初被鉴定为DAMP分子，因为它能从坏死细胞中释放，并能进一步刺激单核细胞和树突状细胞中的促炎状态(斯卡菲迪等。, 2002;丛等。, 2005;杨等。, 2007). 我们的数据表明，在APAP攻击小鼠的肝脏灌注液中可以检测到HMGB1(图7)以及APAP处理的TAMH细胞的培养上清液(图8)表明肝细胞是HMGB1释放的关键来源。虽然我们的研究首次证明HMGB1释放到细胞外环境中，但HMGB1在AILI传播中的作用已在两项已发表的研究中得到证实。针对HMGB1的抗体能够减少组织炎症，如APAP诱导的肝毒性后髓过氧化物酶（MPO）/丙氨酸转氨酶（ALT）比率的降低所示(斯卡菲迪等。, 2002). 最近的一篇文章深入探讨了HMGB1诱导炎症的机制(陈等。, 2009). HMGB1是由CD24和Siglec-G的三分子复合物合成的，它们作为HMGB-1促炎功能的负调节剂，同时也是CD24^-/-和Siglec-G^-/-与WT小鼠相比，小鼠对AILI更敏感。服用抗HMGB1中和抗体能够减弱WT和CD24中的AILI^-/-和Siglec-G^-/-老鼠。

总之，本研究首次证明了APAP激发的肝细胞释放DAMP分子HSP-70和HMGB1在体外和体内这些数据也为APAP诱导的肝细胞死亡和肝巨噬细胞活化之间的联系提供了证据。进一步研究确定一个或多个DAMP分子是否负责激活肝固有免疫细胞是值得的。

致谢

使用的非标准缩写

脚注

参考列表