TDP-43的细胞质错定位对神经元有毒，并因家族性肌萎缩侧索硬化相关突变而增强

摘要

介绍

43 kDa的TAR-DNA结合蛋白（TDP-43）是散发性和家族性肌萎缩侧索硬化（ALS）患者以及以泛素阳性内含物为特征的额颞叶变性（FTLD）患者亚类中蛋白质聚集体的主要成分(Arai等人，2006年;Neumann等人，2006年). 大多数FTLD和ALS病例中TDP-43免疫阳性内含物的鉴定表明这些疾病之间存在致病性联系，并促使其重新分类为TDP-43蛋白病。此外，编码TDP-43的基因突变与家族性ALS和FTLD与运动神经元病相关，这进一步证明了该蛋白在疾病发病机制中起着重要作用(Kabashi等人，2008年;Sreedharan等人，2008年;Van Deerlin等人，2008年;Yokoseki等人，2008年;Benajiba等人，2009年).

TDP-43是一种广泛表达的核蛋白，结合DNA和RNA，抑制逆转录病毒复制，参与RNA剪接和核体形成(Ou等人，1995年;Buratti和Baralle，2008年). 在健康细胞中，TDP-43主要局限于细胞核；然而，TDP-43也参与信使RNA的核质穿梭(Ayala等人，2008年;Wang等人，2008)和含有TDP-43的细胞质斑点与RNA颗粒相关(Elvira等人，2006年). 在患有TDP-43蛋白疾病的患者中，如ALS和具有泛素内含物的FTLD，受影响的神经元表现出TDP-43从细胞核到细胞质的显著重新分布，并在细胞核、细胞质或突起中显示出不溶性TDP-43聚集体(Arai等人，2006年;Neumann等人，2006年).

TDP-43重新分布的意义尚不清楚，尽管TDP-43的疾病相关突变数量不断增加，但对其导致神经退行性变的机制知之甚少。以往使用传统方法的研究在建立因果关系方面能力有限，无法确定TDP-43的聚集和重新分布是否是疾病发病或副现象的基本特征。为了进一步表征TDP-43介导的疾病，我们通过在啮齿动物初级皮层神经元中表达荧光标记的TDP-43，建立了TDP-43蛋白病模型。初级培养模型允许对有丝分裂后分化细胞进行详细的遗传和生化操作，并已证明在一些神经退行性疾病的研究中至关重要(Saudou等人，1998年;Jacquier等人，2009年). 在这些研究中，我们使用了一个自动显微镜系统，该系统能够在较长时间内对单个神经元进行纵向可视化。这种方法允许我们定量地将每个神经元的形态学变化与存活联系起来，并预测这些变化的后果(Arrasate和Finkbeiner，2005年). 我们的研究结果表明，突变的TDP-43对神经元有毒，并且TDP-43在细胞质中的错误定位是疾病发病的关键。

材料和方法

质粒。

所有含TDP-43的质粒均由人TDP-43在C端融合到增强型绿色荧光蛋白（EGFP）组成(图1A类). 一个14aa的连接区将TDP-43的C端与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的N端分离开来，并在EGFP的C端添加六个组氨酸残基以促进翻译蛋白的纯化。A315T突变是通过943位腺嘌呤碱基对鸟嘌呤的定点突变产生的。核定位信号（NLS）通过PCR突变，如前所述(Winton等人，2008年)使用以下引物：5′-CAACTATCAAAAGATAACGCAGCAGATGAGAGAGAGACAGAGAGATGC-3′和5′-GCATCTGTCATCCATTGCTGTTATCTTTGGATAGTG-3′。核输出信号（NES）同样被以下引物破坏：5′-GCAGTCTCTTTTGGAGAGGAGGACGGAGGAGAAGGAAAGGATAGCGTTCATATC-3′和5′-GATATGATTCTTCCCCGTCCTCCACAGAGACTC-3′。如前所述，将突变体亨廷顿蛋白、mCherry和EGFP克隆到pGW1-CMV载体中(Arrasate等人，2004年). 所有质粒的序列信息可在http://gind-db.ucsf.edu:8000/cgi-垃圾桶/质粒/main_menu2.cgi。

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图1。

TDP43-EGFP在初级皮质神经元中表达时定位于细胞核。A类，TDP43-EGFP示意图，显示了RNA再认知基序（RRM）1和2以及富含甘氨酸的结构域（GRD）。EGFP融合到蛋白质的C末端。红线表示A315T突变的大致位置。B–G，表达TDP43（WT）-EGFP的神经元(B–D类)或TDP43（A315T）-EGFP(E–G公司)用荧光显微镜观察蛋白质的核定位。B类,电子，EGFP荧光。C类,F类，mCherry荧光。天,G公司，将EGFP荧光为绿色、mCherry荧光为红色、重叠为黄色的图像合并。比例尺，10μm。

细胞培养和转染。

从胚胎d 20–21幼崽中分离出大鼠皮层神经元，在0.6×10培养基中培养⁶细胞/ml，持续6天在体外，并如前所述用磷酸钙转染(Saudou等人，1998年)（具体协议信息可在http://www.gladstone.ucsf.edu/gladstone/site/finkbeiner/section/1193). 为了进行存活分析，24孔板中的神经元以1:1摩尔比（每孔1μg DNA）与含TDP-43质粒和pGW1-mCherry共转染，并在无血清培养基中培养，以进行剩余的分析。共焦荧光显微镜下，用选定的质粒转染神经元，24小时后观察。为了评估包涵体（IBs）的耐清洁性，用1%多聚甲醛在37°C的PBS中固定20分钟，在PBS中漂洗两次，并用5%Triton X-100和5%SDS在37℃处理20分钟。然后在PBS中再冲洗两次神经元，并通过荧光显微镜成像(Kazantsev等人，1999年).

免疫细胞化学。

分离大鼠皮层神经元，并将其置于涂有层粘连蛋白和聚乳酸的12 mm玻璃盖玻片上-d日-赖氨酸。第6天在体外，神经元转染含有TDP-43的质粒，如上所述。如前所述进行免疫细胞化学(Saudou等人，1998年)用兔抗TDP-43多克隆抗体（Proteintech；1:1000）或抗myc（Santa Cruz Biotechnology；1:2500）作为第一抗体和抗兔Cy3标记的第二抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories；1:200）。核染色是通过用稀释至最终浓度10μ的Hoechst染料短暂培养固定和渗透细胞来完成的米在PBS中。

亚细胞分离。

为了进行分馏实验，HEK293细胞被镀到15厘米的培养皿上，并在24小时后转染在体外.用冰镇盐水冲洗细胞一次，并在5 ml冷冻缓冲液1（含，m米：15 Tris-HCl，pH 7.5，60 KCl，15 NaCl，5 MgCl₂₀，1氯化钙₂，2钠_三VO（旁白）₄, 0.25米蔗糖，1个PMSF；1 DTT）。在冰上培养5分钟后，向溶液中添加等量的缓冲液1（含0.6%NP-40），并将样品在冰上再培养5分钟，偶尔搅拌。然后以1000×克在4°C下保持10分钟。取下上清液，作为细胞溶质部分。将颗粒轻轻地重新悬浮在缓冲液1中，并像以前一样离心。除去上清液，并将沉淀重悬于缓冲液2中（含有，单位：m米：10 HEPES，pH 7.9，10 KCl，1.5 MgCl₂，0.1 EGTA，0.4 NaCl，5%甘油，0.1 DTT，0.5 PMSF），使用20G针头和注射器研磨。悬浮液在冰上培养30分钟，偶尔混合。最后离心后，上清液被移除并保存为核部分。使用SDS-PAGE从每个样品中分离出相当于5μg的蛋白质。用TDP-43（来自Proteintech的兔抗TDP-43多克隆抗体，1:1000）、组蛋白H1（来自Abcam的小鼠抗组蛋白H1.0单克隆抗体，1:000）和α-微管蛋白（来自Sigma的小鼠B512抗α-微管蛋白单抗，1:2000）特异性抗体通过Western blotting检测蛋白质在含有0.1%吐温20的Tris缓冲盐水中稀释5%脱脂干乳，并在4°C下培养过夜。使用HRP-结合的抗鼠或抗兔IgG抗体在室温下进行二级抗体孵育30分钟，将其稀释在1:2000的5%脱脂干乳中，在含有0.1%吐温20的Tris缓冲盐水中。然后用ECL系统（Pierce）观察蛋白质。

尽管我们采取了具体措施来准确分离细胞核和细胞溶质部分，但我们发现生物化学分馏的初始步骤可能会破坏一些体外靶向蛋白质的细胞梯度。在这种情况下，免疫细胞化学分析已被证明是活细胞定位的更准确指标。

机器人显微镜。

为了进行神经元存活分析，我们使用了一个机器人成像系统，描述如下Arrasate和Finkbeiner（2005）简单地说，图像是通过配备20×物镜（数字孔径0.45）和哈马松Orca II 12/14位数字冷却电荷耦合器件的倒置尼康显微镜（TE300 Quantum）获得的。照明由带液体光导管的氙灯（300 W）提供，以最大化信噪比。舞台的所有运动都由步进电机控制。荧光激发和发射滤光片、舞台运动、调焦和图像采集的协调是通过定制设计和商用程序完成的。

图像分析和统计比较。

使用MetaMorph和MatLab和Visual C软件编写的原始程序分析数字化图像。如前所述，通过测定与蛋白质融合的标记物的荧光强度来估计蛋白质表达水平(Arrasate等人，2004年). 通过mCherry荧光鉴定转染神经元的细胞体，并通过测量特定感兴趣区域的荧光强度来确定一个或多个细胞隔室中TDP-43依赖性荧光。在进一步数据分析之前，减去了相邻感兴趣区域的背景荧光。

在生存分析中，神经元死亡是由细胞膜破裂、气泡或mCherry荧光丧失决定的。使用StatView软件生成Kaplan-Meier和累积死亡风险曲线，并使用log-rank检验确定神经元队列之间差异的统计显著性。Cox比例风险分析用于评估表达水平、IB形成和蛋白定位对死亡风险的影响。两组间连续变量（如表达水平）的差异用未配对的t吨测试。对于涉及两个以上组的非参数比较，显著性通过log-rank检验确定；为了进行参数比较，使用了Tukey的多重比较检验。使用GraphPad或Statview软件生成统计比较和绘图。

结果

体外试验TDP-43蛋白病模型

为了建立TDP-43介导的神经退行性变模型，我们用编码EGFP标记野生型（WT）TDP-43或TDP-43的构建物转染大鼠初级皮层神经元，这些构建物带有与家族性ALS相关的突变（A315T）(Kabashi等人，2008年)(图1A类). ALS的病理特征是脊髓和运动皮层的运动神经元变性(加藤，2008)额叶和颞叶皮质萎缩导致FTLDu(Graff-Radford和Woodruff，2007年). 因此，我们选择初级皮层神经元作为评估突变TDP-43诱导神经退行性变能力的系统。

类似于内源性TDP-43蛋白，WT(图1B–D类)和突变型TDP43-EGFP(图1E–G公司)主要局限于核。然而，在一些细胞中，TDP43-EGFP分布在细胞质和细胞核中(图2A–C). 转染后24小时，TDP-43免疫反应蛋白聚集，这是FTLD和ALS神经变性的特征(Arai等人，2006年;Neumann等人，2006年)在10–15%表达WT或突变TDP43-EGFP的神经元中检测到(图2D–F型). 我们注意到，在与TDP43-EGFP和表位标记的泛素共同转染的细胞中，泛素和聚集的TDP43-EGFP共定位，这表明这些沉积物在培养的神经元中是泛素化的。突变TDP43-EGFP聚集体中的EGFP荧光对洗涤剂处理具有抵抗力，与密集堆积结构（如IB）一致(Arrasate等人，2004年)，但WT TDP43-EGFP聚集体的荧光被破坏(图2G–J型). 因此，突变型TDP43-EGFP形成ALS和FTLD典型的泛素化和耐洗涤剂IB(Arai等人，2006年;Neumann等人，2006年).

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图2。

初级皮质神经元中TDP43-EGFP的表达概括了TDP43蛋白病的关键特征。A–C在部分表达WT或突变TDP43-EGFP的神经元中发现弥漫性胞质TDP43-EGFP（箭头所示）。D–F型，在转染WT或突变TDP43-EGFP的小部分神经元中观察到聚集物（箭头所示）。G–J型，耐洗涤剂试验。显示聚集物的细胞被固定，并在之前使用荧光显微镜成像(G公司,我)以及之后(小时,J型)洗涤剂处理。TDP43（WT）-EGFP聚集体的EGFP荧光(G公司,小时)被洗涤剂处理破坏；TDP43（A315T）-EGFP骨料的荧光(我,J型)有抵抗力。A类,天,G–J型，EGFP荧光。B类,电子，TDP-43免疫荧光。C类,F类合并图像，Hoechst核染色为蓝色，EGFP荧光为绿色，TDP-43免疫荧光为红色，重叠为黄色。神经元A–C和G公司和小时转染TDP43（WT）-EGFP；中的单元格D–F型,我、和J型用TDP43（A315T）-EGFP转染。比例尺：A类（用于A–F),G公司（用于G–J型)，10微米。

神经缺失是TDP-43蛋白病区域特异性脑萎缩的基础，与临床症状直接相关(Kwong等人，2007年). 为了确定WT或突变TDP43-EGFP的表达是否影响神经元存活，我们在第6天共转染初级皮层神经元在体外使用TDP43-EGFP构建物和mCherry，一种荧光蛋白，作为生存标志物。通过自动荧光显微镜定期监测转染的细胞10天(Arrasate和Finkbeiner，2005年). 该系统允许我们在较长时间内分析和跟踪大量活神经元，并将每个间隔的观察结果与预先指定的结果（在本例中为细胞死亡）进行定量关联。神经元死亡以形态学改变（细胞碎裂、气泡或圆形）和mCherry荧光丧失为标志(图3A类)与细胞死亡的传统测量方法密切相关，包括膜联蛋白V染色和细胞膜完整性丧失(Arrasate等人，2004年). 对照神经元单独用mCherry和EGFP共转染，或EGFP融合到神经毒性蛋白（亨廷顿蛋白的外显子1含有97个连续的谷氨酰胺，命名为Htt（97Q）-EGFP）。

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图3。

TDP43-EGFP在初级皮层神经元中表达时具有毒性，但不是WT突变型。A类，一个典型的神经元转染TDP43-EGFP和mCherry，然后每隔12–24小时进行一次自动显微镜检查，直到在186小时的比例尺（10μm）下观察到神经元死亡。B类Kaplan-Meier生存分析用于为每个转染神经元群体创建死亡功能的累积风险。在这些图中年-axis表示细胞死亡累积风险随时间变化的定量测量*第页<0.0001（对数库测试）。NS，不显著(第页>0.05（通过对数-秩检验）。累计死亡风险，显示在年-轴，表示队列中的细胞在每个实验的时间间隔内死亡的概率。累积死亡风险曲线由五个单独的实验汇编而成，包括639个神经元单独表达EGFP，665个神经元表达Htt（97Q）-EGFP，998个神经元表达TDP43（WT）-EGFP，1106个神经元表达TDP43（A315T）-EGFP-。

测量大量神经元个体生命周期的能力允许使用生存分析和相关强大的统计方法来研究影响细胞命运的因素。使用非参数Kaplan-Meier分析，我们为每个神经元群体生成了生存函数，并绘制了描述累积死亡风险的风险曲线(图3B类). 然后使用考克斯比例风险分析生成风险比（HR），表示对每个神经元队列的相对死亡风险的估计。培养的神经元寿命有限在体外因此显示出非零的基线死亡风险。仅在这些细胞中表达EGFP不会增加高于基线水平的死亡风险(Arrasate和Finkbeiner，2005年). 正如预期的那样，表达Htt（97Q）-EGFP的神经元的死亡风险显著高于仅表达EGFP的神经元（HR 1.473，第页< 0.0001) (图3B类)但在转染WT TDP43-EGFP的神经元中没有。在表达TDP43（A315T）-EGFP的细胞中，细胞死亡率也显著增加（HR 1.225，第页< 0.0001) (图3B类)表明A315T突变对转染神经元产生毒性。为了确定这种毒性作用是否是A315T突变所特有的，我们额外生成了两个携带与ALS发展相关的点突变（N390S和G290A）的TDP43-EGFP结构(Kabashi等人，2008年;Van Deerlin等人，2008年). 当在大鼠皮层神经元中表达时，TDP43（N390S）-EGFP和TDP43(第页两者均<0.0001；补充图1，网址为网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。因此，TDP-43的三个单独突变都与ALS的发生有关，对大鼠皮层神经元造成了严重的毒性。

尽管系统简单，但初级皮层神经元中TDP43-EGFP的表达概括了TDP-43蛋白病的几个基本特征，包括蛋白质的核定位、泛素免疫阳性、洗涤剂不溶性IBs的形成以及与TDP-43致病突变相关的神经元毒性。我们的结论是，该模型是研究突变TDP-43诱导神经退行性变机制的有用工具。

细胞质TDP-43预测神经元死亡

接下来，我们使用自动荧光显微镜关注与ALS（A315T）相关的TDP-43突变之一，并研究该突变导致细胞死亡的机制。追踪单个神经元随时间变化的能力以及将这些事件的时间序列与细胞存活联系起来的能力，使我们能够确定每个变量与细胞命运的关系。我们主要关注分子变化，例如聚集形成和蛋白质重新分布，这可能是TDP-43中A315T突变的毒性原因。

对转基因神经元的几个变量进行评分，包括荧光强度、IB形成和TDP43-EGFP（核或细胞质）的亚细胞定位。由于活神经元中EGFP的荧光强度与融合蛋白的水平直接相关(Arrasate和Finkbeiner，2005年)，我们使用每个神经元的归一化荧光强度作为TDP43-EGFP表达水平的测量。

为了研究IB形成在TDP43介导的疾病中的作用，我们比较了形成IB的神经元和未形成IB神经元的存活率。因为我们对IB的形成本身感兴趣，所以我们前瞻性地追踪TDP43-EGFP弥漫的神经元，以确定那些随后形成IB的神经元。为了避免对存活时间较短的神经元产生选择偏见，我们只包括转染后24小时存活的神经元。如果IB的形成是有毒的，那么24小时后形成IB的细胞应该有更高的死亡风险，如果IB是一种应对机制，那么死亡风险更低。或者，如果IB的形成与细胞存活无关，那么两种人群的死亡风险应该相似。

以前，我们报道过聚集蛋白的表达水平是IB形成的重要预测因子(Arrasate等人，2004年). 事实上，转染WT或突变TDP43-EGFP的神经元的表达水平显著正向影响IB的形成(图4A类). 此外，表达水平预测了IB形成的时间，因此表达水平最高的神经元在转染后24小时内形成IB。

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图4。

IB的形成与表达WT和突变TDP43-EGFP的神经元的细胞存活无关。A类与转染前或转染后>24h形成IBs的神经元相比，弥漫性TDP43-EGFP的神经元表达水平较低。B类,C类、IB神经元群(n个=52）和具有弥漫TDP43-EGFP的(n个=201）显示类似的表达式级别(B类)通过Kaplan-Meier生存分析进行分析，并绘制出描述死亡累积风险的曲线(C类)为每个群体绘制。天、IBs神经元和弥漫TDP43-EGFP表达WT神经元的累积死亡风险曲线(n个=149）或突变TDP43-EGFP(n个= 104). 表达WT或突变TDP43-EGFP的IBs阳性和阴性神经元的死亡风险没有显著差异*第页< 0.01; **第页<0.001；NS，不显著(第页>0.05）。第页这些值是通过Tukey的多重比较试验确定的(A类,B类)和对数库测试(C类,天). 结果表示来自三个独立实验的组合数据。

为了控制表达水平对IB形成和细胞存活的影响，我们分析了转染后24小时具有同等表达水平的神经元队列。表达WT和突变TDP43-EGFP的神经元的归一化表达水平相似，无论是否存在IBs(图4B类). 对于给定的表达水平，表达TDP43（A315T）-EGFP的神经元比表达TDP42（WT）-EGFP的神经元更容易形成IBs（21%比10%，第页<0.015，χ²测试）。然而，这些队列的Kaplan-Meier和Cox比例风险分析未能证明IB形成对细胞存活的影响(图4C类,天,表1). 这些结果表明，突变TDP43-EGFP毒性不需要IB的形成，并且表明该蛋白的扩散或可溶性形式具有独立于IB形成的神经毒性作用。

表1。

细胞表型变量对神经元存活影响的Cox比例风险分析

变量	单变量HR（95%置信区间）	第页	多变量HR（95%置信区间）	第页
TDP43（重量）-EGFP(n个= 579)
细胞质定位	1.739 (1.248–2.423)	0.0011	1.724 (1.235–2.406)	0.0014
IB地层	0.840 (0.450–1.567)	NS公司	0.897 (0.480–1.675)	NS公司
荧光强度（a.u.）一	6.201 (3.703–10.384)	<0.0001	2.608 (1.392–4.885)	0.0028
TDP43（A315T）-EGFP(n个= 650)
细胞质定位	1.772 (1.319–2.380)	0.0001	1.747（1.297–2.354）	0.0002
IB地层	1.143 (0.696–1.880)	NS公司	0.903 (0.533–1.528)	NS公司
荧光强度（a.u.）一	3.587 (2.476–5.195)	<0.0001	1.608 (0.992–2.604)	0.0537

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CI，置信区间；n个，神经元数量；NS，不显著(第页> 0.05); a.u.，任意单位。

^一HR与TDP43-EGFP荧光强度的SD有关。

因为TDP-43从细胞核到细胞质的重新分布是TDP-43相关疾病的一个显著特征(Mackenzie和Rademakers，2007年)接下来，我们询问TDP-43的亚细胞定位是否预测细胞存活。通过比较TDP43-EGFP和mCherry（一种在每个转染神经元的细胞质中共存的荧光蛋白）的分布，鉴定出纯核TDP43-EGFP神经元或胞质和核TDP43-EGFP神经元(图5A–C). 通过对固定神经元进行核标记物免疫细胞化学染色，证实了TDP43-EGFP在这些细胞中的亚细胞定位(图2A–C). 通过Cox比例风险分析，转染24小时后细胞质TDP43-EGFP的存在与表达WT或突变TDP43-EGFP的神经元的细胞死亡风险直接显著相关（HR 2.877，第页对数秩检验<0.0001），即使在控制表达水平的多变量分析中也是如此(表1).

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图5。

细胞质TDP43-EGFP显著增加转染神经元的死亡风险。A–C荧光显微镜观察显示纯核（箭头）或核和细胞质（箭头）TDP43-EGFP的细胞。A类，EGFP荧光。B类，m樱桃荧光。C类，将图像与绿色的EGFP荧光、红色的mCherry荧光和黄色的重叠荧光合并。比例尺，10μm。天、具有匹配表达水平和TDP43-EGFP核定位的神经元的Kaplan-Meier生存分析（核，n个=153）或核蛋白和细胞质蛋白（细胞质，n个=258），证明了细胞质TDP43-EGFP的毒性。电子，细胞质定位错误对两种WT的毒性作用相似(n个=170）和突变TDP43-EGFP(n个= 241). *第页<0.0001（对数库测试）。NS，不显著(第页> 0.05). 利用三个独立实验的数据构建了累积死亡风险曲线。

为了完全分离蛋白质定位错误对细胞命运的影响，我们分析了TDP43（WT）-EGFP或TDP43（A315T）-EGFP表达水平匹配的神经元（补充图2A类,B类，网址为网址：www.jneurosci.org作为补充材料），并比较了细胞质（和核）TDP43-EGFP与单核TDP43-EGFP神经元的死亡风险(图5天). 无论神经元表达WT还是突变TDP43-EGFP，细胞质TDP43-EGFP都会使死亡风险增加两到三倍(图5电子,表1). 令人惊讶的是，含有2个纯核蛋白TDP43（WT）-EGFP或TDP43。

遗传研究表明，遗传性神经退行性疾病与特定基因突变之间存在联系，初步鉴定了几种疾病相关蛋白。在包括帕金森氏病和阿尔茨海默氏病在内的一些疾病中，WT基因的重复导致基因产物的过度表达，重现了这种疾病(Salehi等人，2006年;Theodore等人，2008年). 在我们的模型中，TDP-43的过度表达是否足以诱导神经变性？为了回答这个问题，我们利用了这样一个事实，即瞬时转染通常会产生大量表达水平不同的转染神经元，这使我们能够检查细胞对不同“剂量”的TDP-43的反应。WT和突变TDP43-EGFP的高水平表达导致蛋白质从细胞核到细胞质的定位错误（补充图2C类，网址为网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。此外，TDP43（WT）-EGFP和TDP43(表1). 仅EGFP的表达水平并不影响细胞存活。因此，TDP43-EGFP的过度表达导致蛋白质定位错误，并独立于A315T突变诱导神经退行性变。

A315T突变增加了细胞质TDP-43的比例

由于TDP43-EGFP的细胞质分布与神经元毒性明显相关，我们假设A315T突变通过增强蛋白质的错误定位间接刺激细胞死亡。为了验证这一假设，我们统计了TDP43-EGFP纯核分布的神经元以及核蛋白和细胞质蛋白分布的神经元。在表达TDP43（A315T）-EGFP的神经元中，胞质定位错误的频率明显高于表达TDP43-（WT）-EGFP的神经元（分别为39.15%和27.10%）；第页<0.0001，χ²测试），与我们的假设一致。A315T突变对蛋白质定位的影响也通过亚细胞分离进行评估(图6A类)表明表达TDP43（A315T）-EGFP的细胞显示的细胞质蛋白约为表达TDP43-EGFP的细胞的两倍，但核TDP43-EGFP数量没有显著差异。这些结果扩展并证实了荧光显微镜的观察结果。

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图6。

A315T突变和核定位信号的破坏都会增加TDP43-EGFP的细胞质定位错误。A类，HEK293细胞转染TDP43（WT）-EGFP、TDP43。TDP43-EGFP可在各组的核组分（以组蛋白H1的存在为标志）中发现。归一化后，与表达TDP43（WT）-EGFP的细胞相比，分别转染TDP43和TDP43 EGFP的细胞胞质部分（以α-微管蛋白标记）中TDP43-EGFP数量增加了1.79和3.86倍。在每个裂解物的核部分中发现了一条在43 kDa下迁移的带，对应于内源性TDP-43（数据未显示）。B类在转染TDP43（WT）-EGFP的细胞中，胞质中含有TDP43-EGFP的神经元的平均表达水平显著高于转染TDP3（A315T）-EGFP的细胞，这表明与野生型相比，突变型TDP43-EGFP的细胞质定位错误不能仅仅是由于相对过表达*第页=0.0008（双尾t吨测试）；NS，不显著(第页> 0.05). 结果表示来自三个不同实验的汇总数据。

由于TDP43-EGFP的过表达也增加了定位错误和细胞死亡，我们想知道A315T突变的神经毒性作用是否与突变蛋白的选择性高水平表达有关。事实上，转染神经元中TDP43（A315T）-EGFP的平均表达水平低于TDP43-EGFP[0.2271±0.014 vs 0.2892±0.025任意单位（平均值±SEM）；第页=0.0252，双尾t吨测试]。此外，在转染TDP43（A315T）-EGFP的神经元中，TDP43-EGFP的细胞质定位错误的平均表达水平较低(图6B类)，反对过度表达引起的突变型TDP43-EGFP的人为错误定位。这些结果表明，A315T突变特异性地诱导了TDP43-EGFP在转染神经元中从细胞核到细胞质的错误定位。

如果A315T突变增加了胞质TDP43-EGFP的比例，那么在表达突变TDP43-EGFP的细胞中，核质蛋白（NCR）的比例应该更低。为了研究这种可能性，我们测量了单个细胞细胞核和细胞质中TDP43-EGFP的数量，并计算了每个神经元的NCR。事实上，表达TDP43（A315T）-EGFP的神经元的平均NCR显著降低(第页=0.003，Kolmogorov–Smirnov试验）(图7A类)证实A315T突变增强了细胞质定位错误。通过Cox比例风险分析，NCR是细胞存活的重要预测因子(表2)因此是表达TDP43-EGFP的神经元预后的敏感决定因素。

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图7。

突变体TDP43-EGFP细胞质定位错误，细胞质TDP43-EGFP足以引起神经退行性变。A类根据转染细胞细胞核和细胞质中的荧光强度计算，表达突变TDP-43-EGFP的细胞中TPD43-EGFP的平均NCR较低（蓝色，n个=261）比那些表达WT蛋白（绿色，n个=214），与TDP43（A315T）-EGFP在细胞质中的定位错误一致(*第页=0.003，Kolmogorov–Smirnov试验）。实线表示每个群体的正态分布曲线，阴影区域表示神经元的比例，所示NCR值绘制为直方图。几乎所有表达TDP43（mNLS）-EGFP（红色，n个=107）的NCR<1，证实了该蛋白的主要细胞质定位。NCR分布曲线和直方图由三个独立实验的表达数据生成。B类，TDP43-EGFP示意图，突出显示NLS包含残基78–84。TDP43（mNLS）-EGFP是通过用非极性丙氨酸残基（AAA）替换TDP43-EGFP的82–84位的碱性残基（KRK）而产生的。C–E类共聚焦荧光显微镜观察表达TDP43（mNLS）-EGFP的神经元，显示融合蛋白的细胞质定位。C类，EGFP荧光。比例尺，10μm。天TDP43免疫染色。电子，将图像与Hoechst核染色合并为蓝色，重叠为黄色。F类表达TDP43（WT）-EGFP神经元的Kaplan-Meier生存分析和累积死亡风险曲线(n个=998），TDP43（A315T）-EGFP(n个=1106）和TDP43（mNLS）-EGFP(n个= 732). TDP43（A315T）-EGFP和TDP43(*第页<0.0001，log-rank检验），但TDP43（A315T）-EGFP和TDP43；第页>0.05，对数秩检验）。累积死亡风险图包括来自五个独立实验的数据。

表2。

TDP43表达水平和亚细胞分布对神经元存活影响的Cox比例风险分析

变量	人力资源一	95%置信区间	第页
TDP43（重量）-EGFP(n个= 238)
非连续性	0.982	0.969–0.996	0.0122
细胞质TDP43-EGFP（荧光强度，a.u.）	1.660	1.189–2.317	0.0029
核TDP43-EGFP（荧光强度，a.u.）	0.972	0.885–1.068	NS公司
TDP43（A315T）-EGFP(n个= 272)
非连续性	0.981	0.965–0.998	0.0278
细胞质TDP43-EGFP（荧光强度，a.u.）	1.346	1.080–1.678	0.0082
核TDP43-EGFP（荧光强度，a.u.）	0.972	0.872–1.084	NS公司

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CI，置信区间；n个，神经元数量；NS，不显著(第页> 0.05); a.u.，任意单位。

^一HR与NCR或TDP43-EGFP荧光强度的SD有关。

TDP-43亚细胞定位错误与神经退行性变之间的关系是什么？细胞质中过多的TDP-43可能对神经元有毒，或者细胞存活可能依赖于足够数量的核TDP-43的存在。或者，TDP-43在细胞核和细胞质之间的相对分布可能对细胞存活至关重要。我们的系统可以确定这些变量中的任何一个是否最能预测细胞命运。Cox比例风险分析表明，在表达WT或突变TDP43-EGFP的神经元中，每个细胞的细胞质TDP-43数量是细胞死亡的强大且显著的预测因子(表2). 相反，每个细胞的核TDP-43数量与神经元存活无关。此外，如所示图6A类TDP43（A315T）-EGFP的表达与细胞质蛋白量的两倍增加有关，而不会显著影响核TDP43-EGFP的量。这些结果强烈表明，细胞质TDP43-EGFP表现出毒性的功能获得，无论细胞核中的蛋白质含量如何，都会导致细胞死亡。

如果A315T突变通过TDP-43的错误定位刺激细胞死亡，那么将该蛋白靶向细胞质应该可以概括TDP43（A315T）-EGFP的毒性。为了验证这一假设，我们通过突变蛋白质预测NLS的几个氨基酸，在很大程度上限制了WT TDP43-EGFP在细胞质中的分布(图7B类). 采用类似的策略，Winton等人（2008）显示NLS的破坏导致TDP-43的细胞质滞留。当TDP43（mNLS）-EGFP在初级皮质神经元中表达时，正如预期的那样，其主要定位于细胞质(图7C–E类)，NCR<1(图7A类)与蛋白质的几乎完全细胞质定位一致。TDP43（mNLS）-EGFP的细胞质分布由活神经元的定量荧光显微镜（数据未显示）和转染细胞的生化分级证实(图6A类). Kaplan-Meier分析显示，以这种方式突变WT TDP43-EGFP以模拟TDP43（A315T）-EGFP的细胞质错误定位，显著增加了其毒性（HR 1.286，第页< 0.0001) (图7F类). 转染神经元中TDP43（mNLS）-EGFP的平均表达水平与WT蛋白的表达水平相当（数据未显示），排除了TDP43。

如果A315T突变的毒性取决于TDP43-EGFP的细胞质定位错误，那么通过干扰TDP-43的预测核输出信号（NES）来阻止蛋白质的核输出应该可以减弱A315T变异的毒性作用。事实上，我们发现NES突变显著减弱了A315T突变的毒性，因此与TDP43（WT）-EGFP相比，TDP43的表达（mNES-A315T）-EGFP对细胞存活没有显著影响（补充图3，可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。这些结果证实，TDP43-EGFP的细胞质定位错误对A315T特异性细胞毒性至关重要。

免疫细胞化学和亚细胞分馏显示，转染TDP43（mNLS）-EGFP的神经元胞浆内的蛋白质明显多于表达TDP43的神经元。然而，TDP43（mNLS）-EGFP的毒性与突变型TDP43，第页=0.7705（log-rank test），表明细胞质中相对少量的TDP43-EGFP可以饱和毒性作用。为了支持这一结论，我们发现细胞质TDP-43对表达WT、A315T或mNLS TDP43-EGFP的神经元的毒性作用相似，并且在每种情况下，细胞质TDP43的毒性在相对适度的细胞质蛋白水平下达到最大值（数据未显示）。此外，如果A315T突变通过TDP-43的细胞质定位错误而导致毒性，那么包含mNLS和A315T变异的TDP-43双突变不应显示任何超出任何突变本身的额外毒性作用。事实上，表达TDP43（mNLS）-EGFP或TDP43网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。这些结果证实了A315T突变的毒性与TDP-43的细胞质定位错误密切相关，并且毒性作用的机制涉及TDP-43在细胞质中的异常积累。

讨论

在本研究中，我们试图了解TDP-43突变在FTLD和ALS发病机制中的作用。我们建立了一个基于初级神经元的模型，该模型概括了TDP-43蛋白病的关键特征（例如，WT TDP-43在健康神经元中的核定位，突变TDP-43对受影响神经元细胞质的定位错误，泛素化、去污剂不溶性IBs的形成，以及神经变性）并且非常容易进行实验操作。我们希望它能够对TDP-43诱导的神经退行性变的机制假说进行严格评估，并产生生理相关信息。如自动荧光显微镜所示，与ALS发展相关的TDP-43的几个突变在该模型中引起了显著的神经元毒性。细胞存活与IB的形成无关，这表明TDP-43的扩散形式是有毒的。其中一个突变A315T增加了TDP43-EGFP在细胞质中的错误定位，细胞质TDP43-EGFP的数量是细胞死亡的有力预测因素。此外，通过突变NLS将TDP43-EGFP限制在细胞质对神经元有毒，同时通过突变NES防止蛋白质的细胞质定位错误，从而消除A315T突变的毒性作用。这些观察结果表明，A315T突变通过增强TDP-43的细胞质错误定位而增加细胞死亡。

虽然IB形成最初被认为是有毒的，但越来越多的证据表明，在某些情况下，IB形成可以作为表达聚集蛋白的神经元的应对反应(Arrasate等人，2004年;Ko等人，2008年;Lesné等人，2008年;Berlau等人，2009年;Mitra等人，2009年). 我们发现，表达TDP43-EGFP的细胞中IB的形成对于突变特异性细胞死亡是不必要的，这表明至少与一些其他与神经退行性疾病相关的蛋白质类似，TDP-43形成相对惰性的聚集物。然而，我们无法检测到TDP43-EGFP-IB的形成对细胞存活的有益影响。这可能是因为我们的系统灵敏度或分辨率不足。或者，IB的形成可能会导致神经元功能障碍而不影响细胞存活；因为我们的分析只关注细胞死亡，所以这种影响不会被发现。

WT或突变TDP43-EGFP的过度表达对初级神经元有毒，并导致蛋白质的细胞质定位错误，这与酵母中高水平表达人类TDP-43的结果一致(Johnson等人，2008年). 对具有等效表达水平的神经元的分析表明，细胞质TDP43-EGFP本身是细胞死亡的强大预测因子，与表达水平无关。然而，WT或突变TDP43-EGFP的过度表达导致神经退行性变，这表明TDP-43表达的修饰物体内可能会显著影响发生偶发性ALS或FTLD的风险。

与之前培养细胞中TDP-43的研究相反(Ayala等人，2008年;Winton等人，2008年)，我们在大量神经元中检测到该蛋白的细胞质定位错误，并发现突变体TDP-43的表达对转染的细胞是有毒的。虽然我们在实验中使用了初级皮层神经元，但之前的研究是在永生化细胞系中进行的。啮齿动物初级神经元准确定位多种荧光标记转染蛋白(Saudou等人，1998年;Arrasate等人，2004年;Bradley等人，2006年;Pintchovski等人，2009年)，证实这些细胞能够忠实地再现亚细胞蛋白分布。TDP-43在初级神经元中的显著定位错误，但在永生化细胞系中没有，这表明其代谢和分布受神经元特异性机制控制。这些机制可能解释了为什么与家族性ALS和FTLD相关的TDP-43突变对神经元有毒，但对其他细胞类型无效。

在人脑切片和培养的神经元中，TDP-43的细胞质重新分布与蛋白质的核耗竭密切相关(Arai等人，2006年;Neumann等人，2006年). 因此，TDP-43蛋白病的神经变性可能反映出两种可能重叠的机制：核内TDP-43的基本功能丧失或细胞质TDP-43特有的毒性功能增强。在我们的系统中，突变的TDP43-EGFP刺激了表达内源性TDP-43的初级WT大鼠神经元的细胞死亡。这种毒性获得功能与几乎所有与家族性ALS相关的TDP-43突变的常染色体显性遗传一致，包括A315T(Kabashi等人，2008年;Kühnlein等人，2008年;Sreedharan等人，2008年;Van Deerlin等人，2008年). 或者，突变体TDP-43可以通过将内源性TDP-43螯合在细胞核内或以其他方式破坏其功能而以显性负向方式发挥作用。然而，胞浆TDP43-EGFP的数量是细胞死亡的一个强大且独立的预测因子，核TDP43-EGFP的量与神经元存活之间没有明确的关系。此外，将TDP43-EGFP定位于细胞质对转染神经元有害，突变TDP43-EGFP诱导的细胞死亡与蛋白的细胞质定位错误密切相关。这些结果没有证据表明TDP-43的核耗竭对突变蛋白的毒性很重要，但确实表明TDP-33在细胞质中的错误定位足以导致神经退行性变。然而，这些实验是在内源性TDP-43水平正常的情况下进行的，这限制了我们完全排除核TDP-43丢失本身有毒的可能性。

突变型TDP-43可能如何参与家族性ALS的发展？A315T突变导致大鼠皮层神经元中TDP43-EGFP的细胞质定位错误。由于A315T突变位于TDP-43的假定蛋白-蛋白质相互作用域，因此可以通过增强TDP-43与细胞质结合伙伴的结合来增加细胞质蛋白的比例，从而削弱其核输入，并促进其核输出，或者破坏其与具有核约束力的合作伙伴的亲和力。将TDP-43限制在细胞质中可能会使蛋白质不成比例地暴露于内源性蛋白酶中，从而产生高浓度的C末端TDP-43片段，这些片段在受影响神经元的细胞质内含物中富集(Igaz等人，2008年).

增加细胞质全长或C末端TDP-43的数量可能会导致蛋白的正常功能毒性增强或病理性增强。例如，全长或C末端TDP-43的细胞质定位错误可能导致基本mRNA转录物的隔离、细胞质-核RNA转运异常或mRNA的局部翻译参与家族性ALS提供了额外的证据，证明RNA加工的中断可能参与神经退行性变(Kwiatkowski等人，2009年;拉盖尔·图伦和克利夫兰，2009年). 除ALS外，其他几种神经肌肉疾病，包括强直性肌营养不良和脆性X综合征，其特征是细胞核和细胞质内RNA处理异常(Ranum and Cooper，2006年). TDP-43定位错误可通过类似机制导致运动神经元死亡。与这一假设一致的是，TDP-43与低分子量神经丝mRNA结合具有高亲和力的缺陷(Strong等人，2007年)与运动神经元变性有关(Wong等人，2000年). 在运动神经元病转基因模型中，即使神经丝化学计量比发生轻微变化也可能导致神经丝聚集和细胞死亡(Wong等人，2000年;拉里维尔和朱利安，2004年). 因此，一种可能性是细胞质全长或C末端TDP-43有效隔离神经丝转录物，导致神经丝化学计量、聚集和运动神经元死亡的扰动。

总之，我们建立了一个初级皮层神经元模型，该模型具有TDP-43蛋白病的许多特征。与其他神经退行性疾病一样，WT蛋白的过度表达足以导致神经元死亡。因此，发生散发性ALS和FTLD的风险可能与TDP-43的总量成正比，并可能受到TDP-43表达或降解调节器的强烈影响。此外，我们证明了TDP43-EGFP的细胞质滞留也是有毒的，突变TDP43-EGFP的表达通过增强蛋白质的细胞质错误定位增加了细胞死亡的风险。虽然每个细胞的细胞质TDP43-EGFP数量准确预测了细胞死亡率，但核TDP43-EGFP数量与细胞存活无关，表明毒性主要来自细胞质TDP-43的下游效应。如果TDP-43的定位错误是疾病发病所必需的，那么抑制蛋白质重新分布可能是未来治疗FTLD和ALS的重要靶点。或者，如果TDP-43的细胞质积累通过隔离mRNA转录物或转运机制导致细胞死亡，则涉及TDP-43相互作用的小分子抑制剂可能会阻止疾病进展。这里提出的细胞模型将是一个有价值的系统，用于研究TDP-43蛋白病的发病机制以及评估新的和潜在的神经保护策略。

脚注

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