原发性人类HSC的分离
如前所述，在接受原发性良性肿瘤或结肠癌单一转移肝切除术的患者中，从正常肝边缘分离出原发性HSC(26). 简单地说，肝切除术后立即清洗一个孤立的肝脏切片，并对门脉血管进行插管就地胶原酶消化（罗氏应用科学）和Pronase消化（罗氏应用科学），然后进行密度梯度离心(27). HSC群体的纯度始终在95%至99%之间，生存率为95%。将HSC接种在Dulbecco改良Eagle培养基（Invitrogen）中的塑料上，该培养基在5%CO中补充有10%胎牛血清2增湿的大气。通过在塑料上培养7-10天激活HSC，并传代至第4代进行以下实验。除了原代HSC外，我们还利用了一个经过验证的永生化人类星状细胞系LX-2，其特征与原代活化HSC相似(28).
表达质粒和报告构建
从人类肝脏cDNA文库中PCR克隆全长DDX5 cDNA，并将TOPO连接到pcDNA3.1载体（Invitrogen）。DDX5 S480A SNP是通过定点突变产生的（参见)和QuikChange®II-E定点突变试剂盒（加利福尼亚州拉霍亚市斯特拉赫尼）。然后使用Pfx50对DDX5 WT和SNP cDNA进行PCR扩增TM（TM）DNA聚合酶（Invitrogen）和一对克隆引物()其允许在cDNA的C末端加入FLAG表位编码序列。然后将PCR产物TOPO克隆到PCR®8/GW/TOPO®Entrez载体（Invitrogen）中，并通过LR重组反应转移到目的载体中。选择的目标向量为pcDNA-DEST40网关TM（TM）瞬时转导载体（Invitrogen）和Plenti4/V5-DEST网关TM（TM）用于慢病毒介导的hu-DDX5 cDNA到LX-2细胞中的稳定转导的载体（Invitrogen）。通过将DDX5 WT和SNP cDNA重组连接到GAL4-DBD pcDNA3表达载体中，生成N末端GAL4 DNA结合域（GAL4-DB）与DDX5 cDNA连接的结构。通过商业测序验证了载体序列（GENEWIZ，Inc.，新泽西州南普兰菲尔德）。
表1
用于突变、克隆、siRNA和实时定量PCR的序列
粗体字表示突变的寡核苷酸。
| 顺序 |
|---|
| 定点突变 | |
| DDX5型 | 感觉：5′-GGTCGAAGACAGAGGTG公司CAGGTCGTTCCAGGGTAGA-3′ |
| 反义：5′-TCTACCCTCGGAACGACCTGC类ACCTCTCTTCTCCGACC-3′ |
| α2（I）胶原蛋白启动子 | |
| Sp1（1） | 感觉：5′-GGCGGAGGAGGGGG在GAGGTATGCAGACAAGAGTC-3′ |
| 反义：5′-GACTCGTGTCTGCATACCTC在CCCTCCGCATCCTCCCGCC-3′ |
| Sp1（2，3） | 感觉：5′-CCAAACTTTGGAAAGGG在GGGGAGG公司在GGAGGATGCGGGAGGCG-3′ |
| 反义：5′-CGCCCTCCGCATCCTCC在中交中交在CCCTTTCCAAGTTGG-3′ |
| Smad3公司 | 感觉：5′-GAGGGCGGAGGTATGCA科科斯群岛CAACGAGTCATTTCCCCTTG-3′ |
| 反义：3′-CAAGGGAAACTCTGACTCGTTG公司GG公司TGCATACCTCTCCCTC-3′ |
| AP-1型 | 感觉：5′-GCGGAGGTATGCAGACAACG科科斯群岛TCAGATTTCCCCTTGAAAGC-3′ |
| 反义：5′-GCTTTTCAAGGGAAAACTCTGAGG公司CGTTGTCTGCATACCTCCGC-3′ |
|
| 克隆引物 | |
| DDX5型 | 感觉：5′-CGGATCACCCGCAACCATTGACCC-3′ |
| 反义：5′-GGGATCCTTACTATCATCGTCCCTTGTAGTCTTGGGAATATCCTGTTGGC-3′ |
|
| 小干扰RNA | |
| DDX5 5′-非翻译区 | 感觉：5′-GATCCACATGAAGGCAATGCATGGCCTTCAAGAGGCACATGCATGCCTTTTTTTTA-3′ |
| 反义：5′-AGCTTAAAAAAATGAAGGCAATGCATGGCCTTCTTGAAGGCCATGCATTGCTCTCATGGG-3′ |
|
| ChIP引物 | |
| α2（I）胶原蛋白启动子（162 bp） | 感觉：5′-ACTCCGACGTGTCCCATAGTTT-3′ |
| 反义：5′-GGGCTGGCTTCTTAAATTGGTTCC-3′ |
| TIMP-1启动子（153 bp） | 感觉：5′-AGGAATAGTGACTGACGTGGAGGT-3′ |
| 反义：5′-GCATTACTCATCCACCACCATCA-3′ |
| TIMP-1启动子（240 bp） | 感觉：5′-CGGCTTGGAAGGAATAGTGACTGA-3′ |
| 反义：5′-CGCTAGAGGATAAAATGTCCACGCT-3′ |
| TGF-β1启动子（264 bp） | 感觉：5′-AGGAGGCAGACCCTGTTT-3′ |
| 反义：5′-AGGAGGTGGGAGGAGAT-3′ |
| 转化生长因子-β1启动子（152bp） | 感觉：5′-TACCTTTTTCCCAGCCTCTGCTCT-3′ |
| 反义：5′-TGATCCAGATGCGCTGTGGCTTT-3′ |
|
| 实时定量PCR引物 | |
| 人DDX5（131 bp） | 感觉：5′-ACAGAATTCATCACCACCACTGC-3′ |
| 反义：5′-GACAATGGCAGAGAAAAAAGA-3′ |
| 人类胶原蛋白1型（118 bp） | 感觉：5′-GGCTTCCCCTGGTCTTCCTGG-3′ |
| 反义：5′-CCAGGGGTCCAGCCAAT-3′ |
| 人TGF-β1（101 bp） | 感觉：5′-CCCAGCATCTGCAAAGCTC-3′ |
| 反义：5′-GTCAATGTACAGCTGCCGCA-3′ |
| 人甘油醛-3-磷酸脱氢酶（104 bp） | 感觉：5′-GGTGAAGTCGGAGTCAACGG-3′ |
| 反义：5′-TGAAGGGTCATGAGGCAACA-3′ |
含有Smad3、AP-1（激活蛋白-1）或三个Sp1结合位点突变的α2（I）胶原基因的启动子结构通过定点突变产生（参见引物序列)使用荧光素酶报告子构建−378/+1α2（I）胶原基因启动子(29)作为模板。表达与GAL4-DBD连接的Sp1或JunD融合蛋白的GAL4-Sp1和GAL4-JunD载体通过重组连接pcDNA3载体的GAL4-DBD插入物生成，其中Sp1和JunD cDNA表达pCMV质粒。DNA测序证实了突变和重组子。TIMP-1启动子和突变启动子构建AP-1和Sp1结合位点(30,31); TGF-β1启动子结构(32,33); GAL4-反应性TATA荧光素酶报告子构建；表达JunD、c-Fos、Runx2、Smad3或Sp1的质粒已在别处描述(34,–37).
DDX5在培养细胞中的敲除和重组
LX-2和原代人HSC生长在6孔培养板中，达到60-70%的融合。双工或DDX5型潜行TM（TM）使用TransIT-LT1试剂（Mirus Bio，Madison，WI）将siRNA（Invitrogen）或Stealth RNA干扰阴性对照（Invitrogen）转染到LX-2或原代人HSC中。6 h后，将培养基替换为正常生长培养基，并在12、24和48 h收获细胞。为了在含有内源性DDX5的LX-2细胞中重建DDX5 SNP，将细胞与pSUPERshRNA DDX5瞬时共转染()，一个含有短发夹RNA的pSUPER质粒，靶向5′-非翻译区DDX5型24小时后转染含DDX5 WT或SNP的cDNA表达质粒。在此后的12、24和48小时收获用于RNA和蛋白质分析的样品。
表达DDX5 WT和SNP的稳定HSC株系的建立
通过联合转染ViraPower制备复制活性慢病毒载体TM（TM）包装混合物（Invitrogen），连同FLAG-tagged DDX5 WT或SNP表达构建物或pLenti4/TO/V5-GW/LacZ控制质粒，进入由Lipofectamine介导的293FT产生细胞系TM（TM）2000转染试剂。在12小时后，用含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基更换培养基。通过收集培养基并在4°C下以3000 rpm离心5 min，在转染后48 h收集含病毒的上清液，以造粒并去除细胞碎片。将病毒上清液等分并储存在−80°C下。
为了将慢病毒构建物感染到LX-2细胞系中，将细胞放置在10-cm培养皿中，30–50%汇合。DDX5 WT、DDX5 SNP或对照载体的慢病毒株用培养基稀释10倍，并与细胞一起培养。共培养48小时后，在含有500μg/ml Zeocin的培养基中选择感染细胞TM（TM）（Invitrogen）。菌落被扩大并储存在液氮中或直接用于实验。
DDX5 WT和SNP表达细胞中成纤维基因的表达及其启动子活性
将表达DDX5 WT或SNP的稳定HSC系以2×10的密度放置在24孔板、6孔板或10厘米皿中5每孔或皿中的细胞数分别为0.5、2.5和10 ml。隔夜培养，用含有2 ng/ml TGF-β1的新鲜培养基处理12或24小时。收集细胞和培养上清液进行mRNA和蛋白质分析。
为了评估启动子活性，将α2（I）胶原、TIMP-1和TGF-雷尼利亚使用Fugene HD转染试剂（Roche Appled Science）构建荧光素酶表达载体（比例为1:0.005）12小时。用TGF-β1或载体处理转染细胞，并于12 h后收集。启动子活性评估如下所述。
在单独的实验中，启动子报告质粒与表达JunD、c-Fos、Sp1或Smad3的cDNA共同转染到LacZ-、DDX5 WT-或SNP-表达细胞（启动子/转录因子的质粒/雷尼利亚以1:1:0.005）的比例处理24小时，然后用TGF-β1或载体处理12小时，然后收集以检测启动子活性。或者，转染含有AP-1、Sp1或Smad3结合位点突变的启动子质粒，然后检测细胞的相对启动子活性，如下所述。
为了测试DDX5 WT或SNP序列对启动子活性的相对影响，将LX-2细胞置于48个平板中。在每个孔中，总共0.8μg含有不同比例的DDX5 WT和SNP cDNA（0.8:0、0.6:0.2、0.4:0.4、0.2:0.6和0:0.8）或LacZ对照载体与0.2μgα2（I）胶原、TIMP-1或TGF-β1的启动子萤光素酶报告质粒共转染。转染后24小时检测细胞的启动子活性。
逆转录和实时定量PCR
从细胞中提取RNA，并分别使用RNeasy®试剂盒（Qiagen，Valencia，CA）和Omniscript逆转录试剂盒（Qiagen）将其逆转录成cDNA，并在lightCycler®480系统（Roche Applied Science）上使用SYBR Green实时定量PCR Master Mix（罗氏应用科学）进行实时定量PCR分析用于α2（I）胶原、TIMP-1、TGF-β1和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的引物列于.
免疫细胞化学
LX-2细胞接种在玻璃盖玻片上并培养24 h。用4%多聚甲醛/磷酸盐缓冲液固定，用0.2%Triton/磷酸盐缓冲溶液渗透5 min。根据制造商的说明（DAKO Strept ABC复合辣根过氧化物酶试剂盒，DAKO（Carpintia，CA）），使用主要的小鼠抗人DDX5单克隆抗体（Upstate，Temecula，CA）（1:200稀释）进行免疫染色。然后将盖玻片与生物素化链环抗体孵育，然后与过氧化物酶标记的链霉亲和素孵育30分钟，然后用二氨基苯扎定-H染色2O（运行）2解决方案。细胞在乙醇中以升高的浓度脱水，并在安装之前用二甲苯清除。染色是在尼康显微镜下捕获的（尼康仪器公司，纽约州梅尔维尔）。
在用抗FLAG M2异硫氰酸荧光素mAb（Sigma）以10μg/ml（在磷酸盐缓冲盐水中1:200）在4°C过夜的室载玻片（Nalgene Nunc International，Naperville，IL）中铺板的细胞上，通过直接免疫荧光检测FLAG标记的外源性人DDX5 WT或SNP蛋白在LX-2细胞中的定位，然后在荧光显微镜下进行检查（尼康Eclipse，尼康仪器公司）。
Western Blot分析
细胞提取物的Western blot是通过用裂解缓冲液（Roche Applied Science）和蛋白酶抑制剂混合物（罗氏应用科学）和蛋白磷酸酶抑制剂混合物（Upstate）对细胞进行造粒来制备的。蛋白质浓度采用Bradford方法，使用Bio-Rad DC蛋白质检测试剂盒进行测定。通过SDS-PAGE分离等量的蛋白质；转移到Hybond C膜；用α2（I）胶原蛋白（Rockland Immunochemicals，Inc.，Gilbertsville，PA）、TGF-β1、α-SMA（Promega）、DDX5（来自Upstate的单克隆抗体或来自Bethyl Laboratory Inc.（Montgomery，TX）的多克隆抗体）、FLAG M2和β-actin（Sigma）的特异性一级抗体进行免疫印迹；并使用二级辣根过氧化物酶结合抗体（GE Healthcare）和西方化学发光检测系统（Millipore Corp.，Temecula，CA）进行可视化。
酶联免疫吸附试验
培养24小时后，从6孔板中的细胞中收集培养上清液，用于TIMP-1分析，无论是否使用TGF-β1（2 ng/ml）处理。根据制造商的说明，使用酶联免疫吸附分析试剂盒（研发系统）对TIMP-1进行定量。
萤光素酶报告基因测定
将24或48周板中处理过的细胞用冷磷酸盐缓冲盐水清洗三次，并使用双荧光素酶报告分析系统（Promega）制备细胞裂解物。使用LumiCount微孔板光度计（英国西苏塞克斯郡沃辛Dynex Technologies）测量每个细胞裂解液中20μl的荧光素酶活性。计算萤火虫荧光素酶活性的变化，并在归一化后绘制雷尼利亚同一样品中的荧光素酶活性。
核提取物的制备和共免疫沉淀
按照制造商的说明，使用核蛋白提取和联合免疫沉淀试剂盒，从表达DDX5 WT和SNP的HSC和表达LacZ的细胞中制备核蛋白提取物（加利福尼亚州卡尔斯巴德市Active Motif）。通过Bio-Read蛋白质检测试剂盒对其蛋白质浓度进行量化。将一部分核蛋白作为“输入蛋白”进行鉴定和储存，其他核蛋白用于检测DDX5 WT和SNP蛋白与核转录因子的共沉淀。每100μg核蛋白与5μg抗FLAG M2单抗（Chemicon International，Temecula，CA）或非相关（与主要抗体宿主）结合将正常血清作为阴性对照，置于试剂盒提供的最终体积为500μl的完全免疫共沉淀/洗涤缓冲液中，并在4°C的摇床上培养过夜。将50μl蛋白G珠（活性Motif）添加到每个试管中，并在旋转器上在4°C下培养1小时。收集珠子并用联合免疫沉淀缓冲液仔细清洗四次，然后在50μl 2×还原负载缓冲液（130 m）中重新悬浮米Tris，pH 6.8，4%十二烷基硫酸钠，0.02%溴酚蓝，20%甘油，100 m米二硫苏糖醇）。将样品煮沸5 min，并以全速微离心30 s。将上清液转移到新鲜试管中。上清液中的免疫沉淀蛋白通过SDS-PAGE和Western blot用标准方法用适当的一级和二级抗体分离。所用的初级抗体是人DDX5（Bethyl Laboratory Inc.）、磷酸JunD（细胞信号传导）、c-Fos（细胞信号传导）、Runx2（活性基序）、Sp1（活性基序）、Smad3（细胞信号传导）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）。
为了表征HSC细胞核中含DDX5 WT和/或SNP的同型二聚体的形成，用相同数量的FLAG标记的DDX5 WG或SNP cDNA转染LX-2细胞，以及表达GAL4-DBD连接的DDX5。转染后24小时提取核蛋白。用抗FLAG M2单克隆抗体（Sigma）免疫沉淀蛋白质，然后用GAL4-DBD抗体（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）进行Western blot。本实验还使用HDAC1单克隆抗体（Millipore Corp.）分析了外源DDX5和HDAC1之间的相互作用。
染色质免疫沉淀（ChIP）分析
将表达DDX5 WT和SNP的HSC和表达LacZ的细胞分别置于三个15 cm的平板中，并生长到80%的汇合处。细胞通过甲醛固定、染色质分离和使用ChIP-IT的酶剪切进行处理TM（TM）Express套件（Active Motif），遵循制造商的说明。保留一等分新鲜制备的染色质作为“输入DNA”，剩余的被蛋白G磁珠（活性Motif）和抗FLAG M2单克隆抗体（Chemicon International）或抗组蛋白H捕获三（作为阳性对照，活性Motif）和非特异性IgG（作为阴性对照）在4°C下在摇壶上培养12小时。然后仔细清洗珠子，洗脱结合的染色质。洗脱液中的染色质通过蛋白G磁珠在摇床上用4°C的磷酸JunD（细胞信号）或Sp1（活性Motif）抗体重新沉淀12小时。洗涤和洗脱后，对染色质DNA进行反向交联，并在37°C下用蛋白酶K处理1 h。含有ChIP DNA的所得上清液立即用于PCR或储存在−20°C下。
使用SYBR Green实时定量PCR Master Mix（罗氏应用科学）在lightCycler®480系统（罗氏应用科学）上对来自每个ChIP反应的DNA和输入DNA进行PCR扩增。使用的引物设计用于覆盖启动子区域，该启动子区域包含α2（I）-胶原启动子上Sp1/Smad3/AP-1结合位点的顺式作用元件、TIMP-1启动子上AP-1/Runx2/Sp1位点以及TGF-β1启动子上的AP-1/Sp1结合位点，如.
在另一个实验中，将相同数量的FLAG-标记的DDX5 WT或SNP cDNA转染到15 cm板中的LX-2细胞，这些cDNA与GAL4-DBD表达质粒相连。24小时后提取染色质，并用上述抗FLAG M2和GAL4-DBD抗体进行双重免疫沉淀。使用纤维生成基因启动子引物进行PCR扩增。
GAL4活化分析
LX-2细胞置于24孔板中并培养过夜。编码连接到GAL4-DBD的Sp1或JunD融合蛋白的质粒和TATA-荧光素酶报告质粒与DDX5 WT或SNP表达载体或LacZ表达的对照质粒和GAL4-responsive TATA-荧光素酶报告子以及雷尼利亚使用Fugene HD转染试剂（Roche Applied Science）将荧光素酶质粒（比例为1:1:1:0.005）导入细胞。24小时后收集细胞裂解物，并按照上述方法进行荧光素酶分析。
HDAC活性的测定
用Fugene HD试剂将DDX5 WT和SNP cDNA以及LacZ对照载体瞬时转染到LX-2细胞。24小时后收获细胞。提取核蛋白，用EZview免疫沉淀FLAG标记的DDX5蛋白TM（TM）红色抗FLAG®M2亲和凝胶（Sigma）。用分析缓冲液清洗和洗脱珠子，以评估HDAC活性。根据制造商的说明，用HDAC（HDAC1和HDAC2）比色分析试剂盒（BIOMOL International LP）测定FLAG标记的DDX5 WT和SNP蛋白对HDAC活性的影响。在405 nm处测量反映HDAC活性的颜色发展，并用OD值表示与输入蛋白质浓度。
统计
结果表示为平均值±S.E。第页值（学生的双尾，未配对t吨试验）至少三次独立测定，使用Microsoft Excel软件进行计算。数据被认为具有统计学意义第页< 0.05.
