通过肝靶向基因转移抑制正常和营养不良小鼠的系统性肌生长抑制素

摘要

介绍

肌生长抑制素或生长分化因子8（GDF-8）是多效性转化生长因子β家族的成员，是骨骼肌质量的一个强有力的负调节因子。肌生长抑素在物种间高度保守，当功能失活导致奶牛、狗、羊、，小鼠和人类[1]相反，肌抑制素异位过度表达导致骨骼肌萎缩[2]大量实验表明，由于基因缺失或抑制而缺乏肌抑制素会导致肌肉质量增加[3]——[6]虽然肌肉生长抑制素抑制对骨骼肌质量和形态的影响取决于阻滞的途径、时间和机制，但由于肌纤维的生长（肥大）和/或肌纤维数量的增加（增生），肌肉尺寸总是会增加。当肌生长抑制素基因缺失或被肌生长抑素结合蛋白卵泡抑制素的转基因表达所抑制时，肌肉质量会有更大幅度的增加，并且可以观察到纤维的肥大和增生[4],[5]出生后，在正常C57 Bl/6小鼠和中密度纤维板Duchenne肌营养不良小鼠模型因肥大而非增生导致肌肉生长[3],[6].

鼠营养不良动物模型的一个共同特征是由于卫星细胞活化、增殖和融合到现有的肌肉纤维或从头开始肌纤维的形成。因此，基于肌肉生长抑制素的疗法对肌营养不良症具有很大的前景，因为它们能够增加纤维大小、促进再生和调节肌肉纤维化[3],[7],[8]在轻度营养不良模型中，肌肉生长抑制素的抑制导致营养不良病理的显著改善(中密度纤维板)，严重营养不良模型的混合结果(dsg）或严重营养不良模型无改善(gsg、dy)[5],[9]——[11]肌肉抑制素抑制并不能改善严重的肌营养不良并不奇怪，因为肌抑制素不能纠正潜在的遗传缺陷。对于肌营养不良症，肌肉抑制素抑制可以通过促进肌肉质量的短期增长来增强对原发性缺陷的纠正。增加的肌肉质量可以通过减少产生给定力量的肌肉数量来防止收缩引起的损伤[12]肌肉生长抑制素的调节对包括正常肌肉质量损失的疾病状态也有治疗潜力，例如癌症恶病质、废用性萎缩、肌肉减少和微重力暴露。然而，心脏中的肌抑制素抑制可能会干扰心脏对潜在心脏疾病的适应，这些疾病可能会随着年龄增长和肌营养不良的一部分而发生。

以前的临床前研究中密度纤维板以肌抑制素途径为靶点的Duchenne肌营养不良小鼠模型利用了中和抗体、肌抑制蛋白前肽注射和重组腺相关病毒（AAV）介导的多组织表达肌抑制酶抑制剂[5],[13],[14]这些研究均显示骨骼肌得到改善，尽管在开始治疗后只对动物进行了3-4个月的随访。由于肌营养不良导致骨骼肌进行性病理改变，因此长期研究对于确定拟议的治疗方法是否能够随着时间的推移纠正病理改变以及评估肌抑制素抑制对心脏功能的影响至关重要。九个月大时中密度纤维板小鼠首先出现进行性扩张型心肌病的症状，该年龄在这些研究中未进行分析[5],[13],[14]乔等人最近报道，AAV介导的突变型肌抑制素前肽的表达增加了肌肉大小并改善了中密度纤维板动物[14]虽然他们认为这是由于肝脏分泌所致，但免疫印迹法并未显示肝脏中的前肽表达，RT-PCR显示心脏和肝脏中的转基因表达。由于本研究中使用了一种普遍存在的启动子，因此有可能前肽不是在肝脏中表达，而是在心脏以及其他未经筛选的骨骼肌中表达。Haidet等人使用AAV肌肉注射过度表达抑制肌抑制素的内源性蛋白[15]本研究的一个局限性是，没有一种抑制剂对肌抑制素具有特异性。例如，卵泡抑素和卵泡抑素样相关基因（FLRG）除了与肌肉抑制素结合外，还与激活素结合，GDF相关血清蛋白1（GASP1）也包含蛋白酶结构域[16]——[19]。观察到的对肌肉生长的有益影响可能取决于非肌肉特异性的信号通路，而不是肌肉抑制素，非肌肉组织生理学的调节可能会限制临床应用。

虽然人们对利用肌生长抑制素抑制来改善肌营养不良和其他疾病有相当大的兴趣，但尚未有关于产后肌生长抑素抑制的全面长期研究报告。缺乏对慢速和快速肌肉类型以及膈膜和心脏的功能评估。膈膜是最严重的营养不良骨骼肌中密度纤维板小鼠和小鼠肌肉是人类疾病进展最具代表性的。不可能直接注射所有这些组织，营养不良的肌肉在没有膜稳定的情况下不支持AAV的长期转导。随着时间的推移，AAV转导的丢失很可能是由于肌肉纤维的更替，这一点可以通过AAV介导的IGF表达在4个月后的丢失来证明中密度纤维板肌肉（E.R.Barton和H.L.Sweeney未发表的观察结果）以及在高度再生的α-淀粉聚糖缺失模型中六周后AAV介导的肌抑制素前肽表达的类似缺失[20],[21].

为了解决这些问题，我们开发了一种方法，通过单剂量的AAV从C57 Bl/6和中密度纤维板老鼠。将C57 Bl/6小鼠作为新生儿或年轻人进行治疗，然后在注射后三个月进行检查，以确定肌肉抑制素抑制对正常动物肌肉质量的影响。Mdx公司将小鼠作为新生儿或1个月龄注射，并在4个月龄和11个月龄时进行检查，以评估肌肉病理学早期和晚期阶段肌肉抑制素抑制的效果。对比目鱼肌、趾长伸肌（EDL）、横膈膜和心脏进行功能和组织学评估，以系统地确定肌肉生长抑制素抑制的效果。这些发现对未来利用肌生长抑制素途径的治疗以及肌生长抑素在骨骼肌和心肌中的调节作用具有重要意义。

结果

为了持续表达循环肌抑制素抑制剂，设计了一种显性阴性肌抑制蛋白前肽（dnMstat），与肝脏特异性启动子（α₁-具有ApoE增强子的抗胰蛋白酶启动子，缩写为LSP）和AAV伪型2/8LSP.dnMstat。先前研究表明，AAV假型2/8对肝脏具有良好的嗜性，与其他AAV血清型相比，静脉注射后肝脏的转导能力更强[22],[23]。小鼠研究的实验设计如所示图1A将C57 Bl/6小鼠作为新生儿（n=6个对照组，n=6只治疗组，表示C57新生儿）或三个月大的成年鼠（n=5个对照组、n=6只是治疗组，代表C57成人）进行治疗，并在病毒注射后三个月进行分析。这个中密度纤维板采用Duchenne型肌营养不良小鼠模型，研究肌抑制素抑制对肌营养不良进展的影响。在所有患者的血清中评估dnMstat水平中密度纤维板集体献祭( 图1E ). 在四个月大时，与新生儿治疗相比，在一个月大的时候对小鼠进行治疗时，循环抑制剂增加了约3倍。尽管两种注射方法在11个月大时表现出类似的绝对下降，但在整个研究过程中，循环抑制剂的差异仍然存在。新生动物中的病毒注射有效地导致了低剂量的dnMstat，而一个月大的动物的病毒注射则导致了高剂量的dnM stat。为了简化讨论，我们命名了实验组，以反映实验终点动物的年龄和抑制剂的剂量。Mdx公司一个月龄时接受治疗的小鼠，四个月龄后进行分析（n=6个对照，表示中密度纤维板4C和n=6处理，表示中密度纤维板4H）。一小群中密度纤维板将小鼠作为新生儿注射，并在四个月大时处死，以确定年龄对病毒表达的影响，不进行进一步评估（n=4只接受治疗，表示中密度纤维板4L）。对于11个月的终点，小鼠被视为新生儿（n=6，表示中密度纤维板11L）或一个月大（n=4，表示中密度纤维板11H）带有一组通用控制装置（n=6，表示中密度纤维板11C）。

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图1

系统性病毒传递和dnMstat表达。

所有实验中使用的病毒结构包括肝脏特异性启动子（LSP）与显性阴性肌抑制素（dnMstat）配对。用GFP代替dnMstat制备了类似的结构。（a） C57 Bl/6和中密度纤维板组静脉注射AAV 2/8 LSP.dnMstat。C57新生儿组在出生后第3-5天注射，3个月龄时处死，而C57成人组在3个月岁时注射，6个月龄处死。这个中密度纤维板4H组于1月龄时注射，4月龄时处死。这个中密度纤维板11L和11H组于11个月龄时处死，作为新生儿（11L）或1个月龄（11H）注射。AAV 2/8 LSP。将GFP或AAV 2/8 LSP.dnMstat注射到成年C57 Bl/6小鼠的尾静脉中，以评估启动子的特异性并确认dnMstat的过度表达。（b） 注入AAV 2/8 LSP后。GFP、GFP荧光仅见于肝脏。（c） 注射AAV 2/8 LSP.dnMstat后，通过RT-PCR进一步评估转基因表达的组织特异性。从治疗后的心脏（Ht）、肝脏（Li）、膈肌（Dia）、股四头肌（Qu）、肺（Lu）和肾脏（Ki）中分离RNA，用DNA酶处理以去除残留的AAV载体基因组并逆转录。对所得cDNA进行PCR，以评估dnMstat（～450 bp）和β-actin（～350 bp）的表达作为对照。仅在肝脏中检测到转基因表达。（d） 用针对myostatin N末端的抗体进行免疫印迹，在血清和肝脏中检测到dnMstat。（e） 在实验终点测量血清dnMstat水平。抑制剂的循环水平大约是中密度纤维板4H组比中密度纤维板4L组。11L和11H组在11个月龄时表达水平的绝对差异保持不变。请注意中密度纤维板4L组未进一步分析比例尺：100µm。

静脉注射AAV2/8 LSP的1E12基因组拷贝证实了LSP的特异性。GFP。GFP仅在肝脏中检测到表达，而在心脏或骨骼肌中未观察到荧光( 图1B ). 通过逆转录聚合酶链反应进一步评估转基因表达在六种不同组织中的组织分布。转基因仅在肝脏中检测到表达( 图1C ). 将AAV2/8 LSP.dnMstat注射到成年C57 Bl/6小鼠的尾静脉中，一周后在血液和肝脏中检测到高水平的抑制剂( 图1D ). 注射病毒一周后处死C57 Bl/6动物，以评估肌肉生长关键细胞内调节器活性的急性变化。在接受治疗的股四头肌中，磷酸化Smad 2/3减少，磷酸化JNK减少，磷酸化Akt增加（n=4）( 图2 ). 这些结果表明，肝脏是AAV介导的循环肌抑制素抑制剂过度表达的可行靶点。

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图2

短期抑制C57 Bl/6小鼠肌抑制素后的信号变化。

C57小鼠静脉注射AAV 2/8 LSP.dnMstat，一周后处死动物。以β-肌动蛋白为负荷对照，在股四头肌蛋白匀浆上进行总Smad2/3、Akt和JNK和磷酸化Smad2/3的免疫印迹。在dnMstat处理的C57股四头肌中，（a）磷酸化Smad 2/3减少41%，（b）磷酸化Akt增加59%，（c）磷酸化JNK减少31%。数据表示平均值±标准偏差。*与对照组相比，具有统计学意义，p<0.05。

通过分析过度表达dnMstat的C57 Bl/6动物的肌肉大小和功能，评估dnMstats抑制肌肉生长抑制素的效果。在C57成人组中，dnMstat的表达导致股四头肌、胫骨前肌和趾长伸肌（EDL）的肌肉质量增加14-22%，而在C57新生儿组中观察到这些肌肉增加32-43%( 表1 ). 因此，当在寿命早期开始抑制时，观察到非营养不良动物的肌肉质量增加更为明显。C57 Bl/6组比目鱼肌和心脏的湿重没有变化。在C57成人组中，EDL肥大而不增生，纤维面积分布向右移位，纤维数量无变化( 图3A ，b个). EDL的横截面积（CSA）和破伤风力增加了约15%( 图3C、D ). 未观察到标准化为CSA（比力）的力生产的变化( 图3E ). 综上所述，这些数据表明dnMstat的表达导致肌肉质量、力量和肥大增加，而正常骨骼肌没有增生。

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图3

抑制C57 Bl/6小鼠全身肌肉生长抑制素的作用。

成年雌性C57 Bl/6小鼠静脉注射AAV2/8 LSP.dnMstat，并在6个月大时注射3个月后进行分析（C57成年）。第二组动物在出生后第3-5天通过皮下注射方法注射相同的病毒，并在3个月大时进行分析（C57新生儿）。分析C57成人组EDL的纤维面积分布、纤维数量和功能特性。（a） 在dnMstat组，纤维大小分布向右移位，表明纤维面积增加。（b） EDL中腹横截面的纤维数量没有变化。（c-e）EDL的横截面积（CSA）增加，破伤风力成比例增加，导致比力没有变化。（f） C57成人组比目鱼肌的纤维类型分布没有改变，而C57新生儿组的IIB型纤维明显增多。数据表示平均值±标准偏差。*与对照组相比，具有统计学意义，p<0.05。

为了阐明肌肉生长抑制素在比目鱼肌中的抑制作用，对C57 Bl/6组的纤维类型分布进行了评估。在C57成人组中，dnMstat对比目鱼肌纤维类型没有影响( 图3F ). 然而，C57新生儿组出现了向更快纤维类型的转变，因为10%的治疗肌纤维为MHC IIB型，而对照肌中未检测到IIB型纤维。

这个中密度纤维板与年龄匹配的对照组相比，过度表达dnMstat的组显示体重和所有肌肉的湿重增加( 图4A、C、D ). 肢体骨骼肌尺寸的增加与先前描述的肌抑制素抑制方法相当[3],[13],[14]。在中密度纤维板4H组，治疗组动物胫骨前肌、腓肠肌和股四头肌的重量分别比对照组大38%、34%和46%( 图4C ). 这些肌肉中观察到的肌肉质量增加持续到11个月大中密度纤维板11H组。而中密度纤维板11L和中密度纤维板11H肌肉重量在统计学上没有差异，两者都大于对照肌肉重量，并且当肌抑制素抑制在一个月大时开始时，肌肉生长量有显著的增加趋势(中密度纤维板11H）与新生儿期相比(中密度纤维板11升）( 图4D ). 治疗后的心脏重量中密度纤维板小鼠在中密度纤维板4H组和22-42%中密度纤维板11L和11H组( 图4C、D ). 心脏/体重比（mg/g）在中密度纤维板4H组（4±0.1 vs 4±0.3）。在11个月大的组中，对照组中密度纤维板小鼠的心/体重比为4.72±0.1，与中密度纤维板11H组（4.6±0.1）。这个中密度纤维板11L组的比率为4.2±0.1，低于对照组。这很可能是因为这组人体重的增加速度略快于心脏重量的增加。

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图4

肌肉抑制素抑制对大鼠体重、血清肌酸激酶和肌肉重量的影响中密度纤维板老鼠。

（a） 所有dnMstat治疗组的体重都有所增加。（b） 血清肌酸激酶（CK）在中密度纤维板4H组与四个月大婴儿的比较中密度纤维板对照组（4C），但在中密度纤维板11L和中密度纤维板11H组与11个月大的婴儿相比中密度纤维板控件（11C）。（c） 在中密度纤维板4H组，dnMstat过度表达增加了胫骨前肌（TA）、腓肠肌（GAS）四头肌（QUAD）和心脏的湿重。（d） 在11个月大的时候中密度纤维板11L和11H组，这些肌肉的重量继续增加。（e）中密度纤维板肌抑制素C末端的4H股四头肌和作为负荷控制的β-肌动蛋白显示，治疗肌肉中成熟的肌抑制蛋白C二聚体增加。显示了具有代表性的条带。数据表示平均值±标准偏差。*与对照组相比，具有统计学意义，p<0.05。

血清肌酸激酶（CK）是衡量全身骨骼肌状况的指标。在中密度纤维板患有Duchenne肌营养不良症的小鼠和人类缺乏肌营养不良蛋白会导致肌膜损伤和膜通透性增加，从而升高血清CK。肌抑制素抑制导致血清CK水平显著降低中密度纤维板4H组与年龄匹配的对照组比较中密度纤维板水平( 图4B )；然而，血清CK水平在中密度纤维板11L和11H组与11个月大的对照组无差异中密度纤维板水平。

采用免疫组织化学方法测量肌纤维的横截面积（CSA），并评估EDL、比目鱼肌和膈肌纤维的肌球蛋白重链（MHC）组成中密度纤维板组。选择这些骨骼肌进行分析，以确定不同纤维类型和疾病进展的肌肉组对肌抑制素抑制的反应是否不同。EDL代表一种典型的“快速”肌肉类型，主要由快速糖酵解MHC型IIB纤维组成，比目鱼肌代表一种原型的“慢速”肌类型，富含慢速氧化MHC型I纤维。横膈膜含有混合纤维型分布，是位于中密度纤维板人类疾病最具代表性的模型[24]两个肢体肌肉的肌纤维大小都有所增加，但纤维数量没有变化中密度纤维板11H组，未肥大( 图5 , 6 ). 根据MHC类型进一步对纤维大小进行分类，以确定哪种纤维类型的人群能够解释观察到的总体肥大。先前的研究发现肌抑制素优先作用于快纤维类型，与此一致，EDL中IIA和IIB型纤维的平均CSA增加，而比目鱼肌中仅IIA型纤维的CSA增加( 图5A、B 和 6A、B ). EDL在中密度纤维板4H组和19%以上的IIB型光纤中密度纤维板11H组( 图5D ). 同样，比目鱼肌的IIB型纤维在中密度纤维板4H组和20%以上的IIA型光纤中密度纤维板11H组( 图6D ). 在两个肢体肌肉中中密度纤维板11L和中密度纤维板11H组。在两个终点，隔膜纤维大小分布或矢状纤维数量没有差异( 图7A、B、C ). 隔膜中IIx型纤维增加，IIA型纤维减少中密度纤维板4H组，而长期组的纤维类型组成没有差异( 图7D ). 这个中密度纤维板通过Masson三色染色进一步分析11H膈肌，以评估结缔组织浸润的程度。如所示图7E，由于dnMstat的长期过度表达，膈肌纤维化区域的比例没有改变。

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图5

形态分析中密度纤维板老挝国家电力公司。

（a） 在中密度纤维板4H组，肌球蛋白重链（MHC）IIA型和IIB型纤维的平均纤维尺寸增加，导致总纤维尺寸总体增加。（b） 在11个月大的时候中密度纤维板与对照组相比，11H组未显示纤维类型或总纤维的纤维尺寸差异。（c） 所有治疗组EDL中腹横截面的纤维数量与相应的对照组无差异。（d） 在中密度纤维板4H组中密度纤维板11L和11H组IIB型纤维增加16-19%。数据表示平均值±标准偏差。*与对照组相比具有统计学意义，p<0.05。

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图6

形态分析中密度纤维板比目鱼。

在四个月（a）和十一个月（b）的时间点，肌抑制素抑制并没有改变I型纤维的平均纤维尺寸，但确实增加了IIA型肌球蛋白重链（MHC）的平均纤维大小和总纤维。（c） dnMstat的过度表达并没有改变比目鱼肌中腹横截面的纤维数量。（d） 在中密度纤维板4H组IIB型纤维的百分比从4%增加到14%。在11个月大时，实验组的IIB纤维百分比没有显著差异。然而中密度纤维板11L和中密度纤维板11H比目鱼肌含有20–21%的IIA型纤维。数据表示平均值±标准偏差。*与对照组相比，具有统计学意义，p<0.05。

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图7

形态特性和力的产生中密度纤维板膈膜。

（a，b）肌抑制素抑制未改变纤维大小分布中密度纤维板4H和中密度纤维板11H组。（c） 横膈膜矢状面上的纤维数量（测量膈膜纤维数量）在任一时间点都没有变化。（d） 在中密度纤维板4H隔膜中IIX型纤维较多，IIA型纤维较少。在中密度纤维板11H组。（e） Masson三色染色的横膈膜切片显示中密度纤维板11H膜片与控制装置（11C）相比。（f） dnMstat的过度表达并没有改善隔膜中的比力产生。数据表示平均值±标准偏差。*与对照组相比，具有统计学意义，p<0.05。比例尺：50µm。

评估EDL、比目鱼肌和膈肌的功能，以确定dnMstat的过度表达是否增强了肌肉力量。这个中密度纤维板与增加的CSA相比，4H EDL显示出增加的绝对破伤风力产生，导致根据CSA标准化的力没有变化（比力）( 表2 ). 相比之下中密度纤维板4H比目鱼肌产生的强直力增加55%，比力增加66%，而横膈膜产生的力保持不变( 表3 , 图7E ). 这些数据表明，短期肌肉生长抑制素阻滞可提高肢体肌肉（比目鱼肌和EDL）的产力能力，但不能改善过度使用的膈肌。在11个月大时，比目鱼肌的绝对力和比力继续增加，并且在中密度纤维板11H组( 表3 ). 虽然CSA在中密度纤维板11L EDL，强直力产生量不变( 表2 ). EDL的绝对强度在中密度纤维板11H组，但比力下降了21%。这个中密度纤维板11H隔膜在作用力产生方面没有表现出任何差异( 图7E ). 因此，在长期组中，肌肉生长抑制素抑制仅导致比目鱼肌的力量产生显著改善。

为了研究肌肉生长抑制素和胰岛素样生长因子-I（IGF-I）之间的相互作用中密度纤维板4H组采用免疫印迹法检测肌抑制素，ELISA法检测IGF-I含量。治疗后的肌肉中成熟肌抑制素C-二聚体增加约60%( 图4E )而IGF-I含量没有差异（对照肌肉中的39ng/g与治疗肌肉中的34ng/g）。这一发现与IGF-I诱导肌抑制素表达的报道一致，但反之则不一致[25].

通过超声心动图测定肌抑制素抑制对营养不良心脏的功能作用。11个月龄的对照中密度纤维板检测心脏和股四头肌激活素IIB受体水平。这些组织中激活素IIB受体的蛋白质水平相似( 图8A ). 在治疗动物中观察到肌抑制素抑制剂剂量依赖性增加湿心重和平均心肌细胞CSA( 图4C、4D , 8B类 ). 在中密度纤维板11H组射血分数降低11%，左室游离壁增厚43%( 图8C ). dnMstat的长期表达也增加了左室舒张内径和收缩内径，这是扩张型心肌病固有的特征中密度纤维板在动物的生命周期中逐渐形成的小鼠模型[26],[27].

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图8

长期mdx小鼠的心脏特性。

（a） 激活素IIB受体的蛋白质水平在中密度纤维板心脏和股四头肌。（b） 心肌细胞平均横截面积（CSA）在中密度纤维板11L和11H组。（c） 超声心动图显示，在治疗动物中，舒张期左心室内径（LVIDd）增加，收缩期左心室外径（LVIDs）增加，左心室自由壁直径增加，射血分数降低。在中密度纤维板11L和11H组跨越所报告的参数。两组均与对照组有显著差异（11C）。数据代表平均值±标准差*与对照组相比，具有统计学意义，p<0.05。

讨论

通过AAV介导的肝脏新型肌抑制素抑制剂的表达持续抑制肌肉生长抑制素，导致正常和中密度纤维板老鼠。值得注意的是，肝脏分泌不仅会导致全身肌肉生长抑制素的抑制，而且还允许转基因长期稳定，这在骨骼肌输送中可能是不可能的。在新生儿中启动肌抑制素抑制中密度纤维板在注射一个月大的婴儿时，动物的循环dnMstat水平较低中密度纤维板动物导致更高水平( 图1E ). 抑制剂的剂量缩写为“L”（表示低剂量）和“H”（表示高剂量），之前是分析时动物的年龄。在抑制剂剂量依赖性的方式下中密度纤维板11L和11H组。我们研究中的骨骼肌质量增加与服用肌抑制素中和抗体或前肽相当，超过了之前关于AAV介导的系统性肌抑制酶抑制的研究，接近在中密度纤维板/肌抑制素基因敲除转基因小鼠[3],[13],[14],[28].

由于证据表明肌抑制素对卫星细胞和成年纤维都有作用，因此肌肉质量增加可能是通过现有肌纤维的肥大或新纤维的形成（增生）引起的。在以往的研究中，基因靶向性肌抑制素的缺失促进了骨骼肌的肥大和增生，而出生后对肌抑制蛋白的抑制只会导致肥大。肌肉质量增加的双重机制在中密度纤维板小鼠终身与肌抑制素阴性小鼠杂交[7]在当前的研究中，在所有检查的肌肉中，肌肉生长是由于肥大而不是增生。这一发现支持了这样一种观点，即产前缺乏肌肉生长抑制素会导致骨骼肌肥大和增生，而产后抑制肌肉生长抑制素主要通过肥大促进肌肉生长[29]——[31].

基因敲除动物中肌抑制素的缺乏使比目鱼肌和EDL的纤维型成分偏向更快的MHC亚型[32]然而，当对两个月大的严重联合免疫缺陷小鼠注射抗肌生成抑制素抗体或对四个月大小鼠使用Cre-LoxP系统对肌生成抑素进行出生后灭活时，比目鱼肌和EDL的MHC谱没有变化[29],[32]因此，这是第一份关于肌抑制素抑制导致出生后骨骼肌MHC含量改变的报告。我们对C57 Bl/6动物的研究结果与之前的报告之间存在差异的原因可能是由于抑制剂形式的功效或启动肌抑制素抑制时动物的年龄。值得注意的是，C57新生儿组比目鱼肌中MHC亚型向更快的方向转变，而C57成人组则没有。这些结果表明，在三个月大之前有一个肌肉发育的关键时期，在此期间，肌肉生长抑制素可以调节出生后的纤维规格。

1个月大的婴儿的纤维类型中密度纤维板比目鱼肌发现30%的I型纤维和70%的IIA型纤维，这与以前的报告一致[33]——[35]一个月大时开始抑制肌生长抑制素时没有IIB型纤维，这表明肌生长抑素在纤维类型的规范中具有新的作用。与快速纤维类型的选择性生存优势不同，似乎存在向快速MHC亚型的主动转换，这可能是由作用于现有纤维的机制所介导的，因为纤维数量没有改变。这一过程的一个潜在媒介是存在大量活跃的卫星细胞群。C57 Bl/6动物出生后肌肉的快速生长部分是由卫星细胞与现有肌纤维的融合驱动的中密度纤维板动物在4-6周龄时有一个大规模的退化-再生阶段，随后在整个成年期内不断更换退化的纤维。新生C57小鼠及所有小鼠纤维类型转换的观察中密度纤维板动物提示激活的同源卫星细胞池可能有助于肌抑制素影响的纤维规格化过程。另一种可能性是，可能存在单独的“慢”和“快”卫星细胞亚群，而肌肉生长抑制素抑制对“快”亚群的选择性激活可能会使骨骼肌充满快纤维类型。或者，观察到的MHC亚型表达的变化可能是由于对肌肉纤维的直接作用，而不涉及卫星细胞。需要进一步的实验来阐明肌肉生长抑制素抑制引起正常骨骼肌纤维类型转换的机制和精确时间。

病毒注射一周后，对C57 Bl/6肌肉进行免疫印迹，发现信号改变与肌抑制素抑制一致。当生物活性形式的肌肉生长抑制素与激活素IIB受体结合时，细胞内信号级联导致Smad 2/3磷酸化。磷酸化Smad 2/3随后转移到细胞核，以抑制肌源性因子的表达和卫星细胞的细胞周期进展。肌肉大小的其他关键调节因子也参与了肌肉生长抑制素信号通路，如丝氨酸/苏氨酸激酶Akt和MAP激酶ERK、JNK和p38[25],[36]——[38]在过度表达dnMstat的C57 Bl/6小鼠中，磷酸化Smad 2/3的水平降低，这在与抗肌生长抑制素抗体孵育的C2C12细胞中可以看到[3]在我们的研究中，急性抑制C57 Bl/6动物后，JNK磷酸化降低，Akt磷酸化增加。与我们的观察结果一致的是，最近一项关于肌管肥大的研究发现，腺病毒过度表达肌抑制素前肽后，Akt磷酸化水平增加[39]这些变化表明，肌肉生长因肌肉生长抑制素抑制而部分由Smad 2/3、Akt和JNK信号通路介导，表明肌肉生长抑素在功能上受到dnMstat的抑制。治疗后肌肉中未改变的IGF-I含量支持通过抑制肌肉生长抑制素而非增加IGF-I实现Akt磷酸化增加的机制。此外，治疗后肌肉中激活的myostatin的增加表明，在myostatinsignaling受到抑制的情况下，可能存在补偿性上调和/或局部激活myostatins的增加，以取代阻断作用。肌生成抑制素的上调可能通过阻断肌生成抑素信号激活的Smad7依赖性自身调节环介导[40]，但这一点在当前的研究中没有得到解决。

在中密度纤维板动物肌肉生长抑制素抑制在短期内对增加肌肉大小和力量极为有效，但长期分析结果好坏参半。以前的研究使用了针对肌抑制素的抗体、前肽注射或AAV介导的抑制剂过度表达，证明在幼年动物（1-3个月大）中抑制肌抑制酶3-4个月后，肌肉质量和绝对力增加[3],[13],[14].我们对中密度纤维板四个月大的动物在抑制肌肉生长抑制素三个月后与之前公布的数据一致。所检查的所有骨骼肌的质量都有所增加，比目鱼肌和EDL都表现出力量产生的增加。然而，在10–11个月的dnMstat表达后，肌肉生长抑制素抑制并未导致膈肌或EDL的功能受益。这意味着肌肉抑制素抑制，因为单一疗法不足以减轻受影响最严重的骨骼肌的营养不良变化。在中密度纤维板11H组与对照组相比，接受治疗的膈肌产生的力和肌纤维替代物相等( 图7 ). 由于小鼠膈肌的利用率高于四肢肌肉，因此显示出早期退化变化，收缩功能逐渐丧失，胶原蛋白含量是其他骨骼肌的十倍[24].以往的长期研究中密度纤维板肌抑制素信号减少的膈肌已经报道了一些组织学上的益处，但尚未显示功能改善[7],[15]。虽然中密度纤维板/Mstat KO膈膜在较迟的时间点（18个月大）显示出组织病理学的改善，但尚不清楚明显的组织学改善是否与功能增强相关，以及这种改变是否可能发生在基因敲除动物之外。因此，虽然长期抑制肌肉生长抑制素可以改善轻度营养不良，如中密度纤维板肢体肌肉，它不能充分促进肌肉生长并降低肌肉成纤维细胞活性，以补偿严重的营养不良，如中密度纤维板膈膜。

慢收缩比目鱼肌和快收缩EDL肌的功能分析揭示了长期肌抑制素抑制的不同作用。比目鱼肌含有更能代表人类骨骼肌的纤维类型，因此观察到长期组维持的比力增加是一个令人鼓舞的临床结果。这一结果可能归因于纤维类型向更快的MHC亚型转变。然而，尚不清楚人类骨骼肌是否会以同样的方式移动。11个月大的时候中密度纤维板11H EDL降低了比力生产。这些发现与肌抑制素基因敲除小鼠类似，后者显示EDL的比力降低，但比目鱼肌的比力没有降低[41],[42]EDL中比力输出减少的确切病因目前尚不清楚。肌抑制素敲除EDL的异常记录，如每根纤维的线粒体数量减少[41]，不足以解释特定兵力生产的下降。肌抑制素基因敲除小鼠TGF-β/Smad信号通路的调节或长期抑制中密度纤维板小鼠导致EDL的比张力降低，而EDL的治疗效用值得怀疑[41]这种效应似乎仅限于快速纤维类型，因为比目鱼肌在中密度纤维板组。还需要进一步的实验来确定肌抑制素阻滞导致的纤维类型依赖性受损力产生的机制。

小鼠对肌生长抑制素抑制反应中I型纤维肥大的缺乏预示着，在人类中，无论形式如何，仅阻断肌生长抑素的治疗将远不如临床前小鼠研究中的有效。与啮齿动物相比，人类骨骼肌的快速纤维要少得多，主要由缓慢纤维组成。例如，人类比目鱼肌完全由I型纤维组成，而小鼠比目鱼肌肉约由60%的IIA纤维和40%的I纤维组成[43]重要的是，人类运动骨骼肌不含IIB型纤维[44]IIB型纤维含有最高密度的激活素IIB受体、内源性肌抑素启动子活性和正常肌肉中肌抑素的表达[42],[45]因此，IIB型纤维可能对肌抑制素介导的信号传导最敏感。在本研究中，我们证明，在比目鱼肌和EDL中，IIA纤维也会因肌抑制素抑制而肥大。这种作用对人类治疗至关重要，因为随着纤维类型向更快的MHC同种型转变，IIA纤维的肥大可能导致力量产生增加，尽管几乎没有对肌肉生长抑制素抑制最敏感的纤维类型。

必须确定肌抑制素抑制对营养不良心脏的安全性，因为心肌病在杜氏肌营养不良患者18岁时几乎普遍存在[46]以前有报道称，肌肉生长抑制素基因敲除动物或中密度纤维板/Mstat KO转基因[47],[48]解决这一问题的研究要么是短期的，要么是依赖于临床相关性有限的基因杂交。Wagner等人交叉中密度纤维板肌肉生长抑制素基因敲除的动物，在24个月龄时未观察到心脏大小或功能参数的任何变化中密度纤维板/Mstat KO动物[48]然而中密度纤维板本研究中的小鼠在24个月龄时没有出现扩张型心肌病中密度纤维板在功能参数方面，小鼠与正常C57 Bl/6对照组无明显区别。老年人无扩张型心肌病中密度纤维板小鼠与其他研究形成对比，在这些研究中，超声心动图变化提示扩张型心肌病首次出现在9-11个月大时，并且在21个月大的时候，射血分数严重下降至35%[26],[27],[49],[50]在我们的研究中，肌肉生长抑制素抑制对正常动物的心脏重量没有影响。然而在治疗中中密度纤维板动物在四个月大时心脏重量增加20%，在十一个月大的时候心脏重量增加40%。心脏重量增加不太可能仅仅是因为体型与体重成比例增加。Barton等人检查中密度纤维板仅在骨骼肌中过度表达IGF-I阳性生长因子的小鼠，无全身影响[12]在本研究中，在不改变心脏重量的情况下，观察到骨骼肌质量和体重增加。

而肌抑制素抑制对扩张型心肌病进展的影响中密度纤维板小鼠或更严重的营养不良型心肌病尚不清楚，在实施以肌抑制素为基础的治疗包括心脏受累在内的疾病之前，有必要进行进一步的研究。心脏大小或功能的差异中密度纤维板由于肌抑制素抑制或短期治疗方案的效果较差，以前可能没有观察到肌抑制蛋白抑制后的模型[3],[13],[14]观察到的心脏肥大的一种可能机制是通过激活素IIB受体减少肌肉抑制素信号传导，激活素IIB受体在心脏中的表达水平与骨骼肌相似( 图8A ). 先前关于肌抑制素参与心脏重塑的报道包括绵羊心脏梗死区边缘心肌细胞和容量超负荷大鼠心脏左心室肌抑制蛋白的上调[51],[52]这些数据表明，虽然肌抑制素不参与调节正常心脏中的心肌细胞大小，但它可能是触发心脏重塑的病理条件下心肌细胞大小的重要负调控因子。在这些情况下，肌抑制素信号的丢失可能会导致心肌细胞肥大加速，并最终进展为心力衰竭。需要进一步的研究来确定观察到的心脏质量和功能的变化是如何随时间演变的。

与先前旨在抑制肌肉生长抑制素的实验方法相比，肝脏介导的dnMstat过度表达具有几个重要优势。一项使用针对肌抑制素的中和抗体的临床试验没有改善成年肌营养不良患者的肌肉功能或增加肌肉质量[53]如果在临床实践中实施，任何涉及注射蛋白质抑制剂（如抗体）的方法，肌肉生长抑制素前肽或可溶性激活素IIB受体需要终身治疗，而使用基于AAV的抑制剂输送到肝脏只需要单次注射即可实现高水平的持续转基因表达。由于除单点突变外，dnMstat与内源性前肽相同，因此对转基因产物进行免疫识别的可能性有限。此外，有证据表明肝脏的生产和分泌可能会诱导对外来肽的耐受[54]激活素IIB受体方法和其他非肌生长抑制素特异性结合蛋白（如卵泡抑制素）的临床适用性可能有限，因为激活素ⅡB受体的广泛组织分布可能会损害多器官系统中的TGF-β信号传导[55].

肝脏转导也避免了直接转导营养不良肌肉的技术障碍，并提供了治疗性转基因的无限期系统传递。除了在大型动物模型和人类中向整个肌肉组织转移基因的固有困难外，AAV在没有膜稳定的情况下长期转导营养不良肌肉是不可行的（E.R.Barton和H.L.Sweeney未发表的观察结果，[20],[21]). 这一观察结果与一份描述肌肉注射AAV 2/1超过两年后肌肉生长抑制素抑制的报告相反[15]然而，没有证据表明在研究终点的循环或肌肉中存在转基因。另一种可能性是，由于本研究中使用的启动子尚未确定，因此除了短期肢体肌肉转导外，还转导了肝脏。

我们的方法可以通过改造适合物种的转基因转化为更大的动物。Duchenne型肌营养不良症的犬模型比中密度纤维板AAV在血友病B犬模型中成功地治疗性转导小鼠和肝脏[56]——[59]与dnMstat相比，营养不良犬可能是一种更能预测人类可能疗效的指标中密度纤维板鼠标。即使当抑制剂的血清水平在中密度纤维板11L组，骨骼肌质量和纤维类型转换显著增加。通过肝靶向基因转移抑制肌肉生长抑制素对未来的基因治疗研究具有高度适应性，并有可能在大型动物模型中减轻肌营养不良。

方法

脚注

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