MeCP2控制促进肌成纤维细胞转分化和纤维化的表观遗传途径

摘要

介绍

肌成纤维细胞对于伤口修复是充分和必要的；它们在早期出现在受损组织中，刺激伤口收缩和形成临时疤痕（肉芽组织），从而防止感染和进一步损伤¹慢性损伤中肌成纤维细胞的持续存在和增殖与富含胶原蛋白的细胞外基质（ECM）的进行性沉积有关，从而导致组织纤维化。组织内稳态的这一基本作用需要对肌成纤维细胞的生成、功能和命运有更好的了解。肌成纤维细胞在正常组织中不存在，但在损伤时出现，这是由于常驻成纤维细胞、上皮细胞和周细胞的刺激/转分化所致²尽管细胞来源不同，肌成纤维细胞转分化产生类似的表型，包括从头开始平滑肌α-肌动蛋白（α-SMA）的表达和促纤维化生长因子TGFβ1的分泌。此外，细胞会分泌大量的I型和III型胶原蛋白和胶原酶抑制剂，即金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP-1），两者结合可促进交联成纤维胶原蛋白的净沉积^三因此，肌成纤维细胞转分化是一个高度保守的生理过程，必须严格调节以确保有限和可控的瘢痕形成。

肌成纤维细胞转分化是由数百个不同基因的表达变化所支持的，这些基因结合在一起形成肌成纤维母细胞表观基因组。虽然已经确定了许多候选转录因子，但触发和协调肌成纤维细胞表观基因组重编程的早期调控事件尚不清楚。我们最近描述了DNA（CpG）甲基化作为表观基因组中驱动转分化的全球变化的蓝蛋白的作用⁴甲基化CpG作为转录抑制和沉默的信号。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）基因的转录沉默是肝星状细胞（HSC）转化为肌成纤维细胞所必需的^5,6PPARγ表达与静止HSC（qHSC）的成脂特性相关，必须沉默细胞才能采用其成肌纤维细胞特性。肝肌成纤维细胞中PPARγ的强制过表达导致转分化逆转，I型胶原下调，增殖丧失，并重新获得其成脂特性。据报道，肺成纤维细胞也有类似的数据，其中组成性活性PPARγ蛋白的表达抑制了TGFβ1诱导肌纤维母细胞特性的能力，包括I型胶原的表达⁷TGFβ1刺激眼成纤维细胞的肌成纤维细胞转化也被腺病毒介导的PPARγ的过度表达所阻止⁸PPARγ激动剂还可以部分逆转间变性甲状腺癌细胞的上皮-间充质转化（EMT）⁹综上所述，这些研究表明PPARγ在不同来源和表型细胞的转分化中具有关键的调节作用。因此，我们推断，研究PPARγ转录沉默在HSC中是如何调节的，将有助于发现新的和关键的纤维生成表观遗传调控因子。

基因沉默可以通过至少三种表观遗传学机制实现；DNA甲基化与甲基-CpG结合蛋白的活性；通过向核心组蛋白的赖氨酸和精氨酸尾部添加或移除乙酰基和甲基的酶重塑组蛋白代码；和microRNA的作用¹⁰在这里，我们描述了这三种机制是如何结合起来产生一种多组分表观遗传中继途径，以调节肝肌成纤维细胞中PPARγ转录的抑制。此外，通过破坏两个关键成分的活性，甲基-CpG结合蛋白2（MeCP2）和组蛋白甲基转移酶EZH2^11,12，我们提供体外和体内有证据表明表观遗传继电器在控制肌成纤维细胞表型和肝纤维化方面具有更广泛的功能。

方法

结果

培养诱导的HSC转分化与95%以上的PPARγ转录物丢失相关(图1a)根据交联ChIP测定，拉长RNA聚合酶II（P-Ser²-PPARγ基因的RNAP）(图1b). 这些转录变化与甲基-CpG结合蛋白MeCP2向PPARγ基因的启动子和外显子A1和A2的募集相一致(图1c)由甲基化CpG岛跨越(补充图1和2). MeCP2是一种强大的基因转录表观遗传阻遏物¹³因此，我们研究了它在肌成纤维细胞转分化过程中控制PPARγ表达沉默的可能性。肌成纤维细胞中MeCP2的siRNA敲除(图1d)导致PPARγ转录表达升高(图1e). 此外，在MeCP2缺陷小鼠肌成纤维细胞中观察到PPARγmRNA表达增加5倍(机械2^-/年)与Wt相比(图1f). 我们之前证明MeCP2在正常肝脏中几乎检测不到表达，并且在受损肝脏的肌成纤维细胞中选择性诱导表达⁴.研究MeCP2的成纤维作用体内我们比较了Wt和机械2^-/年CCl反复损伤小鼠₄².无肝脏MeCP2(图2a)导致损伤肝脏中PPARγmRNA表达增加(图2b). PPARγ是I型胶原表达和肌成纤维细胞其他表型特征的负调节因子^5,6损伤后I型胶原（Col1a1）、TIMP-1和αSMA转录物的表达均降低机械2^-/年肝脏与Wt的比较(图2b). 天狼星红分析显示基质束在受伤Wt小鼠的肝血管上形成了纤维化组织桥(图2c，顶部面板）。相反，桥接性纤维化在机械2^-/年肝脏(图2c，底部面板）。纤维化的盲法组织病理学分级证实机械2^-/年Wt的平均评分为1.8分（轻度纤维化），而Wt的评分为3分（重度桥接纤维化）(图2d). 天狼星红染色面积的量化证实了机械2^-/年肝脏(图2e). Wt和机械2^-/年小鼠(补充图3)并且由于肝脏MeCP2的表达对肌成纤维细胞是选择性的⁴我们的结论是，MeCP2的缺失可以保护肝纤维化，因为它失去了对纤维化形成的影响，而不是对肝损伤机制的任何影响。肌成纤维细胞中PPARγ的强制过表达抑制I型胶原的表达并防止纤维化的发展¹⁴HSC衍生肌成纤维细胞对I型胶原表达的分析证实MeCP2缺失细胞中的表达水平较低(图2f). 纤维性反应减弱机械2^-/年因此，至少部分可以通过维持PPARγ的表达和抑制MeCP2缺陷的肌成纤维细胞的促成纤维特性来解释小鼠。然而，MeCP2也需要在转分化过程中抑制IκBα的表达，这对NF-κB依赖基因的表达至关重要⁴因此，MeCP2是与qHSC表型相关的多个基因转录沉默的协调器。

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图1

MeCP2调节肌成纤维细胞PPARγ的减少

(一)通过qRT-PCR定量大鼠qHSC和第10天转分化肌成纤维细胞的PPARγmRNA水平。(b条)将从大鼠HSC和肌成纤维细胞获得的100μg交联染色质与10μg抗RNAPolII磷酸化Ser2孵育；进行ChIP分析，扩增大鼠PPARγ外显子A2。(c（c）)使用10μg抗MeCP2抗体进行ChIP分析，如（1b）所示；qPCR扩增PPARγ外显子和启动子。(d日) 5×10⁶用2μg总siRNA电穿孔大鼠肌纤维母细胞，设计靶向大鼠MeCP2并通过western blot证实敲除。(e（电子）)从对照细胞或大鼠MeCP2 siRNA转染细胞中分离出总RNA，并用大鼠PPARγ特异性引物作为qRT-PCR反应的模板。p=0.0019(（f）)静态HSC从Wt C57Bl6或机械2^-/年小鼠与转分化体外持续14天。从细胞群体和PPARγmRNA中制备总RNA，通过qRT-PCR p=0.031进行量化。

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图2

MeCP2敲除减弱纤维生成

(一)从冷冻CCl中分离的200μg全细胞蛋白提取物₄受伤Wt或机械2^-/年用SDS-PAGE分离肝脏，将蛋白质转移到膜上，并对MeCP2进行免疫印迹。(b条)从冷冻CCl中分离出RNA₄受伤Wt或机械2^-/年肝脏，并使用小鼠PPARγ（p=0.0025）、I型胶原（p=0.036）、TIMP-1（p=0.03）和α-SMA（p=0.06）特异性引物进行qRT-PCR反应。(c（c）)CCl切片上的天狼星红免疫染色₄受伤Wt或机械2^-/年肝脏（×5倍放大）。(d日)来自5Wt和5Wt的天狼星红免疫染色切片机械2^-/年CCl公司₄根据Metavir量表（p=0.0015）和(e（电子）)通过形态计量学定量（p=0.0029）。5只动物的平均结果。(（f）)qHSC是从Wt或机械2^-/年肝脏与转分化体外持续14天。从两个细胞群体中制备总RNA，并使用小鼠胶原蛋白1特异性引物进行qRT-PCR（p=0.032）。

接下来我们研究了在肌成纤维细胞转分化过程中MeCP2的表达是如何被控制的。在qHSC中检测不到MeCP2蛋白（两者体外和体内（请参见补充图4体内数据），并通过转分化诱导⁴.在这里(图3a)我们发现，MeCP2蛋白表达在转分化的早期过渡期（培养第1天）被诱导，并且随着培养的每一天表达增加，当细胞完全转分化时达到高水平（第7天）。然而，在新分离的qHSC中检测到MeCP2转录物(图3b)从对照肝脏分离的HSC和从BDL或CCl损伤的肝脏分离的HSC中检测到类似水平的MeCP2 mRNA₄正在经历转分化(补充数据5a). 这些数据表明MeCP2在转分化过程中的转录后调控机制。克莱因等前面描述了microRNA miR132如何对MeCP2产生抑制作用¹⁵. The机械2该基因包含多个多聚腺苷酸化位点，并产生多个转录物，其3′UTR长度不同，从1.8kb到10kb不等¹⁵10kb转录本在大脑中占主导地位，与较短的转录本不同，它包括一些microRNA的识别元件，包括miR132，miR132也选择性地在大脑中富集¹⁵位于距离MeCP2转录物的翻译终止密码子1和8.5kb之间的引物分别用于短转录物和长转录物的RT-PCR检测。该分析表明，qHSC和肌成纤维细胞表达加长型MeCP2转录物，包括miR132结合位点(图3c). qRT-PCR分析证实从对照组、BDL和CCl分离的HSC中表达的长转录物水平相似₄受伤的肝脏(补充图5b). 接下来我们发现MFB转分化伴随着miR132的90%以上的减少(图4a). 通过定量BDL-和CCl分离的HSC中的microRNA，证实了肝损伤期间肌成纤维细胞中miR132的表达缺失₄-大鼠肝脏损伤(图4b). miR132转染使肌成纤维细胞中microRNA的表达增加300倍(图4c)这与MeCP2蛋白的表达减少有关(图4d). 这种治疗也伴随着PPARγmRNA表达的增加(图4e). 我们得出结论，MeCP2和肌成纤维细胞表型在qHSC中受到miR132的负调控。

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图3

MeCP2在HSC中的表达

(一)用SDS-PAGE分离培养第1、2、3和7天从新鲜分离的HSC中提取的30μg全细胞提取物，并对MeCP2和β肌动蛋白进行免疫印迹。(b条)从qHSC（培养第0天）和肌成纤维细胞（培养第7天）分离的RNA用于MeCP2和β肌动蛋白或肌动蛋白的半定量RT-PCR分析(c（c）)或用短/长MeCP2转录物特异性引物进行询问。

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图4

miR132调节MeCP2的表达

(一)使用miRNeasy迷你试剂盒从大鼠qHSC和肌成纤维细胞中分离出微RNA，并使用miScript逆转录试剂盒进行逆转录。miR132通过miScript引物分析218300检测。(b条)从BDL（或假对照）和CCl后小鼠肝脏分离的HSC中纯化微RNA₄如上所述检测到（或橄榄控制）损伤和miR132。(c（c）到e（电子）) 5×10⁶将肌成纤维细胞与2μg miR132模拟或对照siRNA混合并电穿孔。48小时后采集细胞进行RNA和全细胞蛋白提取。(c（c）)通过miScript引物分析218300定量mIR132(d日)用SDS-PAGE分离全细胞蛋白提取物，并对MeCP2和β-肌动蛋白进行免疫印迹。(e（电子）)进一步将（b）中获得的cDNA用作PPARγ的qRT-PCR分析模板。(（f）)天然染色质由体外转分化Wt或机械2^-/年肌成纤维细胞。100μg天然染色质与10μg抗二甲基H3K27、H3K9或H3K4孵育，并进行ChIP分析。免疫沉淀DNA作为模板，使用小鼠PPARγ启动子特异性引物进行qPCR反应。

接下来，我们确定了MeCP2通过其控制PPARγ转录的下游调控事件。天然ChIP在PPARγ基因的5′端（启动子区）检测到MeCP2依赖的组蛋白甲基化特征(图4f). 甲基化H3K9¹⁶和H3K27^11,16是Wt肌成纤维细胞中PPARγ基因富集的抑制性染色质的特征；然而，这两个修改都在机械2^-/年肌成纤维细胞。相比之下，转录活性签名H3K4me2¹⁶在Wt肌成纤维细胞中几乎不存在，但在机械2^-/年细胞。因此，MeCP2必须在PPARγ染色质处协调多个表观遗传事件。以前有报道称，MeCP2促进H3K9甲基化，并且该抑制标记招募转录阻遏物HP1α¹⁷通过PPARγ基因的ChIP分析证实，HP1α选择性地被招募到启动子和外显子A1和A2(图5a)这与MeCP2的绑定模式一致，如图1c由于HP1α选择性地被招募到肌成纤维细胞中PPARγ基因的5′区，并且qHSC中的基因中没有HP1α，因此我们得出结论，H3K9的MeCP2依赖甲基化招募HP1α。HP1α主要与异染色质DNA相关，但也在常染色质位点发现，与转录抑制基因相关，在那里它促进抑制染色质结构^17,18因此，MeCP2调节PPARγ转录沉默的一种机制是在PPARγ基因的5′区将HP1α募集到甲基化的H3K9。

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图5

MeCP2调节HP1α募集、EZH2和H3K27甲基化的表达

(一)将100μg来自大鼠肌成纤维细胞的交联染色质与10μg抗HP1α孵育，并进行ChIP分析。免疫沉淀DNA作为模板，使用大鼠基因中PPARγ启动子/外显子特异性引物进行qPCR反应。(b条)将从大鼠HSC或肌成纤维细胞制备的100μg天然染色质与10μg抗二甲基H3K27（顶部）或抗三甲基H3K4（底部）孵育，并进行ChIP分析。免疫沉淀DNA作为模板，使用大鼠PPARγ启动子/外显子特异性引物进行qPCR反应(c（c）)用SDS-PAGE分离培养第1、2、3和7天从新鲜分离的HSC或肌成纤维细胞中提取的30μg全细胞提取物，并对EZH2和β肌动蛋白进行免疫印迹。（d） 使用从BDL（或假手术）和CCl分离的HSC提取的RNA对EZH2 mRNA进行qRT-PCR分析₄（或橄榄油）损伤大鼠肝脏（n=5）（p=0.0184）。(e（电子）)从用2μg对照或MeCP2-siRNA转染的肌成纤维细胞中分离的RNA（来自图1e)用于EZH2的qRT-PCR分析（p=0.0152）(（f）)来自Wt或机械2^-/年肌成纤维细胞（来自图1f）用于EZH2表达的qRT-PCR分析（p=0.0478）。

观察到H3K27的甲基化在机械2^-/年迄今为止，肌成纤维细胞引起了人们的兴趣，MeCP2和这种组蛋白修饰之间没有已知的联系。为了更详细地研究MeCP2和H3K27甲基化之间的关系，我们使用高分辨率ChIP来确定H3K17的甲基化是否发生在与染色质结合的MeCP2相关的PPARγ基因区域。这包括在IP之前用单球菌核酸酶消化染色质以生成单核小体（约覆盖146个核苷酸），然后使用A1、A2和下游外显子的特异引物进行qPCR。在qHSC中PPARγ基因处几乎没有检测到H3K27甲基化（H3K27me2）。在肌成纤维细胞中，在外显子A1和A2处检测到低水平的H3K27me2，然而，外显子1、2和5处肌肉成纤维细胞的修饰尤其丰富(图5b). 值得注意的是，H3K4三甲基化（H3K4me3）是转录活性染色质的标记，在qHSC的外显子1和内含子1处富集，但在肌成纤维细胞中缺失，证实转分化涉及活性和抑制性表观遗传特征的协调调节(图5b). 由于MeCP2与PPARγ基因5′端外显子A2下游的外显子无关(图1c)它不太可能直接导致外显子1、2或5的H3K27甲基化。H3K27的甲基化由进化保守的Polycomb阻遏物复合物2（PRC2）及其组成成分H3K27-甲基转移酶EZH2特异性介导^11,19EZH2蛋白表达在qHSC中缺失，并通过转分化诱导，尽管（培养第3天）晚于MeCP2(图5c). 在HSC体内对BDL和CCl的转分化反应中也诱导了EZH2 mRNA₄受伤(图5d). 与对照培养物相比，siRNA缺失MeCP2的细胞表达的EZH2水平较低(图5e). 我们还检测到EZH2转录表达在机械2^-/年肌成纤维细胞与Wt细胞的比较。这些结果揭示了MeCP2作为EZH2表达阳性调节物的意外作用，并为MeCP2如何刺激H3K27甲基化提供了解释。最近对神经元的研究表明，MeCP2可以作为一组基因的转录激活剂，这些基因包括生长抑素、阿片受体kappa 1、胍基乙酸甲基转移酶和G蛋白调节的神经突起生长诱导剂1²⁰.

为了提供直接证据证明EZH2是PPARγ基因转录的调节器，我们采用siRNA-介导的敲除来实现肌成纤维细胞EZH280%的缺失(图6a)，这导致PPARγ转录物的表达增加(图6b)I型胶原蛋白表达适度下降(补充图6). 当肌成纤维细胞被3去甲肾上腺素A处理时，也观察到类似的效果(图6c)耗尽EZH2细胞²¹此外，用3脱氧核苷A处理新鲜分离的静止肝星状细胞可完全防止转分化的形态学迹象(图6d)抑制α1（I）胶原和金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP-1）的诱导(图6e). 小鼠急性CCl期间EZH2抑制剂的给药₄损伤也抑制了I型胶原和TIMP-1的诱导，TIMP-1为体内HSC转分化与肝纤维化反应(图6f). 因此，EZH2是肌成纤维细胞PPARγ转录的负调控因子，但在促进肌成纤维细胞转分化和纤维化方面似乎也发挥着更广泛的调控作用。此外，刺激PPARγ基因下游外显子EZH2表达和随后H3K27甲基化被确定为MeCP2实现PPARγ转录沉默的第二种机制。PPARγ基因5′端H3K9甲基化和HP1α结合与下游外显子H3K27甲基化和PRC1募集的联合作用将阻止转录起始和延伸，这反映了抑制PPARγ表达对MTD和纤维化的生物学重要性。

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图6

EZH2调节PPARγ、肌成纤维细胞转分化和纤维生成

(一)和(b条) 5×10⁶用2μg对照或EZH2 siRNA电穿孔大鼠肌成纤维细胞。分离总RNA并用于EZH2-的qRT-PCR检测(一)或PPARγ（p=0.0012）(b条). (c（c）)肌成纤维细胞用1μM 3-二氮杂卓霉素A或载体处理72h；制备总RNA并用于PPARγ的qRT-PCR检测。(d日)将新鲜分离的大鼠HSC在标准培养基（底部显微照片）或含有1μM 3-二氮杂卓霉素A（顶部显微照片）的培养基中培养12小时，清洗培养物并用标准培养基替换，细胞再培养10天。(e（电子）)5c中获得的RNA用于I型胶原和TIMP-1的qRT-PCR检测。(（f）)CCl分离RNA中1型胶原和TIMP-1转录物的qRT-PCR分析₄对照组或小鼠的损伤肝脏用3-去甲肾上腺素A预处理1小时（n=4）。

讨论

肝脏经常接触各种毒素和有害微生物，因此，通过快速有效的创伤治疗反应来应对这些侮辱至关重要。与其他重要器官（如肾脏、胰腺、心脏和肺）相似，瘢痕形成或纤维化是肝脏对细胞损伤的重要保护反应。肝脏（和其他器官）中的主要成纤维细胞是肌成纤维细胞，它可以通过常驻分化细胞的转分化在损伤部位局部生成^1-三在慢性和进行性肝病的啮齿类动物模型中，选择性去除肝肌成纤维细胞可减轻纤维化，此外，细胞凋亡清除肌纤维细胞与纤维化的消退有关^2,22,23因此，肌成纤维细胞的生产和寿命都必须受到精细的控制机制的制约，以确保有一个可测量的创伤愈合反应。决定肌成纤维细胞存活和凋亡之间平衡的调控事件最近受到了大量关注²³相比之下，对调节肌成纤维细胞转分化的机制了解相对较少。在这里，我们描述了一种新的多步骤表观遗传中继网络，该网络用于控制受损肝脏中的转分化和纤维化(图7). 为了发现这一途径，我们使用了一种候选基因方法，重点研究PPARγ转录抑制的机制。这种方法的基本原理是基于这样一个事实，即PPARγ是MTD的抑制剂，必须沉默MTD才能使细胞获得肌纤维母细胞特性⁵首先发现表观遗传调节因子（MeCP2和EZH2）在转分化过程中负责PPARγ沉默，然后研究它们在肝损伤啮齿类动物模型中对纤维化的作用，我们已经确定了纤维化的重要表观遗传调控因子和用于慢性肝病治疗的新靶点。

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图7

mIR132、MeCP2和EZH2在调节表观遗传中继途径中运作，最终导致PPARγ转录抑制

在qHSC中，miR132对MeCP2转录物施加翻译阻断。转分化后，mIR132表达下调，使MeCP2蛋白能够翻译，并与PPARγ基因的5′端结合，从而促进H3K9甲基化和转录抑制因子HP1α的招募。此外，MeCP2刺激EZH2的表达，EZH2-甲基化H3K27，形成多梳阻遏物1复合物的结合位点，促进3′PPARγ外显子中的染色质凝聚。该途径的顶点是主抗纤维化基因PPARγ的转录抑制。

MeCP2因其在神经系统正常发育中作为转录阻遏物的作用而广为人知；基因突变机械2该基因与Rett综合征和其他形式的X连锁精神发育迟滞相关¹²除了在癌症中，MeCP2在神经系统之外的功能尚未被探索。我们的数据表明，MeCP2作为肝纤维化的关键调节器具有新的功能。两个关键观察结果支持这一概念。首先，MeCP2缺乏的小鼠因其对肝脏毒性损伤的纤维化反应而减弱。这一观察结果可能反映了MeCP2缺陷的肝星状细胞无法进行正常的转分化，保留PPARγ的表达，并表达水平降低的1型胶原。其次，肝脏MeCP2的表达仅限于肌成纤维细胞，并受到miR132抑制蛋白翻译的严格调控机制的制约。miR132仅作为MeCP2转录物的翻译阻遏物，其携带延伸的3′UTR，包括miR132识别基序，并被认为在神经元细胞中选择性表达。然而，我们的数据表明HSC也表达miR132-调控的MeCP2转录物。此外，miR132的表达随着转分化而丧失，当实验重建时，导致MeCP2蛋白表达减少和PPARγ转录物水平升高。越来越多的文献描述了HSC的各种神经样特征以及这些特征对肝脏创伤修复的贡献²⁴我们发现，HSC中的“神经元特异性”机制控制MeCP2扩大了相似性，并解释了MeCP2蛋白在肝脏肌成纤维细胞中的限制表达。确定肾脏、胰腺和呼吸系统的其他星状细胞^1,2还利用miR132/MeCP2控制机制来调节转分化。克莱因等据报道，miR132是通过涉及CREB磷酸化的CREB依赖性途径诱导的¹⁵值得注意的是，之前已经描述过诱导CREB磷酸化以抑制HSC衍生肌成纤维细胞的成纤维特性²⁵因此，CREB磷酸化可能通过诱导miR132抑制转分化。虽然我们描述了miR132在HSC转分化中的功能，但这一过程可能还受其他微RNA物种的控制。

对MeCP2抑制PPARγ转录的机制的调查显示，与基因沉默相关的组蛋白代码中至少有两种改变，即H3K9和H3K27甲基化。在MeCP2缺陷的肌成纤维细胞中，这两种修饰都减少了。MeCP2与H3K9甲基化的关联先前有报道，这是染色质沉默子HP1α补充的必要条件¹⁷与MeCP2选择性结合到PPARγ基因的相同5′区，并通过转分化诱导。因此，H3K9甲基化和HP1α的募集将在PPARγ启动子和外显子A1和A2中产生转录抑制的染色质结构，以抑制转录起始。一个意外的发现是，H3K27甲基化受到MeCP2的影响。由于H3K27甲基化在PPARγ的3′外显子中富集，这与MeCP2的结合不一致，表明存在间接调控机制。EZH2是唯一已知的H3K27甲基转移酶，我们通过siRNA和药理抑制证实EZH2-活性是PPARγ转录抑制所必需的。与MeCP2一样，EZH2在HSC中不表达，在转分化过程中被诱导。然而，EZH2的表达遵循MeCP2的早期诱导。后一个观察结果与我们发现的MeCP2缺失的肌成纤维细胞中EZH2水平降低相结合，表明MeCP2至少部分通过刺激EZH2的高水平表达来传递H3K27甲基化的信号。H3K27甲基化导致PRC1多囊复合物的募集，该复合物促进染色质凝聚，当在下游外显子中发现时，会抑制RNApol II转录物的延伸²⁶因此，MeCP2通过抑制转录起始（H3K9甲基化）和延伸（H3K27甲基化），发挥PPARγ转录（和转分化）的调节作用。

三种表观遗传调控因子（miR132、MeCP2和EZH2）在肌成纤维细胞转分化中的新功能的发现，对我们理解疾病肝脏的创伤愈合和纤维化控制具有重要意义。对于为什么纤维化只在少数慢性肝病患者中发生，遗传学研究仍没有明确的解释²⁷基因或环境对mIR132、MeCP2或EZH2的表达或活性的影响会减弱转分化，并对肌成纤维细胞的数量及其纤维生成分子的产生产生影响。如图所示，MeCP2或EZH2的表达与I型胶原和TIMP-1的表达之间存在明显的负相关。由于miR132的表达对影响纤维化的环境线索敏感，因此对其在人类肝病中的进一步研究将特别有趣²⁵此外，microRNAs可以通过雄性和雌性生殖系传播，并且可以影响表观遗传性状从一代到下一代的非孟德尔遗传²⁸.

最后，针对miR132-MeCP2-EZH2中继的治疗潜力应在慢性肝病的背景下进行探索，特别是因为这是一个对肌成纤维细胞具有选择性的调节网络。

补充材料

鸣谢

缩写

脚注

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